Digitale Tropfen-PCR-Methode zur Quantifizierung der AAV-Transduktionseffizienz in der Murinen Netzhaut

Zusammenfassung

Dieses Protokoll zeigt, wie die AAV-Transduktionseffizienz in der Netzhaut der Maus mittels digitaler Tröpfchen-PCR (dd-PCR) in Verbindung mit AAV-Produktion im kleinen Maßstab, intravitrealer Injektion, retinaler Bildgebung und retinaler genomischer DNA-Isolierung quantifiziert werden kann.

Zusammenfassung

Viele Labore für netzhautzellbiologie verwenden heute routinemäßig Adeno-assoziierte Viren (AAVs) für Gen-Editing und regulatorische Anwendungen. Die Effizienz der AAV-Transduktion ist in der Regel kritisch, was sich auf die gesamten experimentellen Ergebnisse auswirkt. Eine der Hauptdeterminanten für die Transduktionseffizienz ist der Serotyp oder die Variante des AAV-Vektors. Derzeit sind verschiedene künstliche AAV-Serotypen und -Varianten mit unterschiedlichen Affinitäten zu Wirtszelloberflächenrezeptoren verfügbar. Für die retinale Gentherapie führt dies zu unterschiedlichen Transduktionswirkungsgraden für verschiedene retinale Zelltypen. Darüber hinaus können der Injektionsweg und die Qualität der AAV-Produktion auch die retinale AAV-Transduktionseffizienz beeinflussen. Daher ist es wichtig, die Effizienz verschiedener Varianten, Chargen und Methoden zu vergleichen. Die digitale Tröpfchen-PCR-Methode (dd-PCR) quantifiziert die Nukleinsäuren mit hoher Präzision und ermöglicht die durchführung einer absoluten Quantifizierung eines bestimmten Ziels ohne Standard oder Referenz. Mit hilfe der dd-PCR ist es auch möglich, die Transduktionseffizienzen von AAVs durch absolute Quantifizierung der AAV-Genomkopienzahlen innerhalb einer injizierten Netzhaut zu bewerten. Hier stellen wir eine einfache Methode zur Quantifizierung der Transduktionsrate von AAVs in Netzhautzellen mittels dd-PCR zur Verfügung. Mit geringfügigen Modifikationen kann diese Methodik auch die Grundlage für die Kopienzahlquantifizierung der mitochondrialen DNA sowie für die Bewertung der Effizienz der Basenbearbeitung sein, die für mehrere Netzhauterkrankungen und Gentherapieanwendungen von entscheidender Bedeutung ist.

Einleitung

Adeno-assoziierte Viren (AAVs) werden heute häufig für eine Vielzahl von retinalen Gentherapiestudien verwendet. AAVs bieten eine sichere und effiziente Art der Genabgabe mit weniger Immunogenität und weniger Genomintegrationen. Der AAV-Eintritt in die Zielzelle erfolgt durch Endozytose, die eine Bindung von Rezeptoren und Co-Rezeptoren auf der Zelloberfläche erfordert^1,2. Daher hängt die Transduktionseffizienz von AAVs für verschiedene Zelltypen hauptsächlich vom Kapsid und seinen Wechselwirkungen mit den Wirtszellrezeptoren ab. AAVs haben Serotypen und jeder Serotyp kann unterschiedliche Zell- / Gewebetropismen und Transduktionseffizienzen aufweisen. Es gibt auch künstliche AAV-Serotypen und -Varianten, die durch chemische Modifikation des Viruskapsids, Produktion von Hybridkasiden, Peptidinsertion, Kapsidmuffling, gerichtete Evolution und rationale Mutagenese erzeugt werden³. Selbst geringfügige Veränderungen der Aminosäuresequenz oder der Kapsidstruktur können einen Einfluss auf Wechselwirkungen mit Wirtszellfaktoren haben und zu unterschiedlichen Tropismen führen⁴. Neben Kapsidvarianten können andere Faktoren wie der Injektionsweg und die Batch-to-Batch-Variation der AAV-Produktion die Transduktionseffizienz von AAVs in der neuronalen Netzhaut beeinflussen. Daher sind zuverlässige Methoden für den Vergleich von Transduktionsraten für verschiedene Varianten notwendig.

Die Mehrheit der Methoden zur Bestimmung der AAV-Transduktionseffizienz beruht auf der Expression des Reportergens. Dazu gehören fluoreszierende Bildgebung, Immunhistochemie, Western Blot oder histochemische Analyse des Reportergenprodukts^5,6,7. Aufgrund der Größenbeschränkung von AAVs ist es jedoch nicht immer möglich, Reportergene einzubeziehen, um die Transduktionseffizienz zu überwachen. Die Verwendung starker Promotoren wie dem hybriden CMV-Enhancer/Chicken Beta-Actin oder woodchuck hepatitis post-transcriptional regulatory element (WPRE) als mRNA-Stabilisatorsequenz verkompliziert das Größenproblem^{weiter 8}. Daher wird es auch von Vorteil sein, die Transduktionsrate von injizierten AAVs mit einer direkteren Methodik zu definieren.

Die digitale Tröpfchen-PCR (dd-PCR) ist eine leistungsstarke Technik zur Quantifizierung der Ziel-DNA aus winzigen Probenmengen. Die dd-PCR-Technologie hängt von der Verkapselung der Ziel-DNA und der PCR-Reaktionsmischung durch Öltröpfchen ab. Jede dd-PCR-Reaktion enthält Tausende von Tröpfchen. Jedes Tröpfchen wird als eigenständige PCR-Reaktion aufbereitet und analysiert⁹. Die Analyse von Tröpfchen ermöglicht die Berechnung der absoluten Kopienzahl von Ziel-DNA-Molekülen in jeder Probe mithilfe des Poisson-Algorithmus. Da die Transduktionseffizienz der AAVs mit der Kopienzahl von AAV-Genomen in der neuronalen Netzhaut korreliert, verwendeten wir die dd-PCR-Methode, um AAV-Genome zu quantifizieren.

Hier beschreiben wir eine dd-PCR-Methodik zur Berechnung der Transduktionseffizienz von AAV-Vektoren aus retinaler genomischer DNA^6,10. Erstens wurden AAVs, die tdTomato-Reporter exprimieren, unter Verwendung des Small-Scale-Protokolls generiert und durch die dd-PCR-Methode¹¹titeriert. Zweitens wurden AAVs intravitreal in die neuronale Netzhaut injiziert. Um die Transduktionseffizienz zu demonstrieren, haben wir zunächst die tdTomato-Expression mit Fluoreszenzmikroskopie und ImageJ-Software quantifiziert. Es folgte die Isolierung genomischer DNA zur Quantifizierung von AAV-Genomen in injizierten Netzhäuten mittels dd-PCR. Der Vergleich der tdTomato-Expressionsniveaus mit den transduzierten AAV-Genomen, die durch die dd-PCR quantifiziert wurden, zeigte, dass die dd-PCR-Methode die Transduktionseffizienz von AAV-Vektoren genau quantifizierte. Unsere Protokolle zeigten eine detaillierte Beschreibung einer dd-PCR-basierten Methodik zur Quantifizierung der AAV-Transduktionseffizienz. In diesem Protokoll zeigen wir auch die absolute Anzahl der AAV-Genome, die nach intravitrealen Injektionen transduziert werden, indem einfach der Verdünnungsfaktor nach der genomischen DNA-Isolierung und die dd-PCR-Ergebnisse verwendet werden. Insgesamt bietet dieses Protokoll eine leistungsfähige Methode, die eine Alternative zur Reporterexpression wäre, um die Transduktionseffizienz von AAV-Vektoren in der Netzhaut zu quantifizieren.

Protokoll

Alle experimentellen Protokolle wurden von der Ethikkommission der Sabanci Universität akzeptiert und die Experimente wurden in Übereinstimmung mit der Erklärung der "Association for Research in Vision and Ophthalmology" für die Verwendung von Tieren in der Forschung durchgeführt

1. Kleine AAV-Produktion¹²

1. Kultivieren Sie HEK293T-Zellen unter Verwendung von 15-cm-Platten in vollständigen 10 ml DMEM / 10% FBS bis zu 70-80% Konfluenz.
2. Die Transfektionsmischung ist mit 20 μg Hilfsplasmid (pHGT1-Adeno1), 7 μg Kapsidplasmid und 7 μg AAV2-CBA-tdTomato-WPRE-Vektor und 136 μL PEI-Lösung (1 mg/ml) in 5 ml DMEM herzustellen.
3. Die 5 ml hergestellte Transfektionsmischung in eine Zellkulturschale mit 10 ml Nährmedien geben und die transfizierten Zellen für 48-60 h bei 37 °C inkubieren.
4. Sammeln Sie das Medium 48-60 h nach der Transfektion und verdauen Sie es mit DNase I in einer Endkonzentration von 250 U/ml für 30 min bei 37 °C.
5. Zentrifugieren Sie das aufgeschlossene Medium bei 4000 x g,4 °C für 30 min und filtrieren Sie es dann mit einem 0,22 μm Spritzenfilter in die vorbenetzte regenerierte Cellulosemembran für 100 kDa.
6. Zentrifugieren Sie die regenerierte Cellulosemembran bei 4000 x g,4 °C für 30 min und entsorgen Sie das Medium.
7. Waschen und zentrifugieren Sie die regenerierte Cellulosemembran mit PBS, das 0,001% Pluronic F-68 enthält, dreimal bei 4000 x g,4 °C für 30 min. Verwerfen Sie den PBS bei jedem Schritt.
8. Sammeln Sie konzentrierte AAVs aus dem oberen Teil der regenerierten Cellulosemembran und Aliquot für weitere Anwendungen.
9. 5 μL frisch hergestelltes AAV mit DNase I (0,2 HE/μl) für 15 min bei 37 °C zum Titerieren aufbereiten. Es folgt eine Inkubation von 10 min bei 95 °C, um sowohl die DNase I zu inaktivieren als auch die viralen Kapside abzubauen.
10. Bereiten Sie eine 10-fache serielle Verdünnung aus verdauten AAVs mit 0,05% Pluronic F-68 vor. Verwenden Sie AAV2-ITR- und WPRE-Primer für die Titration (Tabelle 1). Die Titer wurden berechnet, indem die dd-PCR-Ergebnisse mit den Verdünnungsfaktoren multipliziert wurden. Die Ergebnisse wurden in Genomkopie/ml (GC/ml) umgewandelt.
    HINWEIS: Die AAV-Konzentrationen für die AAV-Produktion in kleinem Maßstab werden voraussichtlich etwa 1 x 10¹² GC/ml betragen. Dieses Protokoll gilt nicht für AAV-Stämme, die AAVs nicht effizient in Medien wie AAV2^{13 freisetzen.}

2. Intravitreale Injektion von AAV

1. Vorbereitung der Ausrüstung
   1. Bevor Sie beginnen, bereiten Sie 10 μL Mikrospritze mit einer 36 G stumpfen Nadel vor. Spülen Sie fünfmal mit 70% EtOH, fünfmal in ddH₂O und schließlich fünfmal mit PBS.
   2. Laden Sie für jede Injektion die entsprechende Menge AAV in die Mikrospritze.
   3. Bereiten Sie die chirurgische Nadel (Naht, Seide, 6/0), Klebeband, Pinzette und Schere vor.
2. Intravitreale Injektion
   1. Tragen Sie vor der Narkose 1 Tropfen 0,5% Tropicamid und 2,5% Phenylephrinhydrochlorid (z. B. Mydfrin) mit Augentropfen auf, um die Pupillen zu erweitern.
   2. Anästhesieren Sie Mäuse mit Isofluran 5% (1 L/min) und fahren Sie während des Eingriffs mit 1,5% Isofluran (1 L/min) fort. Für die erste Induktion wird eine kleine Isoflurankammer verwendet.
   3. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie durch den Verlust des Aufrichtungsreflexes, des Entzugsreflexes und der Schwanzquetschreaktion.
   4. Tragen Sie vor dem Injektionsvorgang 0,3% Tobramycin und 0,1% ige sterile ophthalmologische Lösung mit Dexamethason auf jedes Auge auf. Die Anwendung von Augentropfen verhindert Trockenheit und übt entzündungshemmende und antibakterielle Wirkungen aus.
   5. Verwenden Sie den Operationshaken, um das obere Augenlid zu stabilisieren. Ziehen Sie sich leicht zurück, um den dorsalen Teil des Auges freizulegen. Kleben Sie den Haken an die Bank, um ihn in Position zu halten.
   6. Entfernen Sie die Bindehaut (weniger als 1 mm²⁾mit der gekrümmten Irisschere, um die Sklera des Auges unter dem Seziermikroskop freizulegen. Verwenden Sie eine frische und sterile Insulinspritze (30 G), um die Sklera zu punktieren.
   7. Führen Sie die Nadel der Mikrospritze mit einem Mikromanipulator durch dieselbe Punktion. Legen Sie die Nadelspitze hinter die Linse in die Mitte der Augenmuschel.
   8. Injizieren Sie 1 μL AAV2/BP2 und AAV2/PHP. S-Vektoren mit Konzentrationen von 1,63 x^{10 12} GC/ml und 1,7 x^{10 12} GC/ml gelangen langsam in den Glaskörper des Auges. Die Einspritzvolumenregelung erfolgt manuell. Lassen Sie die Nadel für 1 Minute an Ort und Stelle und ziehen Sie die Nadel langsam zurück.
   9. Lassen Sie das Augenlid los und tragen Sie eine entzündungshemmende und antibakterielle topische Gelbehandlung mit 0,3% Tobramycin und 0,1% Dexamethason auf die Augenmuschel auf. Überwachen und bewerten Sie die Mäuse in den folgenden Tagen gemäß dem Scoresheet in Bezug auf Aussehen (helle Augen, gepflegtes Fell, Buckeln), Verhalten (Aktivität, Ruhigstellung, Selbstverstümmelung) und Körpergewicht auf einer Skala von 0 bis 3. Jede Bedingung hat eine Punktzahl von 0-3 und eine Gesamtpunktzahl von 3 oder höher ist ein Beendigungskriterium.
   10. Legen Sie die Tiere nach der Genesung in den Käfig.

3. Fluoreszenz- und Fundusbildgebung

1. Die Maus abseihen und die Pupille erweitern, indem Sie Tropfen von 0,5% Tropicamid und 2,5% Phenylephrinhydrochlorid in jedes Auge geben.
2. Betäuben Sie das Tier mit dem oben genannten Verfahren mit Isofluran. Beurteilen Sie die Tiefe der Anästhesie sorgfältig, indem Sie die Pfoten kneifen.
3. Legen Sie die Maus auf die Bildgebungsstufe und überprüfen Sie die richtige Dilatation, indem Sie die Funduskamera überprüfen. Tragen Sie topisches Gel (0,2% Carbomer 980) auf die Oberfläche der Augen auf, um die Augen vor Austrocknung unter Narkose zu schützen und es als Kopplungsgel für die Bildgebung zu verwenden.
4. Manipulieren Sie die Bildgebungsstufe so, dass sie sich an den Revolver des Objektivs anpasst. Passen Sie die Bühne nach Bedarf an, um das Mausauge zu zentrieren. Sobald das Auge zentriert ist, bewegen Sie das Ziel langsam, bis es Kontakt mit dem Auge hat.
5. Führen Sie eine Fundus- und Fluoreszenzbildgebung an beiden Augen durch, um die tdTomato-Expression 1 Woche und 2 Wochen nach intravitrealer Injektion zu verfolgen (Abbildung 3B)¹⁴. Nehmen Sie Fundus- und Fluoreszenzbilder mit identischen Einstellungen zum Vergleich der Reporterexpression.

4. Isolierung der Netzhaut

1. Einschläfern von Tieren nach Fundus- und Fluoreszenzbildgebung durch CO_2-Inhalation zur Netzhautentnahme nach 2 Wochen.
2. Verschieben Sie den Augapfel mit Hilfe einer 13,5 cm Splitterzange nach vorne.
3. Entfernen Sie die Linse zusammen mit dem übrig gebliebenen Glaskörper, indem Sie sanften Druck mit der Pinzette ausüben.
4. Schneiden Sie die Verbindung des Augapfels zum Sehnerv mit einer präzise gekrümmten Pinzette ab und drücken Sie die Netzhaut vorsichtig mit der gleichen gekrümmten Pinzette zusammen.
5. Übertragen Sie sezierte Netzhäute in ein Mikrozentrifugenröhrchen.
6. Snap Freeze Retina, indem Sie die Röhrchen in den flüssigen Stickstoff legen.

5. Genomische DNA-Isolierung von Gewebe

1. Isolieren Sie genomische DNA mit einem kommerzialisierten Proteinase K-Verdauungs-basierten genomischen Gewebe-DNA-Kit.
2. Verdauen Sie die Netzhaut bei 55 °C, 200 x g für 30 min mit Proteinase K, die bereits im Kit enthalten ist.
3. Führen Sie den RNase-Inkubationsschritt, die Waschschritte mit dem Waschpuffer I und II und schließlich den Elutionsschritt gemäß dem Protokoll des Herstellers durch.
4. Fügen Sie nach der letzten Wäsche einen zusätzlichen Schleuderschritt hinzu, um Den Restethanol zu entfernen.
5. Messen Sie die Konzentration der genomischen DNA und lagern Sie die Proben bei -20 °C.

6. Digitale Tröpfchen-PCR-Analyse von Netzhautproben von Mäusen zur Quantifizierung viraler Genome

1. Verdünnung genomischer DNAs aus injizierter Netzhaut in 0,05% pluronic F-68 Lösung, um eine Endkonzentration von 1 ng/μL für jede Probe zu erreichen.
2. Führen Sie separate Reaktionen für WPRE und 18S mit zielspezifischen Primern mit einer Endkonzentration von 125 nM für jeden Primer durch.
3. Führen Sie die Tröpfchengenerierung in einer 20 μL PCR-Reaktionsmischung durch, einschließlich 1 ng genomischer DNA, 125 nM-Primern und 2x Evagreen-Supermix.
4. Laden Sie die Probenmischung in den mittleren Teil der Patrone, um Tröpfchen zu erzeugen.
5. Nachdem die Probe in die Kartusche geladen wurde, geben Sie 70 μL des Tröpfchenerzeugungsöls in die untere Reihe der Kartusche.
6. Setzen Sie die Dichtung auf die Patrone und legen Sie sie in den Tröpfchengenerator. Stellen Sie sicher, dass kein Spalt zwischen der Dichtung und der Kartusche besteht.
7. Nehmen Sie vorsichtig etwa 40 μL Tröpfchen, die im oberen Brunnen erzeugt werden. Geben Sie die Tröpfchenlösung in die halbverzierte 96-Well-PCR-Reaktionsplatte.
8. Versiegeln Sie die PCR-Platte mit einem PCR-Plattenversiegeler unter Verwendung von Aluminium-Dichtfolie.
9. Legen Sie die PCR-Platte in einen 96-Well-Heißsiegel-Thermocycler. Verwenden Sie das PCR-Protokoll; 95 °C für 5 min, 40 Zyklen von 95 °C für 30 s, 60 °C für 1 min, 4 °C für 5 min, 90 °C für 5 min und 4 °C unendlich halten. Wenden Sie bei jedem Zyklus eine Rampenrate von 2 °C/s an, um sicherzustellen, dass die Tröpfchen während des Zyklus für jeden Schritt die richtige Temperatur erreichen
10. Legen Sie die PCR-Platte in den Tröpfchenleser ein, um die Tröpfchen mit der dd-PCR-Software zu quantifizieren. Eine Vorlage wird mit spezifischen Einstellungen für evagreen eingerichtet.
11. Analysieren Sie die Daten mithilfe eines 1D-Diagrammdiagramms mit jeder Probe für die Fluoreszenzintensität im Vergleich zur Tröpfchenzahl. Der Schwellenwert ist so angeordnet, dass die Tröpfchen oberhalb des Schwellenwerts als positiv und die darunter liegenden als negativ zugeordnet werden. Es folgt die Anwendung des Poisson-Algorithmus zur Bestimmung der Ausgangskonzentration der Ziel-DNA in Kopieneinheiten/μL. Das Verhältnis von WPRE zu 18S wird für die Messung der AAV-Transduktionseffizienz berechnet.

Ergebnisse

Die AAV-Produktion im kleinen Maßstab ist eine schnelle und effiziente Methode, die Vektoren für intravitreale Injektionen liefert (Abbildung 1). Die AAV-Produktion im kleinen Maßstab ergibt in der Regel Titer im Bereich von 1 x 10¹² GC/ml, was ausreicht, um die Reporterexpression in der Netzhaut nachzuweisen (Abbildung 2). Die Titerierung von AAV mittels dd-PCR liefert konsistente Ergebnisse. ITR2- und WPRE-spezifische Primer werden routinemäßig...

Diskussion

In diesem Protokoll haben wir zwei AAV-Vektoren mit unterschiedlichen Kapsidproteinen generiert und diese dann entsprechend titeriert. Einer der wichtigsten Schritte dieses Protokolls besteht darin, ausreichende Mengen an AAVs zu erzeugen, die nach der Transduktion^12,13eine nachweisbare Reporterexpression ergeben.

Die Titerierung von AAVs ist auch ein wichtiger Faktor, um die Dosierung von AAV für intravitreale Injektionen anzupass...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-Well Semi-Skirted ddPCR plates	BioRad	12001925	ddPCR
Amicon Filter	Millipore	UFC910096	AAV
C1000 TOUCH 96 DEEP WELLS	BioRad	1851197	ddPCR
C57BL/6JRj mice strain	Janvier	C57BL/6JRj	Mice
DG8 gaskets	BioRad	1863009	ddPCR
DG8 Cartridges	BioRad	1864008	ddPCR
DMEM	Lonza	BE12-604Q	AAV
DPBS	PAN BIOTECH	L 1825	AAV
Droplet generation oil eva green	BioRad	1864006	ddPCR
Droplet reader oil	BioRad	1863004	ddPCR
FBS	PAN BIOTECH	p30-3306	AAV
Foil seals for PX1 PCR Plate sealer	BioRad	1814040	ddPCR
Insulin Syringes	BD Medical	320933	Intravitreal injection
Isoflurane	ADEKA ILAC SANAYI VE TICARET	N01AB06	anesthetic
Microinjector MM33	World Precision Instruments	82-42-101-0000	Intravitreal injection
Micron IV	Phoenix Research Labs	Micron IV	Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas.
Mydfrin (%2.5 phenylephrine hydrochloride)	Alcon	S01FB01	pupil dilation
Nanofil Syringe 10 μl	World Precision Instruments	NANOFIL	Intravitreal injection
Needle RN G36, 25 mm, PST 2	World Precision Instruments	NF36BL-2	Intravitreal injection
PEI-MAX	Polyscience	24765-1	AAV
Penicillin-Streptomycin	PAN BIOTECH	P06-07100	AAV
Plasmid pHGT1-Adeno1	PlasmidFactory	PF1236	AAV
Pluronic F-68	Gibco	24040032	AAV
PX1 PCR Plate Sealer system	BioRad	1814000	ddPCR
QX200 ddPCR EvaGreen Supermix	BioRad	1864034	ddPCR
QX200 Droplet Reader/QX200 Droplet Generator	BioRad	1864001	ddPCR
SPLITTER FORCEP WATCHER MAKER - LENGTH = 13.5 CM	endostall medical	EJN-160-0155	Retina isolation
Steril Syringe Filter	AISIMO	ASF33PS22S	AAV
Tissue Genomic DNA Kit	EcoSpin	E1070	gDNA isolation
Tobradex (0.3% tobramycin / 0.1% dexamethasone)	Alcon	S01CA01	anti-inflammatory / antibiotic
Tropamid (% 0.5 tropicamide)	Bilim Ilac Sanayi ve Ticaret AS.	S01FA06	pupil dilation
Turbonuclease	Accelagen	N0103L	AAV
Viscotears (carbomer 2 mg/g)	Bausch+Lomb	S01XA20	lubricant eye drop