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Glyphosat-basierte Produkte (GBP) sind die weltweit am weitesten verbreiteten Breitband-Herbizide. In diesem Artikel stellen wir allgemeine Richtlinien vor, um die Wirkung von GBP auf Mikrobiome zu quantifizieren, von Feldexperimenten bis hin zu bioinformatischen Analysen.
Glyphosat-basierte Produkte (GBP) sind die weltweit am weitesten verbreiteten Breitband-Herbizide. Das Ziel von Glyphosat ist das Enzym 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase (EPSPS) im Shikimatweg, das in Pflanzen praktisch universell ist. Die Hemmung des Enzyms stoppt die Produktion von drei essentiellen Aminosäuren: Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan. EPSPS ist auch in Pilzen und Prokaryoten wie Archaeen und Bakterien vorhanden; Daher kann die Verwendung von GBP Auswirkungen auf die Mikrobiomzusammensetzung von Böden, Pflanzen, Pflanzenfressern und Sekundärverbrauchern haben. Dieser Artikel zielt darauf ab, allgemeine Richtlinien zur Bewertung der Wirkung von GBP auf Mikrobiome von Feldexperimenten bis hin zu bioinformatischen Analysen vorzustellen und einige überprüfbare Hypothesen zu liefern. Zwei Feldexperimente werden vorgestellt, um das GBP an Nichtzielorganismen zu testen. Zunächst werden pflanzenassoziierte Mikroben aus 10 replizierten Kontroll- und GBP-Behandlungsflächen, die den Direktsaatanbau simulieren, beprobt und analysiert. Im zweiten Versuch wurden Proben aus Versuchsflächen entnommen, die entweder mit Geflügelmist befruchtet wurden, der Glyphosatrückstände enthielt, oder mit nicht behandeltem Kontrollmist. Die bioinformatische Analyse von EPSPS-Proteinsequenzen wird verwendet, um die potenzielle Empfindlichkeit von Mikroben gegenüber Glyphosat zu bestimmen. Der erste Schritt bei der Abschätzung der Wirkung von GBP auf Mikrobiome besteht darin, ihre potenzielle Empfindlichkeit gegenüber dem Zielenzym (EPSPS) zu bestimmen. Mikrobielle Sequenzen können entweder aus öffentlichen Repositorien oder mittels PCR-Amplifikation gewonnen werden. In den meisten Feldstudien wurde die Zusammensetzung des Mikrobioms jedoch auf der Grundlage universeller DNA-Marker wie der 16S rRNA und des internen transkribierten Spacers (ITS) bestimmt. In diesen Fällen kann die Sensitivität gegenüber Glyphosat nur durch eine probabilistische Analyse von EPSPS-Sequenzen unter Verwendung eng verwandter Spezies abgeschätzt werden. Die Quantifizierung der potenziellen Empfindlichkeit von Organismen gegenüber Glyphosat, basierend auf dem EPSPS-Enzym, bietet einen robusten Ansatz für weitere Experimente zur Untersuchung von ziel- und nichtzielresistenten Mechanismen.
Der starke Einsatz von Pestiziden in der modernen Landwirtschaft trägt eindeutig wesentlich zum Rückgang der biologischen Vielfaltbei 1. Dieses Papier konzentriert sich auf Glyphosat, da glyphosatbasierte Produkte (GBPs) aufgrund ihrer Effizienz und ihres erschwinglichen Preises zu den weltweit am häufigsten verwendeten Pestiziden gewordensind 2,3. Neben der Abtötung von Unkräutern auf landwirtschaftlichen Feldern werden GBPs häufig im Waldbau, in städtischen Umgebungen und in Hausgärten verwendet. Darüber hinaus wurden sie als ungiftig für Nichtzielorganismen proklamiert, wenn sie gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet werden. Immer mehr neuere Studien haben jedoch gezeigt, dass Rückstände von Glyphosat und seinen Abbauprodukten in Böden zurückgehalten und transportiert werden können, wodurch kaskadierende Auswirkungen auf Nichtzielorganismen haben 4,5,6,7,8 . Die Wirkung von Glyphosat ist nicht nur auf Pflanzen beschränkt - der Shikimatweg ist auch in vielen Pilzen und Prokaryoten vorhanden. Glyphosat zielt auf das Enzym 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase (EPSPS) im Shikimatweg, auch bekannt als aroA9. Dieses Enzym befindet sich im Zentrum des Shikimatweges bei der Synthese der drei essentiellen aromatischen Aminosäuren (Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan) und ist in den meisten Prokaryoten, Pflanzen und Pilzen vorhanden10,11. Einige mikrobielle Spezies haben durch verschiedene Mechanismen, einschließlich Mutationen in den EPSPS-Sequenzen, eine teilweise oder absolute Resistenz gegen Glyphosat entwickelt. Daher wurde vorgeschlagen, dass die Verwendung von GBPs eine direkte Wirkung auf pflanzliche und tierische Mikrobiome, einschließlich des menschlichen Darmmikrobioms12,13,14, haben könnte. Dennoch kann die Verwendung von GBP negative Auswirkungen auf praktisch jede Ökosystemfunktion und -dienstleistung haben, die auf Mikroben und mikrobengestützten Prozessen beruht. Die daraus resultierenden Bedrohungen können biochemische Bodenprozesse, die Bestäubungsbiologie sowie das Wohlergehen von Tieren und Menschen betreffen. Dies erfordert ein umfassenderes Verständnis der Auswirkungen von Glyphosat auf Shikimatwege und Methoden zur Beurteilung der Empfindlichkeit von Mikroben gegenüber Glyphosat.
In diesem Protokoll stellen wir eine Pipeline vor, um die Wirkung von Glyphosat und GBP auf das Mikrobiom zu testen, von Feldexperimenten bis hin zu bioinformatischen Analysen. Wir beschreiben detailliert eine kürzlich veröffentlichte bioinformatische Methode, mit der die potenzielle Empfindlichkeit von Organismen gegenüber Glyphosat12 bestimmt werden kann. Nach Kenntnis der Forscher ist dies das erste und bisher einzige bioinformatische Instrument, um die intrinsische Empfindlichkeit des Enzyms EPSPS gegenüber der aktiven Komponente von GBPs zu bewerten. Diese bioinformatische Methode basiert auf dem Nachweis bekannter Aminosäuremarker im Glyphosat-Zielenzym (EPSPS)12. Die Pipeline ist in fünf Hauptarbeitsphasen unterteilt (Abbildung 1): 1) eine kurze Einführung in zwei Feldexperimente, um die Wirkung von GBPs zu testen, 2) eine kurze Zusammenfassung von Mikrobiomanalysen (16S rRNA, ITS und EPSPS-Gen), 3) Sammeln von EPSPS-Sequenzen aus öffentlichen Repositorien, 4) Bestimmung der potenziellen Empfindlichkeit von Organismen gegenüber Glyphosat und 5) Bewertung der EPSPS-Klasse aus universellen mikrobiellen Markern (16S rRNA und ITS ).
1. Zwei Feldexperimente, um die Wirkung von GBPs zu testen
HINWEIS: Dieses Protokoll präsentiert zwei Beispiele für experimentelle Felddesigns, um die Wirkung von GBPs auf pflanzenassoziierte Mikroben zu testen. Beide Experimente wurden in stillgelegten Feldern ohne vorherige Vorgeschichte von Herbiziden oder landwirtschaftlichen Anwendungen am Botanischen Garten der Universität Turku Ruissalo in Finnland (60º26'N, 22º10'E) durchgeführt. Der Boden besteht aus sandigem Ton mit einem hohen Anteil an organischer Substanz.
2. Mikrobiom-Analysen (16S rRNA-, ITS- und EPSPS-Gen)
HINWEIS: Die meisten Mikrobiomstudien basieren auf der Analyse des 16S rRNA-Gens für bakterielle und interne transkribierte Spacer-Regionen (ITS) für Pilzgemeinschaften unter Verwendung von Sequenzierungstechnologien der nächsten Generation. Daher enthält das Papier keine Informationen über die Art des EPSPS. EPSPS-Sequenzen von Tausenden von Arten sind in öffentlichen Datenspeichern verfügbar (Protokollabschnitt 3) (Abbildung 4).
3. Sammeln von EPSPS-Proteinsequenzen aus öffentlichen Repositorien
4. Algorithmus zur Bestimmung der potenziellen Empfindlichkeit von Organismen gegenüber Glyphosat (EPSPSClass-Webserver: Eingänge, Verarbeitung und Ausgänge)
HINWEIS: Die Forscher haben einen einfach zu bedienenden Server implementiert, der bei 29 frei verfügbar ist, um die Klasse der EPSPS-Proteinsequenzen12,35 zu bestimmen. Der Server benötigt nur eine Eingabe der Proteinsequenz im FASTA-Format, um den Identitätsprozentsatz für jede der EPSPS-Klassen und ihre potenzielle Empfindlichkeit gegenüber Glyphosat zu bestimmen. Darüber hinaus können Benutzer den Webserver nutzen, um ihre eigenen Referenzsequenzen und Aminosäuremarker zu testen. Zunächst richtet der Algorithmus (Abbildung 5) Abfragesequenzen und Referenzsequenzen mithilfe eines Mehrsequenzausrichtungsprogramms35 aus, um Aminosäurepositionen zu bestimmen. Dann sucht es nach dem Vorhandensein von Aminosäuremarkern, um die EPSPS-Klasse (I, II, III oder IV) der Abfragesequenz zu identifizieren.
5. Bewertung der EPSPS-Klasse anhand universeller mikrobieller Marker (16S rRNA und ITS )
HINWEIS: Die meisten Mikrobiom-Studien basieren auf der Analyse der 16S rRNA und/oder ITS36. In solchen Fällen ist es nicht möglich, eine direkte Analyse der EPSPS-Sequenz durchzuführen. Daher ist ein probabilistischer Ansatz zur Abschätzung der potenziellen Empfindlichkeit von Organismen gegenüber Glyphosat notwendig. Diese Analyse ist unkompliziert und liefert eine vernünftige Schätzung der Art der EPSPS-Sequenzen in einem Mikrobiomprojekt. Der Prozess ist in 3 Schritte unterteilt (Abbildung 7 und Abbildung 8):
Ziel dieses Protokolls ist es, eine allgemeine Pipeline von Feldexperimenten bis hin zu bioinformatischen Analysen bereitzustellen, die die potenzielle Empfindlichkeit von Organismen gegenüber dem Herbizid Glyphosat quantifiziert. In Experiment 2 betrug die durchschnittliche Glyphosatkonzentration im Wachtelfutter 164 mg/kg und die durchschnittliche Glyphosatkonzentration der Exkrementproben (Urin und Kot kombiniert) 199 mg/kg. Einstreu von Wachteln, die mit GBP-kontaminiertem Futter gefüttert wurden, hatte im Durchschnitt 158 mg/kg und Kontrolleinstreu 0,17 mg/kg Glyphosat (Tabelle 3). In den Feldversuchen reagierten Pflanzenarten unterschiedlich auf Glyphosatrückstände in den Böden (Abschnitt 1). Die Biomasse von Hafer- und Rübenraps war in Kontrollböden im Vergleich zu GBP-behandelten Böden größer. Fababohnen und Kartoffeln schienen jedoch am Ende der Vegetationsperiode15 von der GBP-Behandlung zu profitieren. Glyphosat in Geflügelmist verringerte das Pflanzenwachstum in Gras (Festuca pratensis) und Erdbeere (Fragaria x vescana) (Abschnitt 1). Die Mikrobiota-Analysen aus den Feldexperimenten sind noch nicht vollständig analysiert und werden hier nicht vorgestellt (Abschnitt 2). Die Ergebnisse dieses Protokolls liefern, wenn sie entweder direkt (wie in den Abschnitten 3 und 4 gezeigt) oder indirekt (Abschnitt 5) gelesen werden, ein Maß für den Anteil potenziell empfindlicher und resistenter Organismen an Glyphosat in einem Datensatz (Abbildung 9). Die Verwendung dieser Methode wurde mit einer Sammlung von EPSPS-Proteinsequenzen aus mikrobiellen Spezies des Kernmikrobioms des menschlichen Darmmikrobioms getestet, die aus öffentlichen Repositorien gewonnen wurden12. In der Studie wurden 890 Stämme der 101 häufigsten Bakterienarten mit der EPSPSClass-Methode analysiert, um den Anteil empfindlicher und resistenter Bakterien zu quantifizieren. Die Ergebnisse zeigten, dass 54% der Spezies im Kernmikrobiom des menschlichen Darms potenziell empfindlich auf Glyphosat12 reagieren. Dieser Trend ist auch in den meisten prokaryotischen Ländern zu beobachten; Darüber hinaus ist bei Eukaryoten (hauptsächlich Pflanzen und Pilze) der Anteil potenziell empfindlicher Arten sogarnoch höher als bei 12. Darüber hinaus haben wir diese Methode verwendet, um Veränderungen der Empfindlichkeit im EPSPS-Protein auf mikroevolutionärer Ebene zu quantifizieren (Abbildung 10) 14. Wir identifizierten Veränderungen des Sensitivitätsstatus in 12 von 32 eng verwandten Gruppen von analysierten Prokaryoten (Tabelle 4)14. Daher kann die kontinuierliche Verwendung der GBPs zu mikrobieller Dysbiose (dh einem Ungleichgewicht empfindlicher und resistenter Bakterienarten) in Pflanzen-, Tier- und Bodenmikrobiomen führen. Darüber hinaus wurde die Hypothese aufgestellt, dass eine Zunahme von Glyphosat-resistenten Bakterien multiresistente Mikrobiome fördern kann 14,41,42. Somit gibt dieses Protokoll Aufschluss über die Interpretation all dieser Szenarien, da die EPSPS-Klassifikationsmethode eine direkte Abschätzung der intrinsischen Empfindlichkeit von Mikrobiomen gegenüber Glyphosat liefert. Da die intrinsische Empfindlichkeit des EPSPS-Proteins gegen Glyphosat phylogenetisch konserviert ist14, ist es möglich, die Ergebnisse aus bestehenden Datensätzen in unbekannte Mikrobiome zu extrapolieren (Abbildung 8).
Abbildung 1: Allgemeine Pipeline Dies ist eine allgemeine Pipeline zur Analyse der GBP-Empfindlichkeit von Feldexperimenten bis hin zur bioinformatischen Analyse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Feldversuch 1 zur Prüfung der Auswirkungen von GBP-Rückständen auf pflanzenassoziierte Mikroben. Das Versuchsfeld besteht aus abwechselnd 10 Kontrollparzellen und 10 GBP-Behandlungsflächen (23 m x 1,5 m) mit 1,5 m Pufferstreifen zwischen den Parzellen. Seit 2014 wurden die GBP-Parzellen zweimal jährlich mit kommerziellem GBP (Glyphosatkonzentration 450 g L-1, Aufwandmenge 6,4 L ha-1 in 5 L Leitungswasser pro Parzelle) und die Kontrollflächen mit der gleichen Menge Leitungswasser ohne Glyphosat behandelt. Die Behandlungen wurden mit einem handbetriebenen Drucktank unter Verwendung einer Kunststoffhaube in der Sprinklerspitze durchgeführt, um GBPs vor der Ausbreitung außerhalb der Behandlungsflächen zu schützen. Nach einer zweiwöchigen Sicherheitsphase nach dem GBP-Antrag wurden Hafer (Avena sativa), Fababohnen (Vicia faba) und Rübenraps (Brassica rapa subsp. oleifera) ausgesät und Kartoffeln (Solanum tuberosum) auf den Parzellen gepflanzt. Mikrobiota-Proben aus den untersuchten Kulturpflanzen, Blättern und Wurzeln wurden seit Beginn des Experiments im Jahr 2014 mehrfach entnommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Feldversuch 2 testete die Folgen von GBP-Rückständen in Gülledünger für zwei mehrjährige Kulturen und die damit verbundenen Mikrobiota. Bettwäsche, die aus einem 12-monatigen Volierenexperiment mit japanischen Wachteln gesammelt wurde, die mit Kontroll- oder GBP-kontaminiertem Futter gefüttert wurden, wurden in einem Feldexperiment als Dünger verwendet. Das Versuchsfeld bestand aus 18 Kontroll- und 18 GBP-Plots (1 m x 1 m), die in einem 6 x 6 Schachbrettraster angeordnet waren. Die Bettwäsche wurde zweimal auf dem Versuchsfeld ausgebreitet, im August 2018 und Mai 2019 (25 L / Grundstück). Die Kontrollflächen wurden mit Einstreu gedüngt, das von Wachteln gesammelt wurde, die mit Kontrollfutter gefüttert wurden, und GBP-Parzellen mit Einstreu von Wachteln, die mit GBP-kontaminiertem Futter gefüttert wurden. Die Glyphosatrückstände in Kontrolleinstreu betrugen 0,17 mg/kg Glyphosat und in GBP-Einstreu betrug die Menge 158 mg/kg Glyphosat. Zwei endophytensymbiotische (E+), zwei endophytenfreie (E-) Festuca pratensis und zwei Fragaria x vescana wurden im September 2018, etwa einen Monat nach der Ausbreitung der ersten Einstreu, pro Parzelle gepflanzt. Messungen der Pflanzenleistung und -fitness sowie Probenahmen für wurzel- und blattassoziierte Mikrobiota wurden während zweier aufeinanderfolgender Vegetationsperioden (2019 & 2020) durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Analyse der mikrobiellen Taxa mittels 16S rRNA-Gen/ITS-Region und Empfindlichkeit von Mikrobiomen gegenüber Glyphosat unter Verwendung des EPSPS-Gens. (A) Analyse von 16S rRNA- oder ITS-Sequenzen zur Identifizierung mikrobieller Taxa. (B) Analyse von EPSPS-Sequenzen zur Identifizierung der Empfindlichkeit von Mikroben gegenüber Glyphosat (GS-Glyphosat-sensitiv/GR-glyphosat-resistent) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Algorithmus zur Identifizierung der Klasse von EPSPS-Proteinsequenzen. Der Input ist eine EPSPS-Proteinsequenz im FASTA-Format. Der Algorithmus führt Vergleiche mit bekannten Aminosäuremarkern in Referenzproteinsequenzen durch, die die potenzielle Empfindlichkeit gegenüber Glyphosat bestimmen. Der Algorithmus wurde auf dem frei zugänglichen Webserver EPSPSClass29 implementiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Grundlegende Ein- und Ausgänge des EPSPSClass-Webservers. (A) Input: eine EPSPS-Proteinsequenz im FASTA-Format. (B) Ausgabe 1 - Identität: Anteil der Aminosäuremarker, die in den Abfragesequenzen (Klassen I-IV) und Motiven (Klasse III) vorhanden sind. (C) Ausgabe 2 - Identität: Ausrichtung der Abfrage- und Referenzsequenzen. (D) Ausgabe 3 - paarweise Ausrichtung der Abfrage- und Referenzsequenzen. (E) EPSPS-Referenzsequenzen: Vibrio cholerae (vcEPSPS, Klasse I), Coxiella burnetii (cbEPSPS, Klasse II), Brevundimonas vesicularis (bvEPSPS , Klasse III), Streptomyces davawensis (sdEPSPS, Klasse IV). (F) Links zur Durchführung von zusätzlichen Blasp-Suchen und Identifizierung von konservierten Domains Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Zugriff auf vorberechnete Datensätze von EPSPS-Sequenzen. Befolgen Sie die Anweisungen in der Abbildung, um auf das vorberechnete Dataset der EPSPS-Sequenzen zuzugreifen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 8: Beispiel für die Abschätzung der potenziellen Sensitivität in Mikrobiomprojekten ohne EPSPS-Sequenzen. Das Beispiel verwendet Werte aus der Datenbank von Alignable Tight Genomic Clusters30, die Sequenzen von prokaryotischen Spezies enthält. Hypothetische Spezies aus einem Mikrobiom-Projekt sind Staphylococcus aureus, Corynebacterium diphtheriae, Campylobacter jejuni, Chlamydia psittaci und Sulfolobus islandicus. Der Sensitivitätswert für Glyphosat wird als Number_Sensitive_Sequences/Total_Number_Of_Sequences berechnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 9: Schema der Interpretation der Ergebnisse aus diesem Protokoll und hypothetische Evolutionsszenarien. (A) In einem Mikrobiom beträgt der Anteil potenzieller Empfindlichkeits- (in grün) und Resistenzbakterien (in rot) etwa 50:50. Schwarze Punkte kennzeichnen mikrobielle Arten, die nicht klassifiziert sind; Daher ist ihre Empfindlichkeit gegenüber Glyphosat unbekannt. In einigen Mikrobiomen ist der Anteil empfindlicher Bakterien etwas höher, wie im menschlichen Darmmikrobiom12. (B) Im Laufe der Zeit kann die Verwendung von Glyphosat zu mikrobieller Dysbiose (d. h. einem Ungleichgewicht im Anteil empfindlicher und resistenter Bakterien) führen, die zu verschiedenen hypothetischen Szenarien führt. (C) Hypothetischer Fall 1 (keine Auswahl): Die Verwendung von Glyphosat hat keinen Einfluss auf das Mikrobiom; So bleibt der Anteil empfindlicher und resistenter Bakterien konstant. (D) Hypothetischer Fall 2: Die Verwendung von Glyphosat entfernt Glyphosat-empfindliche Bakterien aus der Population. Wir spekulieren, dass dieses Szenario dosisabhängig sein könnte. (E) Hypothetischer Fall 3: Selektionsdruck durch die Verwendung von Glyphosat verstärkt Mutationen im EPSPS-Gen, die den Empfindlichkeitsstatus von Bakterien verändern. So wird die gesamte mikrobielle Population resistent gegen Glyphosat. Darüber hinaus könnte es in diesem Szenario zu einer Zunahme multiresistenter Bakterien kommen. (F) Hypothetischer Fall 4: Die Verwendung von Glyphosat verändert die Zusammensetzung bestimmter Bakterienarten und erzeugt ein Ungleichgewicht gegenüber resistenten Bakterien, während einige Bakterienarten unverändert bleiben, möglicherweise aufgrund zusätzlicher resistenter Mechanismen wie Austrittspumpen oder durch Überexpression des EPSPS-Gens 13. Dieses Szenario kann auch zu einer Zunahme von Glyphosat-resistenten Bakterien sowie zu einer Zunahme der bakteriellen Resistenz gegen zusätzliche Antibiotika führen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 10: Verteilung der vorhergesagten Empfindlichkeit gegenüber Glyphosat im Artenbaum. Kreisdiagramme geben den Anteil der Arten an, die mutmaßlich empfindlich (grün) oder resistent (rot) gegen Glyphosat und nicht klassifiziert (schwarz) sind. Diese Figur wurde mit Genehmigung von Rainio et al.14 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 11: Ein- und Ausgänge des EPSPSClass-Webservers zum Testen der benutzereigenen Referenzsequenz. (A) Eingabe 1: Abfragesequenz. (B) Eingang 2: Referenzsequenz. (C) Eingabe 3: Aminosäuremarker in den Referenzsequenzen. (D) Ausgabe: Identität: Anteil der Aminosäuremarker in den Abfragesequenzen (Klasse I-IV und benutzereigene Referenzsequenzen). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Tabelle 1: Liste der Primer für die PCR-Amplifikation des 16S-rRNA-Gens und der ITS-Region in der Mikrobiom-Analyse Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 2: Codes des Enzyms 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase (EPSPS) in verschiedenen Datenbanken Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 3: Durchschnittliche Glyphosatkonzentration Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 4: Zusammenfassende Tabelle des Prozentsatzes der Glyphosatempfindlichen/-resistenten Spezies. Diese Tabelle wurde mit Genehmigung von Rainio et al.14 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 5: Positionen der Aminosäuremarker in den Referenzsequenzen Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Dieses Protokoll enthält allgemeine Anleitungen zur Quantifizierung der Wirkung von GBP auf Mikrobiome auf der Grundlage der Analyse des EPSPS-Proteins. Das Protokoll hat drei wichtige kritische Schritte: (i) Quantifizierung des EPSPS-Proteins aus Mikrobiomdaten. Dieser Schritt ist entscheidend, da EPSPS das direkte Zielenzym des Herbizids ist. Daher können Arten, die eine Kopie des EPSPS-Gens haben, durch die Verwendung von GBP beeinflusst werden. Dennoch können auch Arten, denen eine Kopie des EPSPS-Gens fehlt, durch alternative Nichtzielmechanismen von dem Herbizid beeinflusst werden43,44. (ii) Wenn die Analyse des EPSPS-Gens nicht in das Design der Studie einbezogen wird, ist es möglich, eine gute Schätzung zu erhalten, indem die 16S rRNA (Bakterien) oder ITS (Pilze) analysiert werden. In diesem Fall ist es wichtig, sich auf eine umfassende Referenztabelle zu verlassen (z. B. liefert die ATGC-Datenbank Sequenzen des EPSPS-Proteins von mehreren eng verwandten Spezies). (iii) Das EPSPS-Protein wird in Abhängigkeit von bestimmten Aminosäureresten des aktiven Zentrums des EPSPS in potentiell empfindliche oder glyphosatresistente unterteilt. Mutationen, die eine einzelne Aminosäure betreffen, können diese Klassifizierungjedoch verändern 45 und Übergänge zwischen Klassen können in relativ kurzer Zeit auftreten14.
Die potenzielle Empfindlichkeit von Organismen gegenüber Glyphosat kann durch Referenzgenome, Aminosäuremarker und Sequenzausrichtungen bestimmt werden. (i) Referenzgenome: Das EPSPS-Enzym kann als potentiell empfindlich (Klasse I [alpha oder beta]46,47) oder resistent (Klassen II48,49, III50 und IV 51) gegen Glyphosat eingestuft werden, basierend auf dem Vorhandensein von Aminosäuremarkern und -motiven (im Falle der Klasse III). Diese Aminosäuremarker und -motive basieren auf der Lage von Aminosäureresten im EPSPS-Protein von Vibrio cholerae (vcEPSPS, Klasse I), Coxiella burnetii (cbEPSPS, Klasse II), Brevundimonas vesicularis (bvEPSPS, Klasse III) und Streptomyces davawensis (sdEPSPS, Klasse IV). (ii) Aminosäuremarker: Glyphosat interagiert mit dem EPSPS-Enzym und konkurriert mit Phosphoenolpyruvat (PEP, dem zweiten Substrat des EPSPS-Enzyms)52,53. Bei bestimmten Spezies sorgen kleine Aminosäureveränderungen in der EPSPS-Sequenz für eine höhere Affinität für das PEP und eine Resistenz gegen Glyphosat 12,14,52,54,55. In anderen Sequenzen bindet Glyphosat die EPSPS-Sequenz in einer nicht-inhibitorischen Konformation 45. Obwohl viele resistente 12,14,48,49,52,54,55 und tolerante 56,57 EPSP-Sequenzen gegen Glyphosat beschrieben wurden, ist das derzeitige Klassifizierungssystem für das EPSPS in vier Hauptklassen (I-IV)12 unterteilt (Tabelle 5 ). (iii) Sequenzausrichtungen: Um ein EPSPS-Enzym zu klassifizieren, führten wir paarweise Ausrichtungen mit einem Mehrsequenzausrichtungsprogramm-Standardparameter35- der Abfragesequenz für jede der Referenzsequenzen (vcEPSPS, cbEPSPS, bvEPSPS und sdEPSPS) durch. Diese Ausrichtungen sind notwendig, um die Positionen der Aminosäuremarker in der Abfragesequenz zu identifizieren. Als Ergebnis wird ein Enzym wie beschrieben12-Klasse I, II und/oder IV klassifiziert, basierend auf dem Vorhandensein von Aminosäuremarkern und Motivmarkern basierend auf Klasse III.
Das Protokoll basiert auf vier bekannten Arten von EPSPS: Ein Typ ist empfindlich, der andere drei ist resistent). Etwa 10 % der EPSPS-Sequenzen in Prokaryoten sind jedoch noch nicht klassifiziert (16 % bei Archaeen und 8 % bei Bakterien)12. Daher sollten weitere Forschungen diese Sequenzen analysieren, um die Glyphosatempfindlichkeit zu bestimmen. Der EPSPSClass-Server bietet die Möglichkeit, neue genetische Marker zu testen. Die Identifizierung bekannter Klassen des EPSPS ist einfach, wie in Abschnitt 4.4 gezeigt. und Abbildung 5. Darüber hinaus bietet der Server in den Fällen, in denen Benutzer ihre eigenen Abfrage- und Referenzproteine vergleichen möchten, die Möglichkeit, manuell eine Referenzsequenz und einen Satz von Aminosäuremarkern einzuschließen (Abbildung 11). Diese Option kann verwendet werden, um neue Klassen des EPSPS zu identifizieren sowie andere Herbizide und Zielsequenzen zu testen.
Die Analyse der EPSPS-Klasse wird durch Sequenzanalyse und das Vorhandensein/Fehlen von Aminosäuremarkern bestimmt. Dies ist eine vorläufige Schätzung, die für Hypothesentests in diesem Bereich verwendet werden kann. Aminosäuremarker wurden in der Literatur auf der Grundlage von empirischen und Beobachtungsstudien 46,47,48,49,50,51 bestimmt. Referenzproteinsequenzen zur Bestimmung der EPSPS-Klasse wurden jedoch nur in einer begrenzten Anzahl von Spezies getestet und können gelegentlich die Resistenz gegen Glyphosat nicht erklären. Die Wirkung kompensatorischer Mutationen und EPSPS-assoziierter Domänen (meist in Pilzen) kann auch die Empfindlichkeit gegenüber Glyphosatbeeinflussen 58. Die Analyse dieses Papiers basiert auf vier EPSPS-Klassen. Eine Untersuchung von Bakterien im menschlichen Darmmikrobiom ergab, dass etwa 30% von ihnen nicht klassifiziert waren (dh EPSPS-Proteine aus diesen Spezies gehören zu keiner der bekannten Klassen), und zusätzliche Studien sind erforderlich, um andere EPSPS-Klassen zu identifizieren. Es sollte auch beachtet werden, dass die EPSPS-Proteinsequenz in Bakterien und Pflanzen unidomäne ist, während pilzliche EPSPS-Proteine mehrere Domänen59 enthalten. So kann eine Proteinfaltung in Pilzen zu einer anderen Reaktion des EPSPS-Enzyms auf Glyphosat führen. Darüber hinaus werden zusätzliche Nichtzielmechanismen der Resistenz (z. B. Austrittspumpen und Überexpression des EPSPS-Gens 13) oder der Empfindlichkeit gegenüber Glyphosat (z. B. die Wirkung von Glyphosat auf die mitochondriale Transportkette12) nicht berücksichtigt.
Obwohl GBPs seit 1974 als Herbizid existieren und seit 1991 weit verbreitet sind, ist dies die erste bioinformatische Methode, um die potenzielle Empfindlichkeit von Organismen gegenüber Glyphosat zu bestimmen. Die Methode basiert auf der Identifizierung bekannter Aminosäurereste in der Zielsequenz. Somit liefert unsere Methode eine Basisschätzung der möglichen Wirkung von Glyphosat auf die Spezies. In naher Zukunft sollten neuartige bioinformatische Methoden zusätzliche Klassen des EPSPS-Proteins umfassen, um die potenzielle Empfindlichkeit gegenüber Glyphosat von nicht klassifizierten Sequenzen 12,54,55 zu bestimmen. Da das genaue Verhalten des EPSPS-Enzyms durch einzelne Aminosäureänderungen 12,14,52,54,55 variieren kann, sollten weitere In-silico-Experimente kleine Variationen in der Faltung des EPSPS-Proteins sowie die Wirkung der EPSPS-assoziierten Domänen auf die Proteinstruktur in Pilzen berücksichtigen 58 . Darüber hinaus wurde gezeigt, dass eine Toleranz gegenüber Glyphosat durch Überexpression des EPSPS-Proteins56,57 erzeugt werden kann; So können bioinformatische Analysen, die auf der Verbesserung der Codon-Nutzung60 basieren, verwendet werden, um neuartige EPSPS-Sequenzen zu identifizieren, die die Genexpression maximieren oder minimieren.
Landwirte, Politiker und Entscheidungsträger brauchen dringend ein gründliches Verständnis der Risiken, die mit dem starken Einsatz von Pestiziden verbunden sind. Daher sind sowohl bioinformatische Werkzeuge, die die potenzielle Empfindlichkeit von Organismen gegenüber Pestiziden aufdecken, als auch gut replizierte, randomisierte und feldrealistische experimentelle Studien in verschiedenen Umgebungen erforderlich. Die vorgestellte bioinformatische Methode zur Untersuchung der Empfindlichkeit von Organismen gegenüber Glyphosat kann für andere Pestizide moduliert werden. In ähnlicher Weise können die Methoden der experimentellen Ökologie angewendet werden, um alle damit verbundenen ökologischen Fragen zu untersuchen. Zusammen können die Methoden verwendet werden, um Verluste zwischen Feldbeobachtungen, genomischen Daten und Pestizideinsatz nachzuweisen. Alle vorgestellten Methoden sind für die Risikobewertung von unschätzbarem Wert. Bioinformatische Methoden können beispielsweise zur Überwachung mikrobieller Anpassungen an Agrochemikalien eingesetzt werden und bieten eine quantitative Methode zur Prüfung der potenziellen anderen damit verbundenen Risiken, wie z. B. eine Erhöhung der Resistenz von Krankheitserregern gegen Agrochemikalien, negative Auswirkungen auf Mikroben, die als biologische Bekämpfungsmittel in der integrierten Schädlingsbekämpfung (IPM) verwendet werden, und Antibiotikaresistenzen bei Bakterien.
Interessenkonflikte: keine.
Diese Arbeit wurde von der Akademie von Finnland finanziert (Stipendium Nr. 311077 an Marjo Helander).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939B | To check the concentration and quality of PCR products |
dNTP mix (10 mM each) | ThermoFisher Scientific | R0192 | For PCR reactions |
GoTaq G2 DNA Polymerase kit | Promega | M7848 | PCR buffer and DNA Polymerase for PCR amplification |
Invisorb Spin Plant Mini Kit | INVITEK Molecular | 1037100300 | Genomic DNA extraction from plant tissues |
Ion Chip Minifuge | ThermoFisher Scientific | 4479672 | For targeted sequencing of microbial PCR products |
Ion PGM System | ThermoFisher Scientific | 4462921 | For targeted sequencing of microbial PCR products |
Ion PGM Torrent Server | ThermoFisher Scientific | 4483643 | For targeted sequencing of microbial PCR products |
Pippinprep | SageScience | PIP0001 | For size fractionation of PCR amplicons |
Pressure tank | Berthoud | 102140 | For sprayin glyphosate based products in field |
Primers | Sigma Aldrich | Custom-made | For PCR amplification |
Rotary tiller | Grillo | 984511 | For tilling the soil in experimental plots |
S1000 ThermalCycler | BIO-RAD | 1852196 | For PCR amplification |
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