Eine einfache und effektive Methode zur konsistenten Isolierung von Maus-Kardiomyozyten

Zusammenfassung

Der Goldstandard in der Kardiologie für zelluläre und molekulare Funktionsexperimente sind Kardiomyozyten. Dieser Artikel beschreibt Anpassungen an die Nicht-Langendorff-Technik zur Isolierung von Maus-Kardiomyozyten.

Zusammenfassung

Der Bedarf an reproduzierbaren und technisch einfachen Methoden, die qualitativ hochwertige Kardiomyozyten liefern, ist für die Forschung in der Herzbiologie von entscheidender Bedeutung. Zelluläre und molekulare funktionelle Experimente (z. B. Kontraktion, Elektrophysiologie, Kalziumzyklus usw.) an Kardiomyozyten sind der Goldstandard für die Etablierung von Krankheitsmechanismen. Die Maus ist die Spezies der Wahl für funktionelle Experimente und die beschriebene Technik ist speziell für die Isolierung von Maus-Kardiomyozyten. Bisherige Methoden, die einen Langendorff-Apparat erfordern, erfordern ein hohes Maß an Training und Präzision für die Aortenkanülierung, was häufig zu einer Ischämie führt. Das Feld verlagert sich hin zu Langendorff-freien Isolationsmethoden, die einfach und reproduzierbar sind und lebensfähige Myozyten für die physiologische Datenerfassung und Kultur liefern. Diese Methoden verkürzen die Ischämiezeit im Vergleich zur Aortenkanülierung erheblich und führen zu zuverlässig erhaltenen Kardiomyozyten. Unsere Anpassung an die Langendorff-freie Methode umfasst eine initiale Perfusion mit eiskalter Clearing-Lösung, die Verwendung einer stabilisierenden Plattform, die eine stabile Nadel während der Perfusion gewährleistet, und zusätzliche Verdauungsschritte, um zuverlässig gewonnene Kardiomyozyten für den Einsatz in funktionellen Messungen und Kulturen zu gewährleisten. Diese Methode ist einfach und schnell durchzuführen und erfordert wenig technisches Geschick.

Einleitung

Eine wesentliche Idee in der herzbiologischen Literatur ist seit Jahrzehnten der molekulare Wirkmechanismus. Der Wirkmechanismus muss etabliert sein, um verlässliche Studien zu veröffentlichen. Eine gut etablierte Strategie zur Bestimmung molekularer Mechanismen sind isolierte Kardiomyozytenstudien, die qualitativ hochwertige Kardiomyozyten benötigen, um vertrauenswürdige Daten zu erhalten. Zelluläre und molekulare Experimente, die an Kardiomyozyten durchgeführt werden, um den Wirkmechanismus zu bestimmen, sind der Goldstandard für die Untersuchung von Kontraktion¹, Elektrophysiologie², Calcium (Ca 2+) -Zyklus³, Myofilament Ca²⁺ Sensitivität⁴, Zytoskelett⁵, Metabolismus⁶, Wirkungen von Hormonen⁷, Signalmoleküle⁸, Arzneimittelstudien⁹ etc. Die Maus ist aufgrund der Leichtigkeit der genetischen Manipulation, ihrer geringen Größe, ihrer relativ kurzen Lebensdauer, ihrer geringen Kosten usw. zur Spezies der Wahl für die meisten herzbiologischen Experimente geworden¹⁰. Die zuverlässige Isolierung hochwertiger Maus-Kardiomyozyten ist jedoch mit den derzeitigen Techniken nicht trivial.

Labore isolieren Kardiomyozyten seit fast 70 Jahren¹¹. Praktisch alle Techniken zur Isolierung von Kardiomyozyten beruhen auf der Verdauung des Herzens über verschiedene Enzyme (Kollagenase, Protease, Trypsin usw.). In den frühen Perioden (1950er bis 1960er Jahre) wurde die Chunk-Methode angewendet, bei der das Herz entfernt, in viel kleinere Stücke geschnitten und in Lösung mit Kollagenase / Protease / Trypsin¹² inkubiert wurde. In den 1970er Jahren implementierten Labore die verbesserte "Langendorff"-Methode¹³, bei der Kardiomyozyten mit einer auf Koronararterienperfusion basierenden Isolationstechnik isoliert wurden (retrograde Perfusion mit Enzym über den Langendorff-Apparat); Diese Technik ist auch heute noch die dominierende Methode der Myozytenisolierung auf diesem Gebiet, ~50 Jahre später^14,15,16. Neuere Arbeiten haben sich auf die Kanülierung des Herzens in vivo verlagert, um die Hypoxiezeit und ischämische Schäden zu begrenzen, was zu überlegenen Kardiomyozytenisolierungen (bessere Ausbeute und höhere Qualität) ^führt17. In jüngster Zeit hat sich dies zu einer in vivo durchgeführten Langendorff-freien Herzperfusion entwickelt 18,19,20,21,22. Wir haben die Langendorff-freie Kardiomyozyten-Isolationstechnik auf Basis der Technik von Ackers-Johnson et ^al.18 weiterentwickelt und verschiedene Komponenten aus den vielen bisherigen Isolationstechniken adaptiert. Zu diesen wichtigen Anpassungen gehören die Injektion eines eiskalten Clearing-Puffers und der Einbau einer Stützplattform zur Stabilisierung der Nadel, die eine verringerte Manipulation des Herzens ermöglicht. Ebenfalls detailliert in dieser Technik ist die Temperaturkontrolle der injizierten Puffer (37 °C), die die Zeit zwischen In-vivo-Injektion und Aufschluss aufgrund einer geringeren EDTA-Perfusion verkürzte, wie zuvor veröffentlicht¹⁸. Durch die Verringerung der Manipulation des Herzens und damit die Minimierung der Größe der Einstichstelle wird eine gründliche und konstante Durchblutung der Koronararterien erreicht. Wir verfeinerten die Technik auch mit einem sekundären Chunk-Aufschluss, der Menge an EDTA im injizierten Clearing-Puffer und änderten den pH-Wert. Unsere beschriebene Technik ist zuverlässiger, effizienter und erfordert im Vergleich zur Verwendung des Langendorff-Geräts keine umfangreiche Ausbildung/Übung (Tabelle 1).

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Protokoll

Alle in dieser Studie durchgeführten Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Ohio State University in Übereinstimmung mit den NIH-Richtlinien genehmigt.

1. Vorbereitung der Lösung

ANMERKUNG: Die Pufferkonzentrationen sind Tabelle 2 zu entnehmen.

1. Präisolation (bis zu 2 Wochen vor der Myozytenisolierung)
   1. Perfusionspufferbasis: Bereiten Sie 1 l Perfusionspufferbasis (NaCl, KCl,_NaH2PO4, HEPES, Glucose und BDM) in 1 l hochreinen 18,2 MΩ·cm H₂O vor. Stellen Sie vor der 0,22 μm Sterilfiltration einen pH-Wert von 7,4 ein. Bei 4 °C bis zum Tag der Isolierung lagern.
   2. Clearing-Puffer: Bereiten Sie 1 l Clearing-Puffer (NaCl, KCl, NaH2 PO 4, HEPES, Glucose, EDTA und BDM) in 1 l hochreinen 18,2 MΩ·cm H₂O vor. Stellen Sie vor der 0,22 μm Sterilfiltration einen pH-Wert von_7,4 ein. Bei 4 °C bis zum Tag der Isolierung lagern.
   3. 100 mM CaCl 2 Stammlösung: 1,11 g CaCl 2 werden abgewogen und in 100 ml hochreines 18,2 MΩ·cm H₂ O aufgelöst. Bei Raumtemperatur bis zum Tag der Isolierunglagern.
   4. Liberase-Aliquote: Lösen Sie 5 mg Verdauungsenzyme in 5 ml sterilem, RNase-freiem Wasser auf. 0,8 ml Aliquote herstellen und bis zum Tag der Isolierung bei -20 °C lagern.
   5. Laminieren Sie das Geschirr: Tragen Sie 100 μl 40 μg/ml Mauslaminin auf sterile 30-ml-Petrischalen mit Glasboden auf. 30 Minuten einwirken lassen und überschüssiges Laminin entfernen. Legen Sie das Laminin auf eine Petrischale mit UV-Inkubation bei Raumtemperatur für 30 min. Bei 4 °C bis zum Tag der Isolierung lagern (laminierte Petrischalen können bis zu 2 Wochen verwendet werden).
   6. DMEM-Medien: In einer Biosicherheitswerkbank 2,5 ml FBS, 0,5 ml Penicillin-Streptomycin (50 U/ml-50 μg) und 1 ml 500 mM BDM zu 46 ml DMEM geben. Bei 4 °C bis zum Tag der Isolierung lagern (Medien können bis zu 2 Wochen verwendet werden).
   7. M199-Medien: Bereiten Sie 1 l M199-Medien (NaHCO₃, HEPES, L-Glutathion, M199, BDM und BSA) in 1 l hochreinem 18,2 MΩ·cm H₂O vor. Vor der Sterilfiltration auf pH 7,4 einstellen (0,22 μm Filter). Bei 4 °C bis zum Tag der Isolierung lagern.
   8. 500 mM BDM-Vorrat: 0,5 g BDM zu 10 ml hochreinem 18,2 MΩ·cm H₂O. Bei 4 °C bis zum Tag der Isolierung lagern.
   9. Stabilisierende Plattformerstellung: Bilden Sie Spielteig um die Basis der Nadel, die in den Luer-Absperrhahn geschraubt ist. Formen Sie die Petrischale, die das Herz enthält, und stellen Sie sicher, dass sich die Nadel in der richtigen Höhe für die Ventrikelinjektion befindet (~ 5 mm über dem Boden der Schale).
2. Der Tag der Isolation
   1. Perfusionspuffer: Am Tag der Isolierung 9,5 mg MgCl₂ auf 100 ml Perfusionspufferbase geben. Vollständig mischen lassen, bevor 30 ml des fertigen Perfusionspuffers entfernt werden, und in eine saubere, 100-ml-Glasflasche mit weitem Mund und Schraubverschluss (Aufschlusspuffer) geben.
      HINWEIS: Diese Zusätze können am Tag der Isolierung ohne zusätzliche pH-Einstellungen vorgenommen werden, da ihre Zugabe den pH-Wert vernachlässigbar verändert.
      1. Entfernen Sie 12 ml Perfusionspuffer und legen Sie ihn zur Seite (Stopppuffer). Gießen Sie die restlichen 58 ml Perfusionspuffer in eine weitere saubere, 100-ml-Weithalsglasflasche mit Schraubverschluss. Lagern Sie den verbleibenden Perfusionspuffer während der gesamten Isolierung bei 37 °C.
   2. Aufschlusspuffer: 7,5 μl 100 mM CaCl₂ bis 30 ml Perfusionspuffer für eine Endkonzentration von 25 μM zugeben. Unmittelbar vor der Isolierung 770 μl Liberase in den Aufschlusspuffer geben, um eine Endkonzentration von 26 μg/ml zu erreichen.
   3. Stopppuffer: 240 mg BSA in 12 ml Perfusionspuffer auflösen. Während der gesamten Isolierung bei 37 °C lagern.
   4. Clearing-Puffer: Bereiten Sie eine 3-ml-Spritze mit Clearing-Puffer vor und befreien Sie die Nadel von Blasen. Bis zur Isolation auf Eis lagern.

2. Vielfältige Vorbereitung

1. Reinigen Sie den temperaturgesteuerten Verteiler mit frisch aufbereitetem Perfusionspuffer und achten Sie darauf, dass keine Blasen zurückbleiben. Schrauben Sie mit einem Luer-Lock-Anschluss eine 27-G-Nadel ein und befreien Sie sie von Blasen. Ein geklärter Verteiler ist für eine erfolgreiche Isolierung unerlässlich.

3. Tierische Vorbereitung

1. Injizieren Sie der Maus unmittelbar vor der Isolierung intraperitoneal 100 mg/kg Ketamin und 20 mg/kg Xylazin nach Körpergewicht. Bei diesem Verfahren wurde eine männliche, 4 Monate alte C57Bl/6-Maus verwendet.
2. Legen Sie die Maus bei Bedarf auf ein erhitztes OP-Pad, um die Sedierung zu fördern. Zelten Sie die Arme der Maus und kleben Sie die Gliedmaßen und den Schwanzansatz an eine blaue Laborwindel. Stellen Sie sicher, dass das Tier durch den Rückzug des Zehen-Kneif-Reflexes vollständig betäubt ist. Tragen Sie ein steriles Tuch um den Operationsbereich auf.

4. Verfahren zur Isolierung von Kardiomyozyten

1. Legen Sie das Brustbein der Maus frei und schneiden Sie seitlich zur Mittellinie proximal durch die Rippen und zur Achselhöhle. Schneiden Sie das Zwerchfell vorsichtig vollständig durch und achten Sie auf flache Schnitte, um das Herz zu vermeiden. Klemmen Sie das Brustbein mit einem Hämostat fest und falten Sie die Rippen nach hinten, um die Brusthöhle freizulegen.
2. Entfernen Sie vorsichtig das Perikard aus dem Herzen und schneiden Sie die untere Hohlvene unmittelbar distal des Herzens vollständig durch. Verwenden Sie eine 3-ml-Spritze mit einer 27-g-Nadel, um 3 ml eiskalten Clearing-Puffer über 1 Minute schnell in den rechten Ventrikel des Herzens zu injizieren.
3. Halten Sie das Herz vorsichtig mit einer Pinzette fest und ziehen Sie es vom Körper weg, wobei Sie so viel wie möglich von der Aorta freilegen. Klemmen Sie mit einem Hämostat die aufsteigende Aorta fest, achten Sie darauf, die Vorhöfe nicht einzuklemmen, und schneiden Sie das Herz aus der Brust.
4. Übertragen Sie das geklemmte Herz schnell auf den Deckel einer Polypropylen-Petrischale mit ca. 10 ml warmem Perfusionspuffer. Setzen Sie das geklemmte Herz in die Stützplattform ein und injizieren Sie mit einer stabilisierten 27-G-Nadel, die am Verteiler befestigt ist, 10 ml temperaturgesteuerten 37 °C-Perfusionspuffer über 5 Minuten in den linken Ventrikel.
5. Übertragen Sie das festgeklemmte Herz und die Stützplattform in eine Petrischale mit ca. 5 ml Verdauungspuffer. Tauschen Sie die Eingangsspritzen gegen eine 50-ml-Spritze mit 25 ml Aufschlusspuffer aus.
6. Befreien Sie den Verteiler vor der Injektion von Blasen und verbleibendem Perfusionspuffer. Setzen Sie die Nadel vorsichtig in die gleiche Nadelposition an der linksventrikulären Spitze ein.
7. Verwenden Sie eine Perfusionspumpe, um mit einer 50-ml-Spritze 15 Minuten lang temperaturgesteuerten Aufschlusspuffer bei 37 °C in den linken Ventrikel zu injizieren. Kontrollieren Sie die Temperatur der Lösung mit einem Wassermantel, der zuvor so kalibriert wurde, dass er eine 37 °C-Lösung am Ende der Nadel ausstößt.
8. Entfernen Sie die Ventrikel aus den Vorhöfen und geben Sie sie in ein 10-ml-Becherglas. Geben Sie 3 ml Verdauungspuffer in das Becherglas und schneiden Sie die Ventrikel mit einer scharfen Schere in große Stücke. Das Becherglas mit Alufolie abdecken und 5 min in ein auf 37 °C vorgeheiztes Schüttelwasserbad stellen.
9. Entsorgen Sie den Überstand und achten Sie darauf, dass keine Gewebestücke entfernt werden. Resuspendieren Sie die Gewebebrocken in 3 ml Aufschlusspuffer und triturieren Sie sie etwa 4 Minuten lang oder bis eine homogene Mischung erreicht ist.
10. Filtern Sie die Zellen durch ein 70-μm-Nylon-Zellsieb in ein 50-ml-Polypropylenröhrchen.
11. Das Filtrat wird in ein 14-ml-Polypropylenröhrchen mit rundem Boden zurückgeführt und 1 Minute lang bei 100 U/min zentrifugiert. Verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in 3 ml Stopppuffer.
12. Geben Sie 54 μl 100 mM CaCl 2 -Bestand in die resuspendierten Zellen, um eine endgültige CaCl_{2-Konzentration} von 1,8 mM zu erreichen. Dieser Schritt kann auch schrittweise durchgeführt werden, um die Zellausbeute zu erhöhen.
13. Lassen Sie lebende Zellen 10 Minuten lang durch die Schwerkraft absetzen, bevor Sie den Überstand mit den toten Zellen entfernen. Resuspendieren Sie das Pellet in Lagerlösung (Perfusionslösung mit 200 μM CaCl₂). Diese Zellen können nun für funktionelle Experimente (z. B. Kalzium-Bildgebung/-Kontraktion, Patch-Klemme usw.), Kulturen usw. verwendet werden.
    HINWEIS: Die Zellen können auch in labor- oder experimentabhängigen Lösungen resuspendiert werden.

5. Zellkultur

1. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer oder mit einem gerasterten Deckglas. Da Myozyten sehr groß sind, ist die Zählung mit einem Hämozytometer nicht immer genau. Dies wird verwendet, um eine Vorstellung davon zu bekommen, wie viele Zellen ungefähr aus der Isolierung gewonnen wurden.
2. Verdünnen Sie die Zellen mit DMEM-Medien auf ~25.000 Zellen/ml. Geben Sie 1 ml Zelllösung in jede Vertiefung.
3. Inkubation bei 37 °C, 95 % O 2, 5 % CO 2 für₂ h.
4. Saugen Sie DMEM-Medien vorsichtig aus jeder Vertiefung ab und fügen Sie 2 ml M199-Medien hinzu.
5. Inkubation bei 37 °C, 95% O 2, 5% CO₂ für bis zu 24 h.

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Ergebnisse

Es gibt einige Elemente, die bei der Bestimmung des Erfolgs einer Isolation zu berücksichtigen sind. Erstens müssen die Kardiomyozyten stäbchenförmig sein und keine Membranbläschen aufweisen, wie die in Abbildung 1 isolierten Zellen. Eine typische Isolierung ergibt ~80% der Myozyten, die stäbchenförmig sind. Wenn die Isolierung weniger als 50% stäbchenförmige Zellen ergibt, wird dies als erfolglose Isolierung angesehen und Kardiomyozyten werden nicht verwendet. Schließlich sollten ...

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Diskussion

Der Hauptvorteil unserer Langendorff-freien Kardiomyozyten-Isolationstechnik besteht darin, dass sie Hypoxie und ischämische Zeit begrenzt, da keine Kanülierung an einem Langendorff-Gerät erforderlich ist. Alternativ zu den klassischen Langendorff-Techniken, die mehrere Minuten benötigen, um das Herz zu entfernen, zu reinigen und aufzuhängen, was oft zu einer ischämischen Schädigung der Myozyten führt, beinhaltet unsere Methode eine In-vivo-Reinigung des Blutes über eine eiskalte Reinigungslös...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cc Bd Luer-Lok Syringe	Fisher Sci	14-827-52
10 mL Pyrex Low-Form Beaker	Cole-Palmer	UX-34502-01
100 mL polypropylene cap glass media storage bottle	DWK Life Sciences	UX-34523-00
14 mL Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap	Fisher Sci	14-959-11B
2,3-Butanedione Monoxime	Sigma	B0753	>98%
3 cc BD Luer-Lok Syringe	Fisher Sci	14-823-435
35 mm glass bottom dishes	MatTek Corporation	P35G-1.0-20-C
50 mL BD Syringe without Needle	Fisher Sci	13-689-8
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Cole-Palmer	EW-22999-84
95% O2 5% CO2
AIMS Space Gel Heating Pad	Fisher Sci	14-370-223
BD PrecisionGlide 27 G X 1/2" Hypodermic Needles	Becton Dickinson	305109
Bovine Serum Albumin	Sigma	A3803	Heat shock fraction, lyophilized powder, essentially fatty acid free, >98%
Calcium Chloride dihydrate	Sigma	C7902	>99%
D-(+)-Glucose	Sigma	G7021	Suitable for cell culture, >99.5%
DMEM	Fisher Sci	11965092
EDTA	Fisher Sci	AAA1071336
Falcon 100 mm TC-treated Cell Culture Dish	Corning	353003
FBS	R&D Systems (Bio-techne)	S11195
Fisherbrand Isotemp Heated Immersion Circulators	Fisher Sci	13-874-432
Hartman Mosquito Hemostatic Forceps	World Precision Instruments	15921
Hausser Scientific Hy-Lite Counting Chamber Set	Fisher Sci	02-671-11
HEPES	Sigma	H4034	>99.5%
Labeling Tape	Fisher Sci	15-901-10R
Legato 100 Syringe Pump	kdScientific	788100
L-glutathione	Fisher Sci	ICN19467980
Liberase TH Research Grade	Sigma	5401135001	High thermolysin concentration
M199	Fisher Sci	MT10060CV
Magnesium Chloride	Invitrogen	AM9530G
Mouse Laminin	Corning	354232
Pen/Strep	Fisher Sci
Potassium Chloride	Sigma	P5405	>99%
Precision Digital Reciprocating Water Bath	ThermoFisher Scientific	TSCIR19
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761	Suitable for cell culture
Sodium Chloride	Sigma	S5886	>99%
Sodium phosphate monobasic	Sigma	S5011	>99%
Sterile Cell Strainer 70 µm	Fisher Sci	22-363-548
Student Fine Scissors	Fine Science Tools	91460-11
VWR Absorbent Underpads	Fisher Sci	NC9481815