Erzeugung von Transgenics und Knockouts in Strongyloides-Spezies durch Mikroinjektion

Zusammenfassung

Das funktionelle genomische Toolkit für die parasitären Nematoden Strongyloides stercoralis und Strongyloides ratti umfasst Transgenese, CRISPR/Cas9-vermittelte Mutagenese und RNAi. Dieses Protokoll wird zeigen, wie intragonadale Mikroinjektion verwendet werden kann, um Transgene und CRISPR-Komponenten in S. stercoralis und S. ratti einzuführen.

Zusammenfassung

Die Gattung Strongyloides besteht aus mehreren Arten von hautdurchdringenden Nematoden mit unterschiedlichen Wirtsbereichen, darunter Strongyloides stercoralis und Strongyloides ratti. S. stercoralis ist ein menschlich-parasitärer, hautdurchdringender Nematod, der etwa 610 Millionen Menschen infiziert, während der Rattenparasit S. ratti eng mit S. stercoralis verwandt ist und oft als Labormodell für S. stercoralis verwendet wird. Sowohl S. stercoralis als auch S. ratti sind leicht für die Erzeugung von Transgenen und Knockouts durch die exogene Nukleinsäure-Abgabetechnik der intragonadalen Mikroinjektion zugänglich und haben sich als solche als Modellsysteme für andere parasitäre Helminthen herausgestellt, die dieser Technik noch nicht zugänglich sind.

Parasitäre Strongyloides-Erwachsene bewohnen den Dünndarm ihres Wirtes und setzen Nachkommen über den Kot in die Umwelt frei. Einmal in der Umwelt, entwickeln sich die Larven zu frei lebenden Erwachsenen, die im Kot leben und Nachkommen produzieren, die einen neuen Wirt finden und eindringen müssen. Diese Umweltgeneration ist einzigartig für die Strongyloides-Arten und ähnelt in der Morphologie so sehr der modellhaft freilebenden Nematode Caenorhabditis elegans, dass Techniken, die für C. elegans entwickelt wurden, für die Verwendung mit diesen parasitären Nematoden, einschließlich intragonadaler Mikroinjektion, angepasst werden können. Mit Hilfe der intragonadalen Mikroinjektion kann eine Vielzahl von Transgenen in Strongyloides eingeführt werden. CRISPR/Cas9-Komponenten können auch mikroinjiziert werden, um mutierte Strongyloides-Larven zu erzeugen. Hier wird die Technik der intragonadalen Mikroinjektion in Strongyloide , einschließlich der Vorbereitung freilebender Erwachsener, des Injektionsverfahrens und der Selektion transgener Nachkommen, beschrieben. Bilder von transgenen Strongyloides-Larven , die mit CRISPR/Cas9-Mutagenese erstellt wurden, sind enthalten. Ziel dieser Arbeit ist es, anderen Forschern die Möglichkeit zu geben, mit Hilfe der Mikroinjektion transgene und mutierte Strongyloide herzustellen.

Einleitung

Strongyloides stercoralis wurde lange Zeit als wichtiger menschlicher Krankheitserreger im Vergleich zu den weiter verbreiteten Hakenwürmern und dem Spulwurm Ascaris lumbricoides¹ übersehen. Frühere Studien zur Wurmbelastung unterschätzten die Prävalenz von S. stercoralis aufgrund der geringen Sensitivität gängiger Diagnosemethoden für S. stercoralis^oft stark 2. In den letzten Jahren haben epidemiologische Studien, die auf verbesserten diagnostischen Instrumenten basieren, geschätzt, dass die tatsächliche Prävalenz von S. stercoralis-Infektionen viel höher ist als zuvor berichtet, etwa 610 Millionen Menschen weltweit².

Sowohl S. stercoralis als auch andere Strongyloides-Arten, einschließlich des eng verwandten Rattenparasiten und des gemeinsamen Labormodells S. ratti, haben einen ungewöhnlichen Lebenszyklus, der für experimentelle genomische Studien von Vorteil ist, da er sowohl aus parasitären als auch aus freilebenden (Umwelt-) Generationen 3 besteht (Abbildung 1^). Insbesondere können sowohl S. stercoralis als auch S. ratti durch eine einzige frei lebende Generation durchlaufen. Die freilebende Generation besteht aus postparasitären Larven, die sich zu frei lebenden erwachsenen Männchen und Weibchen entwickeln; Alle Nachkommen der frei lebenden Erwachsenen entwickeln sich zu infektiösen Larven, die einen Wirt infizieren müssen, um den Lebenszyklus fortzusetzen. Darüber hinaus kann diese ökologische oder frei lebende Generation im Labor experimentell manipuliert werden. Da freilebende Strongyloides-Erwachsene und C. elegans-Erwachsene eine ähnliche Morphologie aufweisen, können Techniken wie die intragonadale Mikroinjektion, die ursprünglich für C. elegans entwickelt wurden, für die Verwendung mit freilebenden erwachsenen Strongyloides ^4,5 angepasst werden. Während DNA im Allgemeinen in frei lebende erwachsene Weibchen eingeführt wird, können sowohl Männer als auch Frauen von Strongyloides mikroinjiziert werden⁶. Somit stehen funktionelle genomische Werkzeuge zur Verfügung, um viele Aspekte der Biologie von Strongyloides zu untersuchen. Anderen parasitären Nematoden fehlt eine frei lebende Generation und sie sind daher nicht so leicht für funktionelle genomische Techniken^{geeignet 3}.

Abbildung 1: Der Lebenszyklus von Strongyloides stercoralis. Die parasitären Weibchen von S. stercoralis bewohnen den Dünndarm ihrer Säugetierwirte (Menschen, nichtmenschliche Primaten, Hunde). Die parasitären Weibchen vermehren sich durch Parthenogenese und legen Eier in den Dünndarm. Die Eier schlüpfen, während sie sich noch im Inneren des Wirts befinden, zu postparasitären Larven, die dann mit Kot in die Umwelt gelangen. Wenn die postparasitären Larven männlich sind, entwickeln sie sich zu frei lebenden erwachsenen Männchen. Wenn die postparasitären Larven weiblich sind, können sie sich entweder zu frei lebenden erwachsenen Weibchen (indirekte Entwicklung) oder zu infektiösen Larven im dritten Stadium (iL3s; direkte Entwicklung) entwickeln. Die frei lebenden Männchen und Weibchen vermehren sich sexuell, um Nachkommen zu schaffen, die gezwungen sind, iL3s zu werden. Unter bestimmten Bedingungen kann S. stercoralis auch einer Autoinfektion unterzogen werden, bei der einige der postparasitären Larven im Darm des Wirts verbleiben, anstatt im Kot in die Umwelt überzugehen. Diese Larven können sich im Inneren des Wirts zu autoinfektiösen Larven (L3a) entwickeln, durch die Darmwand eindringen, durch den Körper wandern und schließlich in den Darm zurückkehren, um reproduktive Erwachsene zu werden. Der Lebenszyklus von S. ratti ist ähnlich, außer dass S. ratti Ratten infiziert und keinen autoinfektiösen Zyklus hat. Die Umweltgenerierung ist der Schlüssel zur Verwendung von Strongyloides-Arten für genetische Studien. Die frei lebenden erwachsenen Weibchen (P₀) können mikroinjiziert werden; ihre Nachkommen, die alle zu iL3s werden, sind die potenziellen F 1-Transgenen. Diese Figur wurde von Castelletto et al. modifiziert. ³. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

S. stercoralis teilt viele Aspekte seiner Biologie mit anderen gastrointestinalen menschlich-parasitären Nematoden, einschließlich Wirtsinvasion und Wirtsimmunmodulation. Zum Beispiel infizieren sich auch humanparasitäre Hakenwürmer der Gattungen Necator und Ancylostoma durch Hautpenetration, navigieren ähnlich durch den Körper und leben schließlich als parasitäre Erwachsene im^{Dünndarm 7}. Daher verwenden viele gastrointestinale Nematoden wahrscheinlich gängige sensorische Verhaltensweisen und Immunevasionstechniken. Infolgedessen wird das aus Strongyloides gewonnene Wissen die Ergebnisse anderer weniger genetisch beherrschbarer Nematoden ergänzen und zu einem vollständigeren Verständnis dieser komplexen und wichtigen Parasiten führen.

Dieses Mikroinjektionsprotokoll beschreibt die Methode zur Einführung von DNA in Strongyloides freilebende erwachsene Frauen, um transgene und mutierte Nachkommen herzustellen. Die Anforderungen an die Aufrechterhaltung des Stammes, einschließlich des Entwicklungszeitpunkts von erwachsenen Würmern für Mikroinjektionen und der Sammlung transgener Nachkommen, werden beschrieben. Protokolle und eine Demonstration der vollständigen Mikroinjektionstechnik sowie Protokolle für die Kultivierung und das Screening transgener Nachkommen sind enthalten, zusammen mit einer Liste aller notwendigen Geräte und Verbrauchsmaterialien.

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Protokoll

HINWEIS: Rennmäuse wurden an die Passage S. stercoralis und die Ratten an die Passage S. ratti gewöhnt. Alle Verfahren wurden vom UCLA Office of Animal Research Oversight (Protokoll Nr. 2011-060-21A) genehmigt, das sich an die AAALAC-Standards und den Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren hält. Die folgenden Aufgaben müssen mindestens einen Tag vor der Mikroinjektion abgeschlossen werden: Wurmkultivierung, Vorbereitung von Mikroinjektionspads, Erstellen von Konstrukten für die Mikroinjektionsmischung und Ausbringen von Bakterien (E. coli HB101) auf 6 cm Nematodenwachstumsmedien (NGM) -Platten⁸. Die freilebenden Weibchen benötigen mindestens 24 Stunden nach der Kotsammlung bei 25 ° C, um sich zu jungen Erwachsenen zu entwickeln, bevor sie mikroinjiziert werden können. Mikroinjektionspads müssen vollständig trocken sein. Bakterienplatten müssen trocknen und einen kleinen Rasen bilden.

1. Vorbereitung von Mikroinjektionsobjektträgern: mindestens einen Tag vor der Injektion

HINWEIS: Würmer werden auf Mikroinjektions-Deckgläsern mit trockenen Agar-Pads zur Injektion montiert.

1. Stellen Sie einen Heizblock auf 90 °C ein.
2. Fügen Sie 5 ml ddH₂O, dann 100 mg Agarose zu einem Borosilikatglasröhrchen hinzu.
3. Erhitzen Sie die Agarosemischung in der Tube über einer Flamme, bis sich die Agarose aufgelöst hat.
4. Legen Sie das Rohr in einen auf 90 °C eingestellten Wärmeblock, um die Agarose im flüssigen Zustand zu halten.
5. Tropfen Sie ~ 180 μL der Agaroselösung auf ein Deckglas mit einer Pasteur-Pipette aus Glas oder einer Pipette mit einer Kunststoffspitze. Sofort ein zweites Deckglas darauf fallen lassen, um die Agarose zu einem dünnen Pad zu glätten.
6. Entfernen Sie nach 5-10 s das obere Deckglas, indem Sie die beiden auseinanderschieben. Bestimmen Sie, auf welchem Dia sich das Agar-Pad befindet, und legen Sie es mit der Vorderseite nach oben.
7. Wählen Sie ein winziges Stück Glasscherbe aus einem zerbrochenen Deckglas und drücken Sie es vorsichtig mit einer Pinzette in das Agar in der Nähe der Oberkante des Pads (Ergänzende Abbildung S1).
8. Machen Sie weiterhin Mikroinjektionspads mit der Agaroselösung.
9. Trocknen Sie die Agarosepads über Nacht auf der Bank oder in einem Ofen. In der Deckglasbox aufbewahren.
   HINWEIS: Die Agarose-Pads können bis zu 2 Monate verwendet werden, werden jedoch nur für einen Injektionslauf verwendet.

2. Kultivierung von Strongyloiden , um Würmer für die Mikroinjektion zu erhalten: 1 - 2 Tage vor der Injektion

HINWEIS: Ein Stammwartungsprotokoll finden Sie im Ergänzungsmaterial, das eine detaillierte Beschreibung enthält, wie man Rennmäuse und Ratten mit Nematoden infiziert und Nematoden aus dem Kot infizierter Tiere erntet.

1. Zwei Tage vor dem Injektionstag legen Sie die infizierten Tiere ^9,10 über Nacht in Sammelkäfige.
2. Am nächsten Morgen sammeln Sie befallenen Kot und machen Fäkalien-Holzkohleplatten ^9,10.
3. Legen Sie einen Teller bei 25 °C für 24 Stunden, damit sich die freilebenden Würmer zu jungen Erwachsenen entwickeln können.
4. Legen Sie in der Nacht vor dem Injektionstag nicht infizierte Wirtstiere in Sammelkäfige.
5. Sammeln Sie am Injektionstag unbefallenen Kot für die Kultivierung nach der Injektion.

3. Herstellung der Mikroinjektionsmischung: vor oder am Tag der Injektion

HINWEIS: Die Mikroinjektionsmischung besteht aus den interessierenden Plasmiden, die in wurmgepufferter Kochsalzlösung (BU) (50 mM Na 2 HPO 4, 22mM KH₂PO₄, 70 mM NaCl)¹¹ auf die gewünschte Konzentration verdünnt sind.

1. Bestimmung der Konzentration der Plasmidbestände und der gewünschten Konzentration in der Mikroinjektionsmischung (Tabelle 1).

Mikroinjektions-Mix: Reporter-Konstrukt
Bestandteil	Lagerkonzentration	Menge	Endkonzentration
pMLC30 gpa-3::gfp	300 ng/μL	1,7 μL	50 ng/μL
Bu	Na	8,3 μL	Na
gesamt		10 μL	50 ng/μL
Mikroinjektionsmischung: CRISPR / Cas9-Mutagenese
Bestandteil	Lagerkonzentration	Menge	Endkonzentration
pMLC47 tax-4 sgRNA	300 ng/μL	2,7 μL	80 ng/μL
pEY11 Ss-tax-4 HDR-Plasmid	400 ng/μL	2,0 μL	80 ng/μL
pPV540 strCas9 Plasmid	350 ng/μL	1,1 μL	40 ng/μL
Bu	Na	4,2 μL	Na
gesamt		10 μL	200 ng/μL
Mikroinjektionsmischung: Huckepack-Integration
Bestandteil	Lagerkonzentration	Menge	Endkonzentration
pMLC30 gpa3::gfp	300 ng/μL	2,0 μL	60 ng/μL
pPV402 Transposase-Plasmid	450 ng/μL	0,9 μL	40 ng/μL
Bu	Na	7,1 μL	Na
gesamt		10 μL	100 ng/μL

Tabelle 1: Beispiele für Mikroinjektionsmischungen Die Plasmide und Konzentrationen für drei Beispiel-Mikroinjektionsmischungen: eine für ein gpa-3::GFP-Reporterkonstrukt 10, eine für CRISPR/Cas9-vermittelte Störung des Ss-tax-4-Locus 14,15 und eine für die piggyBac-vermittelte Integration eines Ss-gpa-3::GFP-Konstrukts ^13,17,18. strCas9 bezeichnet das Strongyloides-Codon-optimierte Cas9-Gen. Die aufgeführten Endkonzentrationen werden üblicherweise in Strongyloides-Mikroinjektionsmischungen verwendet.

2. Verdünnen Sie die Plasmide in BU auf ein Gesamtvolumen von 10-20 μL.
3. Drehen Sie die Mischung durch eine Filtersäule bei 5.000 × g für 1-2 min.
4. Verwenden Sie die Mikroinjektionsmischung sofort oder lagern Sie sie bei -20 °C für die zukünftige Verwendung.

4. Sammeln Sie junge Erwachsene Strongyloides für die Mikroinjektion: Morgen des Injektionstages

1. Stellen Sie den Baermann-Apparat mit 1 Fäkalkohleplatte junger erwachsener Strongyloides auf (Abbildung 2).
   HINWEIS: Die fäkale Holzkohleplatte kann einige infektiöse Larven enthalten. Die persönliche Schutzausrüstung besteht aus einem Laborkittel, Handschuhen und Augenschutz. Zwischen dem Handschuh und der Hülle des Laborkittels sollte keine Haut freigelegt werden.

Abbildung 2: Der Baermann-Apparat, der verwendet wird, um parasitäre Würmer aus Kulturen¹⁰ zu sammeln. Der Inhalt einer Fäkal-Holzkohleplatte wird an der Oberseite einer Säule aus warmem Wasser platziert. Die Würmer wandern ins Wasser und sammeln sich am Boden des Trichters. (A) Zur Aufstellung der Baermann-Vorrichtung wird der Ständer für den Baermann-Trichter mit einer C-Klemme an die Bank geklemmt. Ein Gummischlauch, der am Ende des Trichters befestigt ist, wird mit Klemmklemmen verschlossen, und ein Fangeimer wird unter dem Schlauch für Tropfen platziert. Warmes Wasser wird dem Glastrichter hinzugefügt. (B) Der Kunststoffringhalter für die Fäkal-Holzkohle-Mischung wird dann mit 3 Stück Laborgewebe ausgekleidet (links). Ein Holzstab oder Zungendrücker (Mitte) wird verwendet, um den Inhalt einer Fäkalien-Holzkohleplatte (rechts) in den Kunststoffringhalter zu übertragen. (C) Eine Nahaufnahme des Bodens des Kunststoffringhalters für die Fäkal-Holzkohle-Mischung, die die Doppelschicht Nylontüll zeigt, die den Boden des Halters auskleidet. (D) Der Fäkalien-Holzkohlehalter wird dann auf die Oberseite des Glastrichters gelegt. (E) Das Laborgewebe wird mit Wasser angefeuchtet und über dem Stuhl-Holzkohle-Gemisch verschlossen. Mehr warmes Wasser wird hinzugefügt, um die Fäkal-Holzkohle größtenteils zu tauchen. (F) Das komplette Baermann-Setup, wobei die Fäkalien-Holzkohle-Kultur unter warmes Wasser getaucht ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

2. Installieren Sie einen Glastrichter mit Gummisammelschlauch mit einem O-Ring auf einem Ringständer und sichern Sie ihn mit einer Klemme. Schließen Sie den Auffangschlauch mit 2 Klemmklemmen (Abbildung 2A).
3. Legen Sie einen Fangeimer unter den Trichter, um Tropfen aufzufangen.
4. Warmes (ca. 40 °C) Wasser in den Trichter bis 5 cm unterhalb des Randes geben. Stellen Sie sicher, dass das System nicht undicht ist.
5. Auskleiden Sie den Baermann-Halter, ein Sieb aus 2 Kunststoffringen mit 2 Lagen Nylon-Tüll-Netz, das zwischen ihnen befestigt ist, mit 3 überlappenden Stücken Laborgewebe. Das Fäkal-Holzkohle-Gemisch in den Baermann-Halter geben (Abbildung 2B,C).
6. Legen Sie den Baermann-Halter mit dem Fäkalien-Holzkohle-Gemisch in den Trichter. Falten Sie das Gewebe um die Fäkal-Holzkohle-Mischung und fügen Sie genug Wasser hinzu, um den größten Teil der Fäkal-Holzkohle zu tauchen. Nicht über 2 cm vom Rand des Trichters füllen (Abbildung 2D,E).
7. Bedecken Sie den Trichter mit einem 15 cm langen Kunststoff-Petrischalendeckel, um den Geruch einzudämmen. Beschriften Sie den Trichter nach Bedarf (Abbildung 2F).
8. Warten Sie 30 Minuten bis 1 Stunde, um die Würmer aus dem Baermann-Gerät zu sammeln.
9. Halten Sie ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen unter den Gummischlauch am Boden des Trichters. Öffnen Sie vorsichtig die Klemmen an der Unterseite, um 30-40 ml Wasser mit Würmern in das 50-ml-Rohr zu geben.
10. Geben Sie 15 ml des Baermann-Wassers, das die Würmer enthält, in ein 15 mL Zentrifugenröhrchen. Drehen Sie das 15 ml Zentrifugenröhrchen für 1 min bei ~ 750 × g (langsam). Alternativ können Sie den Würmern erlauben, sich für 10-15 Minuten mit der Schwerkraft zu begnügen.
11. Entfernen Sie den Überstand auf ~ 2 ml und entsorgen Sie den Überstand in einen flüssigen Abfallbehälter mit Jod, um Würmer abzutöten.
12. Fügen Sie dem 15 ml Auffangrohr mehr Baermann-Wasser hinzu und wiederholen Sie den Spin. Entfernen Sie den Überstand auf ~2 ml und verwerfen Sie ihn wie in Schritt 4.11.
13. Wiederholen Sie die Schritte 4.11 und 4.12, bis alle Würmer im 15-ml-Zentrifugenröhrchen gesammelt sind. Nach dem letzten Spin so viel Wasser wie möglich entfernen.
14. Untersuchen Sie das Pellet von Würmern (40-100 μL) am Boden des Rohres. Wenn keine Würmer sichtbar sind, warten Sie weitere 1-2 h und versuchen Sie, weitere Würmer aus dem Baermann-Gerät zu sammeln.
15. Übertragen Sie die Würmer in so wenig Wasser wie möglich auf eine 6 cm große 2% NGM-Platte mit einem Rasen aus E. coli HB101. Verwenden Sie diese Platte als Quellplatte für die Mikroinjektion.
16. Entsorgen Sie die Fäkal-Holzkohle-Mischung, indem Sie sie mit verdünntem Jod (eine 50%ige Verdünnung von Lugols Jod in Wasser) behandeln, sie in Plastikfolie wickeln, um Tropfen aufzufangen, und sie in einen biogefährlichen Abfallbehälter geben.
17. Geben Sie 10 ml verdünntes Jod in den Fangeimer und lassen Sie das überschüssige Wasser aus dem Baermann hinein.
18. Waschen Sie die wiederverwendbaren Komponenten (den Trichter, den Fangeimer, den Kunststoffhalter mit Tüll, den Kunststoffdeckel und die Klemmen) mit 10% Bleichmittel und spülen Sie sie gründlich aus.

5. Ziehen und Laden von Mikroinjektionsnadeln: kurz vor der Injektion

1. Bereiten Sie Mikroinjektionsnadeln vor, indem Sie Glaskapillarröhrchen mit einem Nadelzieher ziehen.
   HINWEIS: Beispieleinstellungen für einen handelsüblichen Nadelzieher, der mit einem 3-mm-Platin-/Iridium-Filament ausgestattet ist, sind Wärme = 810-820, Zug = 800-820, Mikrometer = 2,5.
2. Sehen Sie sich die Spitzen unter einem Seziermikroskop an. Wenn die Nadeln die gewünschte Form haben (Abbildung 3A-F), ziehen Sie 4-6 Nadeln (2-3 Kapillarröhrchen). Um die richtige Nadelform zu erreichen, ändern Sie die Einstellungen nach Bedarf: Passen Sie die Wärme- oder Zugeinstellungen um 10 an und ziehen Sie neue Nadeln, bis die Form der Verjüngung und des Schafts besser geeignet ist.

Abbildung 3: Mikroinjektionsnadeln und ein erwachsenes Weibchen von Strongyloides stercoralis mit optimalen Stellen für die Mikroinjektion identifiziert. (A-F) Bilder von Mikroinjektionsnadeln. (A-B) Der Schaft verjüngt sich (A) und die Spitze (B) einer Nadel, die für die Mikroinjektion richtig geformt ist. Die Spitze ist scharf genug, um die Nagelhaut zu durchbohren und schmal genug, um keine übermäßigen Schäden zu verursachen. (C-D) Die Wellenverjüngung (C) und die Spitze (D) einer Mikroinjektionsnadel, die für die Mikroinjektion falsch geformt ist. Die Spitze ist zu stumpf und breit und verursacht übermäßige Schäden am Wurm. (E-F) Die Welle verjüngt sich (E) und die Spitze (F) einer Nadel, die wahrscheinlich zu lang und schlank ist, um für die Mikroinjektion zu arbeiten. Die Spitze in F ist der Spitze in D sehr ähnlich. Der Schaft ist jedoch schmaler und zu flexibel, um die Kutikula effektiv zu durchbohren. Außerdem verstopfen sehr schlanke Nadeln leicht. (G) Ein Bild des gesamten Wurms, das korrekt für die Mikroinjektion positioniert ist, vorausgesetzt, die Nadel kommt von rechts. Anterior ist unten und links; Die Vulva wird durch die Pfeilspitze angezeigt. Die Gonade ist entlang der rechten Seite des Weibchens sichtbar. Dieses Weibchen hat nur ein Ei in ihrer Gebärmutter (gekennzeichnet durch das Sternchen). (H, I) Vergrößerte Ansichten der Mikroinjektionsstellen. Der Winkel des Pfeils nähert sich dem Winkel der Injektionsnadel an. Die Vulva kann als Wahrzeichen genutzt werden; Es befindet sich auf der gegenüberliegenden Seite des Wurms von den Armen der Gonade. Die Arme der Gonade krümmen sich um den Darm und die Enden mit den sich teilenden Kernen befinden sich gegenüber der Vulva. H) den hinteren Arm der Gonade; (I) der vordere Arm. Einer oder beide Arme können injiziert werden. Für H, I sind Konventionen wie in G. Skalenbalken = 50 μm (B, D, F, H, I); 100 μm (A, C, E, G). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

3. Lagern Sie die gezogenen Nadeln in einer 15 cm großen Kunststoff-Petrischale mit einem Stück gerolltem Klebeband, um die Nadeln zu sichern und Staubansammlungen an den Spitzen zu vermeiden.
4. Legen Sie einen 0,7 μL Tropfen der Mikroinjektionsmischung auf das offene Ende der Welle. Hängen Sie die Nadel senkrecht zu einem Regal mit einem gerollten Stück Klebeband, um den sich verjüngenden Schaft innerhalb von 10 Minuten mit der Mischung zu füllen. Bereiten Sie 2 Nadeln gleichzeitig vor, falls die erste nicht funktioniert.

6. Vorbereitung des Mikroskops und Brechen der Nadel

HINWEIS: Microinjection verwendet ein inverses Mikroskop mit 5x- und 40x-Objektiven, das mit einem Mikroinjektor-Setup ausgestattet ist, um die Bewegung der Nadel zu steuern. Das inverse Mikroskop sollte auf einem schweren Tisch oder einem Anti-Vibrations-Lufttisch platziert werden, um Vibrationsgeräusche zu reduzieren. Der Mikroinjektor-Nadelhalter ist mit Stickstoffgas verbunden, das den Druck ausübt, der für die Abgabe der Mikroinjektionsmischung erforderlich ist. Ein kleineres Seziermikroskop in der Nähe wird verwendet, um die Würmer zu übertragen.

1. Stellen Sie den Druck des Gastanks auf ~ 40-60 psi für das Brechen der Nadel und auf ~ 30-50 psi für die Mikroinjektion ein, abhängig vom Flüssigkeitsfluss.
2. Bedecken Sie auf dem Seziermikroskop die Glasscherbe auf dem Mikroinjektionspad-Deckglas mit Halogenkohlenwasserstofföl mit einem Standard-Platinwurmpickel.
3. Legen Sie den Microinjection Pad Coverslip auf das Mikroinjektionsgerät und lokalisieren Sie die mit Öl bedeckte Glasscherbe. Richten Sie die Glasscherbe so aus, dass eine Kante senkrecht zur Richtung der Nadel steht, um als Oberfläche zum Brechen der Nadel zu dienen.
4. Stellen Sie mit dem Seziermikroskop sicher, dass die Nadel keine Blasen oder Ablagerungen im konischen Schaft aufweist. Befestigen Sie dann die Nadel 1-1,5 cm in der Druckhalterung.
5. Positionieren Sie die Nadelspitze mit dem Auge in der Mitte des Sichtfeldes des Mikroskops. Positionieren Sie dann bei geringer Vergrößerung die Spitze der Nadel im Sichtfeld, senkrecht zur Seite des Glassplitters.
6. Wechseln Sie zu hoher Leistung und richten Sie die Nadelspitze mit dem Rand des Glases aus, in der Nähe, aber ohne es zu berühren.
   HINWEIS: Beim Ziehen werden die Nadeln geschlossen verschmolzen.
7. Um die Nadelspitze zu brechen, um den Flüssigkeitsfluss zu ermöglichen, klopfen Sie vorsichtig auf die Seite des Glasstücks, während Sie kontinuierlichen Druck aus dem Gas ausüben (Ergänzende Abbildung S1). Sobald die Flüssigkeit zu fließen beginnt, überprüfen Sie die Form der Spitze und stellen Sie sicher, dass sie bei leicht fließender Flüssigkeit scharf ist.
   HINWEIS: Wenn die Flüssigkeit zu schnell fließt oder das Ende zu stumpf ist, werden die Würmer während der Mikroinjektion beschädigt (Video 1 und Abbildung 3A-F).
8. Wenn die Flüssigkeit gut aus der Nadel fließt, bewegen Sie den Mikroinjektionsobjektträger in das Sezierfernrohr und legen Sie Tropfen von 1-2 μL Halogenkohlenwasserstofföl auf das Agarpad, um die Würmer zu platzieren.
9. Übertragen Sie 20-30 junge erwachsene Strongyloide für mindestens 5 Minuten auf eine 2% ige NGM-Platte ohne Bakterien, um überschüssige Oberflächenbakterien zu entfernen und einzelne Würmer für die Mikroinjektion auszuwählen. Fügen Sie der NGM-Platte bei Bedarf während der Injektion weitere Würmer hinzu.

7. Mikroinjektion von Strongyloiden

1. Verwenden Sie eine kleine Menge Halogenkohlenstofföl auf einem Wurmpickel, um ein Strongyloides-junges erwachsenes Weibchen mit 1-4 Eiern in ihrer Gonade aus der 2% igen NGM-Platte ohne Bakterien auszuwählen.
2. Übertragen Sie den Wurm in einen winzigen Tropfen Öl auf dem Agar-Pad. Positionieren Sie den Wurm vorsichtig mit dem Wurmwähler, so dass er nicht gewunden ist und die Gonade sichtbar und leicht zugänglich ist. Notieren Sie sich die Richtung der Gonade (Abbildung 3G).
3. Positionieren Sie den Wurm im Sichtfeld des Mikroinjektionsmikroskops. Stellen Sie sicher, dass sich die Gonade auf der gleichen Seite wie die Nadel befindet und so positioniert ist, dass die Nadel die Gonade in einem leichten Winkel berührt (Abbildung 3H,I).
4. Bringen Sie die Nadelspitze an die Seite des Wurms in der gleichen Brennebene. Zielen Sie auf den Gomadenarm in der Nähe der Mitte des Wurms. Verwenden Sie den Mikroinjektor, um die Nadel vorsichtig in die Gonade einzuführen (Video 2).
5. Üben Sie sofort Druck auf die Nadel aus, um den gesamten Gonadenarm vorsichtig mit der DNA-Lösung zu füllen. Stellen Sie mit dem Auge fest, wann genügend Flüssigkeit injiziert wurde (Video 2).
   HINWEIS: Es kann bis zu 2 s dauern, um die Gonade zu füllen.
6. Entfernen Sie die Nadel und überprüfen Sie, ob sich die Wunde schließt.
   HINWEIS: Der Wurm ist zu beschädigt, um Nachkommen zu produzieren, wenn die Gonade durch die Körperwand ragt (Supplemental Video S1).
7. Wiederholen Sie dies mit dem anderen Arm der Gonade, wenn er sichtbar ist.
8. Wenn Sie mit der Injektion fertig sind, überprüfen Sie schnell, ob die Nadel nicht verstopft ist, indem Sie mit der Nadelspitze Druck auf das Agar-Pad ausüben. Übertragen Sie den Objektträger mit dem injizierten Wurm auf das Seziermikroskop.
9. Um den injizierten Wurm wiederherzustellen, legen Sie zuerst ein paar Tropfen BU auf den Wurm, um ihn vom Agar-Pad zu schweben.
10. Sammeln Sie eine kleine Menge HB101-Bakterien auf einem Wurmpick. Berühren Sie den Wurm mit den anhaftenden Bakterien auf dem Wurmpickel, um ihn aus der Flüssigkeit zu entfernen.
11. Übertragen Sie den Wurm vorsichtig auf die Rückgewinnungsplatte , eine 2% NGM-Platte, die einen HB101-Rasen enthält.
    HINWEIS: Der Wurm sollte innerhalb weniger Minuten mit dem Krabbeln beginnen.
12. Nachdem einige Weibchen injiziert wurden, fügen Sie einige nicht injizierte Männchen von der Quellplatte hinzu.
    HINWEIS: Ein Minimum von einem Mann für fünf Frauen ist eine gute Basis; Ein Überschuss an Männchen wird bevorzugt.
13. Wiederholen Sie alle Schritte, bis genügend Weibchen für das Experiment injiziert wurden.
14. Lassen Sie die Erwachsenen nach der Injektion mindestens 1 Stunde auf der Erholungsplatte, damit sich die Würmer erholen und paaren können.

8. Rückgewinnung und Kultivierung von injizierten Strongyloiden

1. Sammeln Sie über Nacht Kot von nicht infizierten Wirtstieren und verwenden Sie das gleiche Protokoll wie für infizierte Tiere.
2. Mischen Sie den unbefallenen Kot mit einer kleinen Menge Holzkohle (Kot zu Holzkohleverhältnis von etwa 2 zu 1 für diese Platten).
3. Gießen Sie eine kleine Menge der Fäkal-Holzkohle-Mischung in eine 6 cm große Petrischale, die mit feuchtem Filterpapier ausgekleidet ist. Stellen Sie sicher, dass die Mischung den Deckel des Gerichts nicht berührt.
4. Überfluten Sie die Rückgewinnungsplatte mit BU. Übertragen Sie die Würmer mit einem Pipettensatz bei 3 μL auf den Kot in der Fäkalkohleplatte. Legen Sie die Würmer direkt auf den Kot, nicht auf die Holzkohle.
5. Überprüfen Sie, ob sich die Erwachsenen auf der Fäkalien-Holzkohleplatte befinden, indem Sie ein Sezierfernrohr verwenden.
6. Um die Würmer zu kultivieren, legen Sie die Platte in eine befeuchtete Kammer, d. H. Eine Plastikbox mit einem eng anliegenden Deckel, der mit feuchten Papiertüchern ausgekleidet ist.
   HINWEIS: Nach 2 Tagen wird es eine Mischung aus Larvenstadien geben. Nach 5 Tagen haben sich die meisten Larven zu iL3s entwickelt; Ein paar jüngere Larven werden bleiben. Nach 7 Tagen sollten alle Larven iL3s sein.

9. Sammeln und Screening von F _1-Larven zur Wiederherstellung von Transgenen / Knockouts

1. Sammeln Sie die Larven mit einem Baermann-Setup von den kleinen Fäkal-Holzkohle-Kultivierungsplatten nach der Injektion. Um so viele Larven wie möglich zu erhalten, warten Sie mindestens 2 Stunden, bevor Sie die Würmer aus dem Baermann-Apparat bergen.
2. Konzentrieren Sie die Larven in einem 15 ml Zentrifugenröhrchen wie in den Schritten 4.10-4.14 und übertragen Sie die Larven auf ein kleines Uhrenglas mit BU.
3. Wenn die Larven für Verhaltensexperimente verwendet werden, verwenden Sie 2% NGM-Platten mit einem dicken Rasen von HB101 für das Screening.
   1. Übertragen Sie 20-30 Larven auf den HB101-Rasen.
      HINWEIS: Die Bakterien verlangsamen die Bewegung der Larven.
   2. Identifizieren Sie unter einem Fluoreszenz-Seziermikroskop die Larven, die das Transgen von Interesse ausdrücken. Verwenden Sie einen Wurmpickel, um die transgenen Larven auszuwählen und sie zu einem kleinen Uhrenglas mit BU zu bewegen.
   3. Verwenden Sie eine neue HB101-Platte, um eine weitere kleine Charge von Larven zu screenen. Wenn genügend Larven für den experimentellen Einsatz gesammelt wurden, behandeln Sie die HB101-Platten und die überschüssigen Würmer mit verdünntem Jod (50% Lugol-Jod in Wasser verdünnt) und entsorgen Sie sie als biogefährliche Abfälle. Alternativ töten Sie die überschüssigen Würmer mit einem konzentrierten Zwingerreiniger, der Alkylbenzylammoniumchloride enthält.
   4. Verwenden Sie die Würmer sofort oder lassen Sie sie in einem flachen Uhrenglas in einer kleinen Menge BU über Nacht.
      HINWEIS: Würmer können hypoxisch werden, wenn die Flüssigkeit zu tief ist. Es ist möglich, dass das Verlassen von Larven in BU über Nacht bestimmte Verhaltensweisen beeinflussen kann; Verwenden Sie daher Larven für Verhaltensexperimente innerhalb von 6 h.
4. Wenn die Larven für die Mikroskopie und nicht für Verhaltenstests verwendet werden, immobilisieren Sie die Würmer durch Nikotinlähmung reversibel für das Screening.
   1. Ritzen Sie mit einer Rasierklinge ein Gitter auf den Kunststoffboden einer 10 cm langen Chemotaxisplatte^12, um den Überblick über die Position der Würmer auf der Platte zu erleichtern.
   2. Tropfen Sie ~ 3 μL Larven in BU in ein Quadrat auf dem Gitter. Füllen Sie so viele Quadrate wie nötig. Verwenden Sie nicht die in der Nähe der Ränder der Platte, da die Larven zu den Seiten der Platte kriechen können.
   3. Fügen Sie 15-20 μL Tropfen von 1% Nikotin in Wasser zu den Wurmtropfen hinzu.
      HINWEIS: Nach 4 Minuten sind die Würmer gelähmt.
   4. Screenen Sie die Würmer mit einem Fluoreszenz-Seziermikroskop.
   5. Verwenden Sie einen Wurmpickel, um die transgenen Larven in ein kleines Uhrenglas mit 1-2 ml BU zu übertragen.
      HINWEIS: Die Larven werden für mehrere Stunden gelähmt und können leicht auf Objektträgern für die Mikroskopie montiert werden. Wenn das iL3s über Nacht in der BU verbleibt, erholt es sich und kann für einige Assays oder eine Infektion des Säugetierwirts verwendet werden. Nikotinlähmung und die Inkubation über Nacht in BU können jedoch bestimmte Verhaltensweisen beeinflussen.

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Ergebnisse

Wenn das Experiment erfolgreich war, exprimieren die F 1-Larven den Transgen- und/oder Mutantenphänotyp von Interesse (Abbildung 4). Die Transformationsraten sind jedoch sehr unterschiedlich und hängen von den Konstrukten, der Gesundheit der Würmer, den Kultivierungsbedingungen nach der Injektion und den Fähigkeiten des Experimentators ab. Im Allgemeinen ergibt ein erfolgreiches Experiment >15 F_1-Larven pro injizierter Frau und eine Transformationsrate von >3% für ...

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Diskussion

Dieses Mikroinjektionsprotokoll beschreibt die Methoden zur Einführung von Konstrukten für Transgenese und CRISPR/Cas9-vermittelte Mutagenese in S. stercoralis und S . ratti. Sowohl für S. stercoralis als auch für S. ratti unterliegen das Überleben nach der Injektion und die Transgenese- oder Mutageneserate mehreren Variablen, die fein abgestimmt werden können.

Die erste kritische Überlegung für eine erfolgreiche Transgenese ist, wie Plasmidtransgen...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
(−)-Nicotine, ≥99% (GC), liquid	Sigma-Aldrich	N3876-5ML	nicotine for paralyzing worms
3" iron C-clamp, 3" x 2" (capacity x depth)	VWR	470121-790	C-clamp to secure setup to bench top
Agarose LE	Phenix	RBA-500	agarose for slides
Bone char, 4 lb pail, 10 x 28 mesh	Ebonex	n/a	charcoal for fecal-charcoal cultures
Bone char, granules, 10 x 28 mesh	Reade	bonechar10x28	charcoal for fecal-cultures (alternative to the above)
Coarse micromanipulator	Narishige	MMN-1	coarse micromanipulator
Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters	Fisher	07-200-385	microfilter column
Cover glass, 48 x 60 mm, No. 1 thickness	Brain Research Lab	4860-1	coverslips (48 x 60 mm)
Deep Petri dishes, heavy version with 6 vents, 100 mm diameter	VWR	82050-918	10 cm Petri dishes (for fecal-charcoal cultures)
Eisco retort base w/ rod	Fisher	12-000-101	stand for Baermann apparatus
Eppendorf FemtoJet microinjector microloader tips	VWR	89009-310	for filling microinjection needles
Fisherbrand absorbent underpads	Fisher	14-206-62	bench paper (for prepping)
Fisherbrand Cast-Iron Rings	Fisher	14-050CQ	Baermann o-ring
Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers	Fisher	14-955-111F	Plastic beaker (for mixing)
Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers	Fisher	14-955-111F	Plastic beaker (for catch bucket/water bucket)
Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers	Fisher	14-955-111F	Plastic beaker (x2) (to make holder)
Gorilla epoxie in syringe	McMaster-Carr	7541A51	glue (to attach tubing)
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898-50ML	halocarbon oil
High-temperature silicone rubber tubing for food and beverage, 1/2" ID, 5/8" OD	McMaster-Carr	3038K24	tubing (for funnel)
KIMAX funnels, long stem, 60° Angle, Kimble Chase	VWR	89001-414	Baermann funnel
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science benchtop protectors	Fisher	15-235-101	bench paper (for prepping)
Leica stereomicroscope with fluorescence	Leica	M165 FC	GFP stereomicroscope for identifying and sorting transgenic worms
microINJECTOR brass straight arm needle-holder	Tritech	MINJ-4	microinjection needle holder
microINJECTOR system	Tritech	MINJ-1	microinjection system
Mongolian Gerbils	Charles River Laboratories	213-Mongolian Gerbil	gerbils for maintenance of S. stercoralis, male 4-6 weeks
Nasco Whirl-Pak easy-to-close bags, 18 oz	VWR	11216-776	Whirl-Pak sample bags
Nylon tulle (mesh)	Jo-Ann Fabrics	zprd_14061949a	nylon mesh for Baermann holder
Platinum wire, 36 Gauge, per inch	Thomas Scientific	1233S72	platinum/iridium wire for worm picks
Puritan tongue depressors, 152 mm (L) x 17.5 mm (W)	VWR	62505-007	wood sticks (for mixing samples)
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)	QIAGEN	27106	QIAGEN miniprep kit
Rats-Long Evans	Envigo	140 HsdBlu:LE Long Evans	rats for maintenance of S. ratti, female 4-6 weeks
Rats-Sprague Dawley	Envigo	002 Hsd:Sprague Dawley SD	rats for maintenance of S. ratti, female 4-6 weeks
Really Useful Boxes translucent storage boxes with lids, 1.6 L capacity, 7-5/8" x 5-5/16" x 4-5/16"	Office Depot	452369	plastic boxes for humidified chamber
Shepherd techboard, 8 x 16.5 inches	Newco	999589	techboard
Stainless steel raised wire floor	Ancare	R20SSRWF	wire cage bottoms
StalkMarket compostable cutlery spoons, 6", white, pack of 1,000	Office Depot	9587303	spoons
Stender dish, stacking type, 37 x 25 mm	Carolina (Science)	741012	watch glasses (small, round)
Stereomicroscope	Motic	K-400 LED	dissecting prep scope
Storage tote, color clear/white, outside height 4-7/8 in, outside length 13-5/8 in, Sterilite	Grainger	53GN16	plastic boxes for humidified chamber
Sutter P-30 micropipette puller	Sutter	P-30/P	needle puller with platinum/iridium filament
Syracuse watch glasses	Fisher	S34826	watch glasses (large, round)
Thermo Scientific Castaloy fixed-angle clamps	Fisher	05-769-2Q	funnel clamps (2x)
Three-axis hanging joystick oil hydrolic micromanipulator	Narishige	MM0-4	fine micromanipulator
United Mohr pinchcock clamps	Fisher	S99422	Pinch clamps (2x)
Vented, sharp-edge Petri dishes (60 mm diameter)	Tritech Research	T3308P	6 cm Petri dishes (for small-scale fecal-charcoal cultures)
VWR light-duty tissue wipers	VWR	82003-820	lining for Baermann holder
watch glass, square, 1-5/8 in	Carolina (Science)	742300	watch glasses (small, square)
Whatman qualitative grade plain circles, grade 1, 5.5 cm diameter	Fisher	09-805B	filter paper (for 6 cm Petri dishes)
Whatman qualitative grade plain circles, grade 1, 9 cm diameter	Fisher	09-805D	filter paper (for 10 cm Petri dishes)
World Precision Instrument borosilicate glass capillary, 1.2 mm x 4 in	Fisher	50-821-813	glass capillaries for microinjection needles
X-Acto Knives, No. 1 Knife With No. 11 Blade	Office Depot	238816	X-Acto knives without blades to hold worm picks
Zeiss AxioObserver A1	Zeiss	n/a	inverted microscope