Intrakavernöse Druckaufzeichnung in einem Rattenmodell mit Verletzung des Nervus cavernosus

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Entwicklung eines stabilen bilateralen Modells für Rattenverletzungen des Nervus cavernosus, das mit radikaler Prostatektomie in Verbindung mit erektiler Dysfunktion und intrakavernöser Druckmessung einhergeht.

Zusammenfassung

Das Modell der bilateralen Verletzung des Nervus cavernosus (CN) bei der Ratte wurde ausgiebig verwendet, um klinische Verletzungen des Nervus cavernosus im Zusammenhang mit erektiler Dysfunktion (ED) zu simulieren und die Wirkung klinischer therapeutischer Methoden zu bewerten. Die Methoden zur Erstellung von CN-Verletzungsmodellen sind jedoch fehlerhaft und variieren im Bereich der ED-Forschung. Es ist die CN-Quetschverletzung, die in den letzten Jahren die am häufigsten verwendete Methode ist. Ziel dieser Studie ist es, eine detaillierte Beschreibung des Verfahrens der Konstruktion eines bilateralen CN-Verletzungsmodells für Ratten und der Messung der intrakavernösen Druckaufzeichnung (ICP) zu liefern, um ein zuverlässiges und reproduzierbares Modell für CN-Verletzungen an Ratten bereitzustellen. In dieser Arbeit wurde erfolgreich die CN-Verletzungsmethode der Hämostatenquetschverletzung entwickelt, bei der eine Spritzennadel als harte Unterstützung und ein Hämostat mit einer Gummimanschette verwendet werden. Außerdem kommt diese Methode zu dem Schluss, dass eine Spannung von 1,0 V, eine Frequenz von 20 Hz und eine Pulsbreite von 5 ms die optimierten Stimulationsparameter für die ICP-Aufzeichnung in einem bilateralen CN-Verletzungs-Rattenmodell sind.

Einleitung

ED ist eine der häufigsten Erkrankungen bei erwachsenen Männern. Es wird geschätzt, dass die Zahl der ED-Patienten weltweit bis 2025 322 Millionen erreichen wird¹. Eine multizentrische umfangreiche Stichprobenerhebung in China zeigt, dass der Anteil der durch Beckenoperationen oder Traumata verursachten ED bei etwa 8 %² liegt. Trotz der kontinuierlichen Verbesserung der Operationstechniken und chirurgischen Instrumente ist die Inzidenz von ED nach wie vor hoch. Es wurde davon ausgegangen, dass die Entwicklung und das Fortschreiten der ED nach nervenschonender radikaler Prostatektomie (RP) zu einer Schädigung des Nervus cavernosus beiträgt, die zu einer Atrophie des Corpus cavernosum, der glatten Muskulatur, der Apoptose der Endothelzellen und einem pathologischen Umbau führt ^3,4.

Zur Untersuchung des Mechanismus der hämodynamischen und histopathologischen Veränderungen der ZN-Schädigung im Zusammenhang mit ED wurden verschiedene Tiermodelle für ZN-Verletzungen entwickelt und bewertet, darunter Nagetiere, Hunde, Katzen und Affen ^5,6,7. Aufgrund der Vorteile in Bezug auf Aufwand und Reproduzierbarkeit hat sich das bilaterale Modell der KN-Verletzungsratte zum gebräuchlichsten Modell für die Beurteilung der ED nach radikalen Beckenoperationen^{entwickelt 8}. In der zahlreichen Literatur wurden jedoch verschiedene Formen von Nervenverletzungen beschrieben, deren Hauptunterschiede die Ansätze der Nervenverletzung (Quetschen, Einfrieren, Durchtrennen und Exzision) sind9,10,11. Darüber hinaus könnte die Vielfalt der Ansätze zur Nervenverletzung zu einer Inkonsistenz der Parameter für die Aufzeichnung des intrakavernösen Drucks (ICP) im Rattenmodell führen, was die Genauigkeit und Bewertung von ICP⁸ bestimmt. Dennoch gibt es noch keine standardisierte Methode zur Induktion von Nervenverletzungen und zur Aufzeichnung des ICP des Modells.

Daher zielt diese Studie darauf ab, ein zuverlässigeres und reproduzierbareres bilaterales Modell für CN-Verletzungen von Ratten zu erstellen. Diese Methode bietet eine detaillierte Beschreibung des Verfahrens der Modellkonstruktion und der ICP-Messung, die für die Untersuchung der Mechanismen der ED und die Entwicklung wirksamer Behandlungen in der Zukunft von Vorteil sein könnte.

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Protokoll

In dieser Studie wurden fünfzehn erwachsene männliche Sprague-Dawley-Ratten (3 Monate alt) mit einem Gewicht zwischen 300 und 350 g verwendet. Alle Tiereingriffe wurden gemäß den NIH-Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren und mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee des fünften angeschlossenen Krankenhauses der Sun Yat-Sen University durchgeführt. Die Tiere wurden in einer komfortablen Anlage mit kontrollierter Temperatur und Licht untergebracht.

1. Materialien zur Vorbereitung auf chirurgische Eingriffe

1. Bereiten Sie die folgenden Instrumente vor: Skalpell, Gewebeschere, Fadenschere, Biegezange, Gewebezange, mikrochirurgische Zange, hämostatische Hartman-Mückenzange, sterile chirurgische Laken, einen Mikronadelhalter, Abdominalretraktoren für Ratten und ein biologisches Signalerfassungs- und -verarbeitungssystem (siehe Materialtabelle).
   1. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente vor der Operation. Verwenden Sie alkoholische Tücher (70 % Ethanol), um den Operationsbereich zu reinigen.
      HINWEIS: Die chirurgischen Instrumente sollten über Nacht durch Eintauchen in Alkohol sterilisiert werden.
2. Vorbereiten des Druckaufzeichnungssystems
   1. Verbinden Sie eine 10-ml-Spritze mit Heparinkochsalzlösung und einer subkutanen 25-G-Nadel mit einem Schlauch (20 cm Länge) mit einem 3-Wege-Absperrhahn. Spülen Sie das sterilisierte Röhrchen mit steriler Heparin-Kochsalzlösung (200 U/ml).
      HINWEIS: Durch das Befüllen der Tube mit Heparin-Kochsalzlösung wird das Einbringen von Luftblasen in das System vermieden.
3. Heben Sie die 25 G Nadel 20 cm (nur die Schlauchlänge) über das Tier-OP-Pad. Prüfen Sie anschließend die Messgenauigkeit des Druckaufzeichnungssystems durch Spülen oder Klopfen.

2. Vorbereitung des Tieres

1. Betäuben Sie Ratten durch intraperitoneale Natrium-Pentobarbital-Injektion (60 mg/kg) (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Um eine ausreichende Anästhesietiefe zu bestätigen, wurde eine Bewertung des spontanen Atemrhythmus und der Reflexe einer Ratte durch Einklemmen der Hinterpfote durchgeführt.
2. Tragen Sie Salbe auf beide Augen auf, um Hornhauttrockenheit zu vermeiden.
3. Nachdem Sie eine ordnungsgemäße Betäubung bestätigt haben, rasieren Sie die untere Hälfte des Bauches, des Halses und des Perineums mit einem Elektrorasierer. Legen Sie die Ratte in Rückenlage auf ein Heizkissen (37 °C). Tragen Sie medizinische Handschuhe, um bei chirurgischen Eingriffen sterile Bedingungen zu gewährleisten.

3. Verfahren zur Isolierung und Verletzung der KN

1. Verwenden Sie ein Skalpell, um einen 4 cm langen Schnitt durch die Haut an der unteren, mittleren Bauchlinie zu machen. Um die Blase und die Prostata vollständig freizulegen, verwenden Sie eine Gewebeschere und eine Gewebezange, um einen Schnitt durch die subkutane Faszie, das Muskelgewebe und das Bauchfell zu machen.
2. Verwenden Sie einen Bauchretraktor für Ratten, um die operative Feldkarte zu vergrößern. Verwenden Sie saugfähige Wattestäbchen, um die Prostata von den angrenzenden Geweben, wie z. B. den Bändern, zu trennen.
   HINWEIS: Das große Beckenganglion (MPG) und das CN können in einem von zwei dorsolateralen Bereichen der Prostata gefunden werden.
3. Verwenden Sie eine abgewinkelte Mikroschere, um die Faszie über CN 1-6 mm distal von MPG zu schneiden. Schieben Sie dann eine Naht 9-0 mit Hilfe einer mikrochirurgischen Pinzette unter die CN.
4. Platzieren Sie eine Spritzennadel (25 G) unter dem CN, 5 mm distal zum MPG. Stellen Sie dann das Blutstillungsmittel in das Licht der Sandwichstruktur "Hämostatenspitze-Spritze-Nadel-Nerven-Hämostat-Spitze" (Abbildung 1 und Abbildung 2).
   HINWEIS: Die Spritzennadel muss flach geschliffen werden.
5. Tragen Sie das Blutstillbad mit vollem Spitzenverschluss in einem Abstand von 5 mm vom Ganglion für 1 Minute auf und ziehen Sie dann das Blutstillbad und die Spritzennadel zurück (Abbildung 2).
6. Heben Sie den Nerv mit einer 9-0-Naht leicht an und platzieren Sie die Haken der bipolaren Elektrode (siehe Materialtabelle) um den CN 2-4 mm distal von MPG (Abbildung 3).
   HINWEIS: Zwei Paare von MPG und CN wurden auf die gleiche Weise betrieben.

4. Katheterisierung des Corpus cavernosum und Stimulation des KN für die ICP-Messung

1. Spülen Sie das Röhrchen mit steriler Heparinkochsalzlösung (200 U/ml), bevor Sie es in den Schwellkörper einführen.
2. Halten Sie die 25 G Nadel fest und halten Sie die Einstichrichtung parallel zum Verlauf des Corpus cavernosum (Abbildung 3).
   HINWEIS: Die Tunica albuginea sollte gedehnt werden, um das Einführen zu erleichtern.
3. Schieben Sie die 25 G Nadel 6 mm in den Schwellkörper (Abbildung 3). Spülen Sie das Rohr und drücken Sie leicht auf den Schwellkörper, um die Empfindlichkeit des Schallkopfs zu beurteilen (Abbildung 4). Um ein versehentliches Herunterfallen zu verhindern, fixieren Sie das Rohr mit Klebeband auf dem Arbeitstisch.
4. Für die CN-Stimulation sind folgende Parameter zu verwenden: Spannung bei 1,0 V, Frequenz bei 20 Hz, Pulsbreite bei 5 ms. Wenden Sie 1 Minute Stimulation mit 5 Minuten Pause zwischen der folgenden Stimulation an.
   HINWEIS: Drehen Sie den 3-Wege-Absperrhahn beim Starten der Messung auf den Druckmessumformerkanal.

5. Postoperative Pflege

1. Legen Sie die Ratten auf eine erwärmte Unterlage (37 °C) und überwachen Sie sie sorgfältig auf die Wiederherstellung der Narkose.
2. Zur postoperativen Schmerzkontrolle sind nichtsteroidale Antirheumatika (wie Carprofen, 0,5 mg/kg, subkutane Injektion) (siehe Materialtabelle) zu verabreichen, wenn sich die Ratten vollständig erholt haben.
3. Bringen Sie die Ratten in den aseptischen Käfig und überwachen Sie sie 2 Tage, um den Ernährungszustand, den psychischen Zustand und die Infektion der Schnittwunde zu beurteilen.

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Ergebnisse

Der chirurgische Eingriff erzeugte eine typische ICP-Reaktionskurve unter Verwendung dieses Protokolls mit den empfohlenen Stimulationseinstellungen. Die ICP-Reaktionskurve steigt sofort an, wenn der Nerv stimuliert wird, und sinkt, wenn die Stimulation zurückgezogen wird (Abbildung 5). Vor der Messung des ICP ist es wichtig, die intrakavernöse Druckleitung zu untersuchen, was sich auf die Bewertung erhöhter ICP-Werte auswirkt (Abbild...

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Diskussion

ED ist eine schwere Komplikation einer Beckenoperation oder eines Traumas. Trotz einer nervenschonenden Operation liegt die Inzidenzrate der ED bei der radikalen Prostatektomie (RP) bei etwa 14-90 %¹². Aufgrund der problematischen Regeneration der Verletzung des CN ist die klinisch heilende Wirkung nicht zufriedenstellend. Daher ist ein stabiles Tiermodell für ZNS-Verletzungen für die Erforschung von Behandlungen von ED unerlässlich. Quinlan et al. berichteten ...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 G needle	BD Bioscience	367391
Abdominal retractor	RWD Life Science	R22009-01
Animal operating pad	Provided by Guangdong Provincial Key Laboratory of Biomedical Imaging	NA
Bending forceps	RWD Life Science	F12011-10
Biological signal acquisition and processing system	Techman Software	BL-420S
Bipolar electrode	Techman Software	AC0047
Carprofen	Sigma-Aldrich	MFCD00079028
HARTMAN mosquito hemostatic forceps	RWD Life Science	F22002-10
Heparin	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	2608411
Micro needle holder	RWD Life Science	F31047-12
Microsurgery forceps	RWD Life Science	F11001-11
Scalpel	RWD Life Science	S32003-12
Sodium pentobarbital	Guangdong Provincial Key Laboratory of Biomedical Imaging	NA
Sprague–Dawley rat	Guangdong Medical Laboratory Animal Center	GDMLAC-035
Thread scissors	RWD Life Science	S15001-11
Tissue forceps	RWD Life Science	F13019-12
Tissue scissors	RWD Life Science	S13029-14