Wirtschaftliches und effizientes Protokoll zur Isolierung und Kultivierung von aus Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellen aus Mäusen

Zusammenfassung

Hier stellen wir eine wirtschaftliche und effiziente Methode vor, um hochreine dendritische Knochenmarkzellen aus Mäusen nach 7-tägiger Kultur mit 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 zu isolieren und zu erzeugen.

Zusammenfassung

Die Nachfrage nach dendritischen Zellen (DCs) steigt allmählich mit fortschreitender immunbiologischer Forschung. DCs sind jedoch in allen Geweben selten. Die traditionelle Methode zur Isolierung von DCs beinhaltet in erster Linie die Induktion der Knochenmarkdifferenzierung (BM) in DCs durch Injektion großer Dosen (>10 ng / ml) von Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor / Interleukin-4 (GM-CSF / IL-4), was das Verfahren komplex und teuer macht. In diesem Protokoll wurden unter Verwendung aller BM-Zellen, die in 10 ng / mL GM-CSF / IL-4-Medium kultiviert wurden, nach 3-4 Halbkulturaustausch bis zu 2,7 x 10 7 CD11c ^{+ -}Zellen (DCs) pro Maus (zwei Oberschenkelknochen) mit einer Reinheit von 80% -95^% geerntet. Nach 10 Tagen in Kultur nahm die Expression von CD11c, CD80 und MHC II zu, während die Anzahl der Zellen abnahm. Die Anzahl der Zellen erreichte nach 7 Tagen Kultur ihren Höhepunkt. Darüber hinaus dauerte diese Methode nur 10 Minuten, um alle Knochenmarkzellen zu ernten, und eine hohe Anzahl von DCs wurde nach 1 Woche Kultur erhalten.

Einleitung

Dendritische Zellen (DCs) sind die stärksten Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) zur Aktivierung naiver T-Zellen und zur Induktion spezifischer zytotoxischer T-Lymphozyten-Reaktionen (CTL) gegen Infektionskrankheiten, Allergieerkrankungen und Tumorzellen ^1,2,3. DCs sind das primäre Bindeglied zwischen angeborener Immunität und adaptiver Immunität und spielen eine wesentliche Rolle bei der immunologischen Abwehr und der Aufrechterhaltung der Immuntoleranz. In den letzten 40 Jahren haben viele Forscher versucht, die Untergruppen von DCs und ihre Funktionen bei Entzündungen und Immunität zu definieren. Nach diesen Studien entwickeln sich DCs entlang der myeloischen und lymphatischen Linien aus Knochenmarkzellen. Tumorimpfstoffe haben in den letzten Jahren bedeutende Meilensteine erreicht und haben eine vielversprechende Zukunft. Mechanisch modulieren Tumorimpfstoffe die Immunantwort und verhindern das Tumorwachstum, indem sie zytotoxische T-Lymphozyten mit Hilfe von Tumorantigenen aktivieren. Der auf DCs basierende Impfstoff spielt eine wichtige Rolle in der Tumorimmuntherapie und wurde als eine der vielversprechendsten Anti-Tumor-Therapien^{identifiziert 1,4}. Darüber hinaus wurden DCs häufig bei der Erprobung neuer molekular ausgerichteter Medikamente und Immun-Checkpoint-Inhibitoren^{eingesetzt 5}.

Forscher benötigen dringend eine hohe Anzahl von hochreinen DCs, um die Rolle von DCs weiter zu untersuchen. DCs sind jedoch in verschiedenen Geweben und Blut selten und machen nur 1% der Blutzellen bei Menschen und Tieren aus. Die In-vitro-Kultur von dendritischen Knochenmarkzellen (BMDC) ist eine wichtige Methode, um große Mengen an DC-Zellen zu erhalten. In der Zwischenzeit wurde das Lutz-Protokoll zur Erzeugung von DCs aus Knochenmark von Forschern^{häufig verwendet 6}. Obwohl das Protokoll bei der Gewinnung von DC-Zellen wirksam ist, ist es komplex und teuer und beinhaltet die Zugabe hoher Konzentrationen von Zytokinen und die Lyse von roten Blutkörperchen.

In dieser Studie berichten wir über eine Methode zur Isolierung fast aller Knochenmarkzellen aus dem Knochenmark (BM) der Maus und zur Induktion der Differenzierung in BMDC nach 7-9 Tagen Inkubation in vitro, mit einer niedrigeren Konzentration von GM-CSF und IL-4. Dieses Verfahren dauert nur 10 Minuten, um fast alle Knochenmarkzellen zu entnehmen und sie in einem vollständigen Medium zu suspendieren. Kurz gesagt, wir bieten eine effiziente und kostengünstige Kultivierungsmethode für BMDC in dieser Forschung.

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Protokoll

Alle Verfahren wurden vom Nanjing Medical University Animal Care and Use Committee genehmigt.

1. Isolierung des Knochenmarks und Präparation der BM-Zellen

1. Opfern Sie C57BL/6-Mäuse (18-22 g, 6-8 Wochen alt) durch CO₂ -Erstickung. Korrigieren Sie die Maus auf dem Operationstisch der Maus. Desinfizieren Sie die Oberflächen mit 70% Ethanol.
2. Schneiden Sie die Haut des Beins ab, um die Muskeln und die Oberschenkelarterie freizulegen. Klemmen und reißen Sie die Oberschenkelarterie mit zwei Pinzetten ab und ziehen Sie dann das proximale Ende in Richtung Bauch.
   HINWEIS: Schneiden Sie die Oberschenkelarterie nicht direkt ab. Andernfalls verursacht es übermäßige Blutungen und kontaminiert das Sichtfeld.
3. Schneiden Sie alle Muskeln um den Oberschenkelknochen ab.
4. Strecken Sie die unteren Gliedmaßen der Maus langsam nach außen, bis das Geräusch einer Hüftgelenksluxation zu hören ist und der Oberschenkelkopfprolaps sichtbar ist.
5. Trennen Sie die unteren Gliedmaßen vom Körper mit einer Schere entlang der Innenseite des Hüftkopfes.
6. Schneiden Sie die Hinterbeine vom Ende des Kniegelenks ab, um einen freien und vollständigen Femur zu erhalten.
7. Entfernen Sie die am Femur befestigten Muskeln mit Gaze.
   HINWEIS: Zerreißen Sie die Muskeln nicht direkt. Der Oberschenkelknochen von Mäusen ist empfindlich, seine Integrität muss erhalten bleiben.
8. Den Femur für 2-5 min in 75% Alkohol tauchen.

2. Induktionskultur des BMDC

1. Spülen Sie den Restalkohol mit PBS ab. Verwenden Sie eine hämostatische Pinzette, um den mittleren und unteren Teil des Femurs zu klemmen, und einen anderen Satz, um das untere Ende des Femurs zu klemmen. Die hämostatische Pinzette wird seitlich auf den Femur aufgetragen, und der Femur wird von der Epiphysenlinie getrennt.
   HINWEIS: Die epiphysäre Linie ist nicht leicht sichtbar, bis der Femur bricht. Dies und die nächsten Schritte werden alle in einer sterilen Umgebung durchgeführt.
2. Verwenden Sie eine 1-ml-Spritze (Nadel: 0,6 mm x 25 mm), um die Knochenmarkhöhle aus dem Epiphysenlinienbruch zu durchdringen und die Nadel zu drehen, um den Oberschenkelkopf und die Knochenmarkhöhle zu durchdringen. Pulsieren und spülen Sie die Knochenmarkhöhle mit 1 ml des vollständigen Mediums, das GM-CSF/IL-4 enthält, bis der Knochen weiß wird.
   HINWEIS: Komplettes Kulturmedium: 10% FBS, 1% Penicillin-Streptomycin, 55 μM β-Mercaptoethanol, 10 ng/mL GM-CSF und 10 ng/mL IL-4.
3. Resuspendiert alle Zellen in 24 ml vollständigem Kulturmedium (~5 x 10⁵ Zellen/ml). Nach dem Mischen wurde das gesamte Medium auf einer 6-Well-Platte mit 4 ml/Well ausgesät und dann bei 37 °C mit 5% CO 2 für₂ Tage inkubiert.
   HINWEIS: Es ist nicht notwendig, Erythrozyten zu lysen.
4. Ersetzen Sie das gesamte Medium nach 2 Tagen durch ein Medium, das GM-CSF/IL-4⁷ enthält. Ersetzen Sie am vierten, sechsten und achten Tag die Hälfte des Mediums durch das vollständige Medium, das 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 enthält.
   HINWEIS: In diesem Schritt werden suspendierte Zellen wie Erythrozyten und Lymphozyten entfernt.
5. Machen Sie jeden Tag Fotos, um das Zellwachstum aufzuzeichnen. Ernten Sie ab dem sechsten Tag eine Zellquelle pro Tag, um die Zellzahl zu zählen und CD11c, CD80 und MHC II-Expression ^6,7 nachzuweisen.

3. Durchflusszytometrische Detektion der Expression von CD11c, CD80 und MHC II

1. Nach dem Waschen der DCs mit PBS 1 x 10⁶ Zellen in 100 μL FACS-Puffer resuspendieren, 0,5 μg Anti-Maus-CD16/32-Antikörper hinzufügen und 10 Minuten auf Eis inkubieren, um unspezifische Antigenstellen zu blockieren.
2. 1 μg Percp/cy5,5-CD11c, 0,5 μg PE-CD80 und 0,04 μg APC-MHC II-Antikörper zugeben und 30 min auf Eis inkubieren.
3. Bei 1.000 x g für 3 min bei 4 °C zentrifugieren, den Überstand entfernen, 1 ml 4% Paraformaldehyd hinzufügen, für 30 min bei 4 °C fixieren und in 300 μL FACS-Puffer wieder suspendieren.
4. Durchflusszytometrie durchführen.

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Ergebnisse

Die 1 x 10 7-1,7 x 10⁷ Zellen wurden aus zwei Oberschenkelknochen extrahiert und in 24 ml Medium resuspendiert, bevor sie in eine 6-Well-Platte gepflanzt wurden (Abbildung 1A). Nach 2 Tagen wurden nicht adhärente Zellen durch vollständigen Wechsel des Kulturmediums entfernt. Vor dem Wechsel des Mediums wurde eine signifikante Anzahl von suspendierten Zellen beobachtet (Abbildung 1B). Nach 3 Tagen Kultur begannen sich kleinzellige Kolonien...

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Diskussion

Menschen und Mäuse haben unterschiedliche DC-Untergruppen, einschließlich klassischer DCs (cDCs, einschließlich cDC1s und cDC2s), plasmazytoider DCs (pDCs) und Monozyten-abgeleiteter DCs (MoDCs) ^9,10,11. Es ist allgemein anerkannt, dass cDC1s zytotoxische T-Lymphozyten-Reaktionen (CTL) auf intrazelluläre Krankheitserreger und Krebs und cDC2s Immunantworten auf extrazelluläre Krankheitserreger, Parasiten und Allergene reguli...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
β-Mercaptoethanol	Solarbio	M8211
6-well plate	Corning	3516
APC-MHC II	Biolegend	116417
FBS	Gibco	10100
PE-CD80	Biolegend	104707
Penicillin-Streptomycin	Solarbio	P1400
Percp/cy5.5-CD11c	Biolegend	117327
PRMI-1640	Thermo	11875093
Recombinant Mouse GM-CSF	Solarbio	P00184
Recombinant Mouse IL-4	Solarbio	P00196
TruStain Fc PLUS (anti-mouse CD16/32) Antibody	Biolegend	156603