Semi-zielgerichtete Ultra-Hochleistungschromatographie gekoppelt mit massenspektrometrie Analyse von phenolischen Metaboliten im Plasma älterer Erwachsener

Zusammenfassung

Das Ziel dieses Protokolls ist es, phenolische Metaboliten im Plasma mit einer semi-zielgerichteten Chromatographie-Massenspektrometrie-Methode nachzuweisen.

Zusammenfassung

Einer Gruppe von 23 älteren Personen wurden funktionelle Mahlzeiten (ein Getränk und ein Muffin) verabreicht, die speziell zur Vorbeugung von Sarkopenie (altersbedingter Verlust von Muskelmasse) entwickelt wurden. Plasmaproben wurden zu Beginn des Eingriffs und nach 30 Tagen des Verzehrs der funktionellen Mahlzeiten entnommen. Eine semi-zielgerichtete Ultra-Hochleistungschromatographie in Verbindung mit Tandemmasse (UPLC-MS/MS) Analyse wurde durchgeführt, um phenolische Verbindungen und ihre Metaboliten zu identifizieren. Plasmaproteine wurden mit Ethanol ausgefällt und die Proben vor der Injektion in das UPLC-MS/MS-Gerät in der mobilen Phase (1:1 Acetonitril: Wasser) konzentriert und resuspendiert. Die Trennung wurde mit einer _{C18-Umkehrphasensäule} durchgeführt, und Verbindungen wurden anhand ihrer experimentellen Masse, Isotopenverteilung und ihres Fragmentmusters identifiziert. Zinseszinsverläufe wurden mit denen von Datenbanken und der internen Semi-Targeting-Bibliothek verglichen. Vorläufige Ergebnisse zeigten, dass die wichtigsten Metaboliten, die nach der Intervention identifiziert wurden, Phenylessigsäure, Glycitin, 3-Hydroxyphenylvaleriansäure und Gomisin M2 waren.

Einleitung

Sarkopenie ist eine fortschreitende Skeletterkrankung, die mit einem beschleunigten Muskelverlust in der älteren Bevölkerung zusammenhängt. Dieser Zustand erhöht das Sturzrisiko und führt zu eingeschränkten Aktivitäten des täglichen Lebens. Sarkopenie ist bei etwa 5%-10% der Personen über 65 Jahre und etwa 50% der Personen im Alter von 80 Jahren oder älter ^vorhanden1. Für die Behandlung von Sarkopenie wurden keine spezifischen Medikamente zugelassen, daher ist eine Prävention mit körperlicher Aktivität und einer ausgewogenen Ernährung ^wichtig1,2. Ernährungsinterventionen mit speziell formulierten Lebensmitteln, die mit Milchprotein und essentiellen Aminosäuren angereichert sind, haben positive Ergebnisse bei der Prävention von Sarkopenie ^gezeigt2. In anderen Studien haben die Autoren Vitamine und Antioxidantien wie Vitamin E und Isoflavone in die Ernährung aufgenommen, was die Vorteile für den Muskelaufbau an Taille und Hüfte ^erhöht3.

Brosimum alicastrum Sw. (Ramón) ist ein Baum, der in den mexikanischen tropischen Regionen wächst; Es wurde aufgrund seines hohen Nährwerts von ^{Maya-Kulturen konsumiert4.} Es ist eine gute Quelle für Protein, Ballaststoffe, Mineralien und phenolische Antioxidantien wie Chlorogensäure5. Da es zu Pulver gemahlen und in Backwaren verwendet oder in Getränken konsumiert werden kann, haben neuere Studien die Einarbeitung von Ramón-Samenmehl (RSF) in verschiedene Lebensmittel untersucht, um deren Nährwert zu verbessern. Es wurde ein mit RSF ergänztes Getränk mit Cappuccinogeschmack formuliert, das reich an Ballaststoffen war und mehr als 6 g Protein pro Portion enthielt und von den Verbrauchern sehr akzeptiert wurde. Daher wurde es als mögliche Alternative zur Erfüllung spezieller Ernährungsbedürfnisse ^angesehen6. In einer Folgestudie wurde RSF auch verwendet, um einen Muffin und ein neues Getränk zu formulieren, das reich an Protein, Ballaststoffen, Mikronährstoffen und phenolischen Antioxidantien ist. Der Muffin und das Getränk wurden in einer diätetischen Intervention für ältere Menschen verwendet, die beide Produkte 30 Tage lang zweimal täglich konsumierten. Nach diesem Zeitraum verbesserte sich der ernährungsphysiologische und sarkopenische Status der Teilnehmer und der Gesamtphenolgehalt des Plasmas nahm ^zu7. Die Bestimmung der gesamten phenolischen Verbindungen im Plasma wurde jedoch mit einem spektralphotometrischen Verfahren durchgeführt, so dass eine Identifizierung der tatsächlich absorbierten phenolischen Verbindungen nicht möglich war; Darüber hinaus ist diese Methode nicht vollständig spezifisch für phenolische Verbindungen, so dass eine gewisse Überschätzung auftreten ^kann8.

Die Identifizierung und Quantifizierung der phenolischen Verbindungen, die nach dem Verzehr von Lebensmitteln, die reich an diesen Antioxidantien sind, absorbiert werden, ist eine schwierige Aufgabe, aber notwendig, um die biologische Aktivität dieser sekundären Pflanzenstoffe nachzuweisen. Die Bioverfügbarkeit der meisten phenolischen Verbindungen ist gering; Weniger als 5% von ihnen können ohne strukturelle Transformation im Plasma gefunden werden. Phenolische Verbindungen durchlaufen mehrere Biotransformationen wie Methylierung, Sulfonierung oder Glucuronidierung, die von Enterozyten und Hepatozyten durchgeführt ^werden9. Phenolische Verbindungen werden auch von der Mikrobiota in bakterielle Katabolite umgewandelt, die nach der Aufnahme in das Plasma ihre wohltuende Wirkung im Körper entfalten ^können10. Zum Beispiel ist Phenylessigsäure ein Produkt der bakteriellen Umwandlung von Flavonoiden und oligomeren Proanthocyanidinen, die nach dem Cranberry-Verzehr bis zu 40% der Adhäsion von Bakterien (Escherichia coli) in den Harnwegen hemmen ^können11.

Die strukturelle Vielfalt der natürlich vorkommenden phenolischen Verbindungen, die der Vielfalt ihrer Metaboliten und ihrer geringen Bioverfügbarkeit hinzugefügt wird, macht ihre Identifizierung im Plasma noch schwieriger. Die metabolomische Profilerstellung unter Verwendung spektroskopischer Analyseplattformen wie Kernspinresonanz (NMR) und Tandem-Massenspektroskopie (MS/MS) ist wahrscheinlich der beste Ansatz, um dieses Ziel zu erreichen. Leider sind die Geräte nicht leicht zugänglich, und die Entwicklung von Analyseprotokollen ist immer noch ^begrenzt12. Mehrere Studien haben über MS/MS in Verbindung mit einem Trennsystem (z. B. Flüssigkeitschromatographie) als Strategie zur Verringerung der Komplexität von Massenspektren in metabolomischen Studien berichtet. Die jüngste Einführung von UPLC-Trennmethoden (Ultra-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie) hat die Analysezeit verkürzt und die Auflösung und Empfindlichkeit im Vergleich zu herkömmlichen Hochleistungs-Flüssigkeitsprotokollen erhöht, so dass UPLC-MS/MS-Systeme von der analytischen Metabolomik-Community schnell akzeptiert ^wurden13. Auf diese Weise haben einige Studien phenolische Metaboliten untersucht und glucuronidierte Derivate aus Kaffeesäure, Quercetin und Ferulasäure sowie sulfonierte Derivate aus Spritz- und Vanillsäure im Plasma von Personen nach der Aufnahme von Cranberry ^{nachgewiesen14.} Frühere Protokolle haben beabsichtigt, phenolische Verbindungen und phenolische Metaboliten in Bioflüssigkeiten wie Plasma zu finden. Diese Protokolle basierten auf der Identifizierung und Quantifizierung durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), die an einen UV-Vis-Detektor gekoppelt ^war15. Solche Protokolle erfordern jedoch die Verwendung authentischer Standards, um die absolute Identifizierung und genaue Quantifizierung zu bewerten. Eine breite Palette von Studien hat die häufigsten Metaboliten in Biofluiden (sulfonierte, glucuronidierte und methylierte Formen) durch UPLC-MS und UPLC-MS/MS identifiziert; Ein großer Teil der bakteriellen Metaboliten wurde jedoch aufgrund fehlender Datenbanken, die ihre vollständigen Informationen enthalten^{, nicht gemeldet16.} Die Identifizierung von Metaboliten wird durch die Kosten und die kommerzielle Verfügbarkeit von Metabolitenstandards erschwert. Daher kann die beste Strategie eine ungezielte oder semi-zielgerichtete MS/MS-Metabolitenanalyse sein, die sich auf die Verwendung molekularer Merkmalsinformationen (m/z, monoisotopengenaue Masse, Isotopenverteilung und Fragmentierungsmuster) stützt, um die chemische Identität zu bestimmen und sie mit frei verfügbaren Online-Datenbanken zu vergleichen, die Polyphenolmetaboliten enthalten, die nach dem Verbrauch von Polypolyphenol-Richts in Biofluiden identifiziert ^wurden12 . Die wichtigsten Datenbanken, die in UPLC-MS/MS-Studien zur Identifizierung phenolischer Verbindungen und ihrer Metaboliten verwendet werden, sind die Human Metabolome Database (HMDB), die LipidBlast Library, die METLIN Library und andere ergänzende Datenbanken wie PubChem, ChemSpider und Phenol ^Explorer17.

In der vorliegenden Studie wurde eine semi-zielgerichtete UPLC-MS/MS-Methode entwickelt, um die Plasmaproben der Gruppe älterer Personen zu analysieren, die an der RSF-haltigen Muffin- und Getränkekonsumstudie beteiligt ^waren7. Daten aus verschiedenen kostenlosen Online-Datenbanken von Plasmametaboliten wurden gesammelt und in eine spezialisierte Datenbank integriert. Auf diese Datenbank kann die Gerätesoftware automatisch zugreifen, um die polyphenolischen Metaboliten in den fünf Plasmaproben vor und nach der 30-tägigen Ernährungsintervention zu identifizieren. Dies geschieht, um die wichtigsten phenolischen Verbindungen oder ihre Metaboliten zu identifizieren, die aus den speziell formulierten funktionellen Lebensmitteln zur Vorbeugung von Sarkopenie absorbiert werden.

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Protokoll

Die in diesem Protokoll verwendeten Plasmaproben wurden in einer früheren Studie nach allen ethischen Richtlinien gesammelt und von der Institutionellen Ethik- und Bioethikkommission (CIEB-2018-1-37) der Universidad Autónoma de Ciudad Juárez genehmigt. Das vollständige Protokoll für die Extraktion und Identifizierung der phenolischen Verbindungen und Metaboliten im Plasma durch UPLC-MS/MS ist in Abbildung 1 dargestellt.

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Extraktion und Identifizierung von phenolischen Verbindungen und Metaboliten im Plasma mittels der semi-targeted UPLC-MS/MS-Methode. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

1. Probenvorbereitung

1. Lagern Sie die Plasmaproben bis zur Analyse bei -80 °C.
2. Die Plasmaproben bei Raumtemperatur für 15 min auftauen.
   HINWEIS: Die Proben können in ein Wasserbad bei 37 °C gelegt werden, um den Prozess zu beschleunigen (5 min).
3. Geben Sie 200 μL Plasmaprobe in ein 2-ml-Mikroröhrchen und mischen Sie es mit 1.000 μL reinem Ethanol. Vortex der Plasmaprobe für 30 s.
   HINWEIS: Verwenden Sie immer Handschuhe, wenn Sie mit Plasmaproben arbeiten.
4. Zentrifugieren Sie die Probe bei 6.580 x g für 5 min. Nach der Zentrifugation den Überstand mit einer Mikropipette oder Pasteurpipette sammeln und in ein neues Mikroröhrchen geben. Lagern Sie den Überstand bei 4 °C.
5. Mischen Sie das Pellet aus dem vorherigen Schritt mit 1.000 μL 100% Ethanol, wirbeln Sie es für 30 s und zentrifugieren Sie dann bei 6.580 x g für 5 min.
   HINWEIS: Das Pellet ist stark verpackt und muss gut resuspendiert werden, um den Kontakt zwischen der Probe und reinem Ethanol sicherzustellen. Die Verwendung einer Mikropipette zum Spülen des Pellets mit Ethanol wird empfohlen.
6. Nach der Zentrifugation wird der Überstand gesammelt und mit dem zuvor aus Schritt 1.4 erhaltenen Überstand vermischt. in einem 2 ml Mikroröhrchen.
7. Entfernen Sie Ethanol aus der Probe, indem Sie reinen Stickstoff (99,997%) bei 135 psi verwenden. Halten Sie die Nadel 1 cm von der Oberseite des Mikroröhrchens entfernt, um Probenverlust zu vermeiden, und spülen Sie, bis die Probe trocken ist. Es wird keine Wärme benötigt, um das Ethanol zu verdampfen.
   HINWEIS: Der Stickstofffluss muss niedrig sein, um einen Probenverlust zu vermeiden. Sobald das Ethanol getrocknet ist, halten Sie den Stickstofffluss für mindestens 5 Minuten aufrecht, um die Trockenheit der Probe sicherzustellen. Das Protokoll kann an dieser Stelle pausiert werden; Die Proben müssen bei -20 °C gelagert werden. Vermeiden Sie es, die Proben länger als 12 Stunden zu lagern.
8. Resuspendiert die trockenen Proben in 100 μL einer Mischung aus Acetonitril: Wasser in einem Verhältnis von 50:50 (v:v).
9. Filtern Sie die Probe durch eine 0,45 μm Nylon-Spritzenmembran direkt in einen HPLC-Fläschchen-Mikroeinsatz.
   HINWEIS: Die Proben in der Durchstechflasche können vor der Analyse bei -20 °C gelagert werden. Lagern Sie die Proben nicht länger als 8 Stunden. Es wird empfohlen, die Proben kurz nach der Filtration in das UPLC-System zu injizieren.

2. UPLC-MS/MS-Analyse

1. Injizieren Sie 3 μL Probe auf einen UPLC, der mit einer _{C18-Umkehrphasensäule} (50 mm x 2,1 mm; 1,8 μm) ausgestattet ist. Stellen Sie die Temperatur des Autosamplers auf 20 °C und den Säulenthermostat auf 25 °C ein. Injizieren Sie jede Probe dreifach.
2. Verwenden Sie 0,1% (v:v) Ameisensäure in Wasser als Lösungsmittel A und 100% Acetonitril als Lösungsmittel B. Stellen Sie die Durchflussrate auf 0,4 ml/min und ein Gradientenprogramm wie folgt ein: 0-1 min 10% B, 1-4 min 30% B, 4-6 min 38% B, 6-8 min 60% B, 8-8,5 min 60% B, 8,5-9 min 10% B (Tabelle 1).
3. Stellen Sie das Massenspektrometer auf Ionisation im negativen Modus. Stickstoff als Trocknungsgas bei 340 °C und einem Durchfluss von 13 l/min verwenden. Stellen Sie den Verneblerdruck auf 60 psi ein. Stellen Sie die Kapillarspannung auf 4.000 V, die Splitterspannung auf 175 V und die Skimmerspannung auf 65 V ein. Verwenden Sie die Kollisionsenergie bei 20 V (Tabelle 2).
4. Scannen Sie die Massen zwischen 100-1100 Massen-zu-Ladungs-Verhältnis (m/z) und scannen Sie bei MS/MS Massen zwischen 50-1000 m/z (Tabelle 2). Legen Sie die Datenerfassung auf den automatischen MS/MS-Modus fest. Verwenden Sie die folgende Bezugsmasse: 119,036 und 966,0007.

Zeit (min)	Lösungsmittel A (0,1 % Ameisensäure in HPLC-Wasser)	Lösungsmittel B (100 % Acetonitril)
0 bis 1	90	10
1 bis 4	70	30
4 bis 6	62	38
6 bis 8	40	60
8 bis 8,5	40	60
8,5 bis 9	90	10

Tabelle 1: Mobiler Phasengradient, der von UPLC zur Trennung phenolischer Verbindungen verwendet wird.

Ionisationsmodus	Negativ
Trocknungsgas	Stickstoff bei 340 °C, Durchfluss 13 l/min
Verneblerdruck	60 psi
Kapillarspannung	175 V
MS-Scan-Massen	100-1100 m/z
MS/MS-Scanmassen	50-1000 m/z

Tabelle 2: Ionisationsparameter für die MS/MS-Analyse.

3. Datenbankaufbau

1. Suchen Sie in der wissenschaftlichen Literatur nach phenolischen Verbindungen, phenolischen Metaboliten oder anderen interessanten Verbindungen.
2. Öffnen Sie die Datenbankverwaltungssoftware, die im UPLC-System enthalten ist. Wählen Sie Datei | Neue PCDL-| (Personal Database Compound Library) Erstellen Sie eine neue PCDL. Wählen Sie den Typ von PCDL: LC/MS Metabolomics. Legen Sie einen Namen für die PCDL fest. Wählen Sie dann Erstellen aus.
3. Wählen Sie in der Symbolleiste PCDL und dann die Option Bearbeitung zulassen aus. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Verbindungen suchen .
   HINWEIS: Da es sich um eine neue PCDL handelt, sind die Tabellenergebnisse leer. Dies wird sich ändern, sobald neue Verbindungen in die PCDL aufgenommen werden.
   1. Fügen Sie der spezialisierten zusammengesetzten Bibliothek der persönlichen Datenbank Verbindungen hinzu, indem Sie sie aus der allgemeinen Bibliothek des Instruments kopieren. Öffnen Sie die vorhandene Datenbank des Instruments, die in der Datenbankverwaltungssoftware enthalten ist. Klicken Sie auf die Schaltfläche Verbindungen suchen. Geben Sie in der Option Einzelne Suche die Kriterien für die zusammengesetzte Suche ein, um den Zinseszins zu finden.
      HINWEIS: Verbindungen können nach Name, Summenformel, genauer Masse und Retentionszeit gefunden werden.
   2. Wählen Sie in der Tabelle zusammengesetzte Ergebnisse den Zinseszins aus. Wenn Sie mehr als eine Verbindung auswählen möchten, klicken Sie auf die erste Verbindung, halten Sie die STRG-TASTE gedrückt, und klicken Sie dann auf die einzelnen Zinseszinspartner. Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste auf alle markierten Verbindungen und wählen Sie An PCDL anhängen aus.
   3. Suchen Sie im neuen Fenster die spezialisierte persönliche Datenbankdatei, und wählen Sie sie aus. Markieren Sie die Kontrollkästchen Spektren für Verbindungen einschließen, falls vorhanden, und Informationen zur Ionenmobilität für Verbindungen einschließen, falls vorhanden. Klicken Sie auf die Schaltfläche Anhängen. Wählen Sie im neuen Dialogfeld Ja aus, um die neu hinzugefügten Verbindungen zu überprüfen. Wählen Sie Nein aus, um weiter nach weiteren Zinseszinsgruppen zu suchen.
4. Wenn die interessierenden Verbindungen nicht in der allgemeinen Bibliothek des Instruments verfügbar sind, fügen Sie neue Verbindungen manuell hinzu.
   1. Öffnen Sie die spezialisierte persönliche Datenbank. Führen Sie nach dem Öffnen Schritt 3.3 aus. Wählen Sie die Option Verbindungen bearbeiten aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche Neu hinzufügen .
   2. Geben Sie im oberen Bereich des Fensters die Informationen für die neue Verbindung ein. Geben Sie die Formel, den Namen, den IUPAC-Namen, die CAS-Nummer, die Chemspider-ID und andere Identifikatoren ein.
   3. Verwenden Sie die Informationen, die in den kostenlosen Online-Bibliotheken (Chemspider, PubChem und Phenol Explorer) verfügbar sind, um die Informationen für den neuen Zinseszins auszufüllen. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf die Schaltfläche Als neu speichern, um die neuen zusammengesetzten Informationen in der spezialisierten persönlichen Datenbank zu speichern.
      HINWEIS: Wenn Sie Informationen aus freien Bibliotheken hinzufügen, achten Sie darauf, die Verbindungsinformationen ohne das Vorhandensein von Chlorid- oder Jodidionen anzugeben. Dies kann die genaue Masse und die Summenformel der interessierenden Verbindung verändern.
5. Wiederholen Sie den Vorgang mit allen Zinseszinspartnern, um die spezialisierte persönliche Datenbank zu vervollständigen.

4. Datenanalyse

1. Verwenden Sie die qualitative Manager-Software des Instruments, um die in den Proben vorhandenen phenolischen Verbindungen und phenolischen Metaboliten zu identifizieren.
2. Öffnen Sie die Beispieldatei. Wählen Sie im Bedienfeld "Chromatogramm" die Option " Chromatogramme definieren" und extrahieren Sie das Gesamtionenchromatogramm (TIC), das extrahierte Ionenchromatogramm von MS (EIC) und das EIC von MS/MS. Wählen Sie die Option Chromatogramm integrieren aus.
3. Wählen Sie im Bedienfeld "Verbindungen suchen" die Option "Nach Formeloptionen suchen". Wählen Sie im neuen Fenster Formelquelle und dann die Option Datenbank/Bibliothek aus. Suchen Sie die zuvor erstellte persönliche Datenbank und klicken Sie auf Öffnen.
4. Wählen Sie die Option Formelübereinstimmung und legen Sie eine Massenübereinstimmungstoleranz von 5 Teilen pro Million (ppm) fest.
   HINWEIS: Eine andere Übereinstimmungstoleranz der Massen kann auf 10 ppm eingestellt werden. Dieser Unterschied hängt vom verwendeten Massenspektrometer ab.
5. Wählen Sie die Option Negative Ionen und dann nur das Dialogfeld -H aus. Markieren Sie in der Option Ergebnisse die Dialogfelder EIC extrahieren, Bereinigtes Spektrum extrahieren, Rohspektrum extrahieren und Struktur einschließen .
6. Wählen Sie die Option Ergebnisfilter aus. Markieren Sie Warnung, wenn die Punktzahl ist, und legen Sie die Punktzahl auf 80,00% fest. Markieren Sie Nicht übereinstimmen, wenn die Punktzahl ist, und legen Sie die Punktzahl auf 75,00 % fest.
   HINWEIS: Die Übereinstimmungs-/Nichtübereinstimmungswerte können bei Bedarf in niedrigere Werte geändert werden. Dadurch wird die Genauigkeit der Identifizierung verringert.
7. Klicken Sie auf die Schaltfläche Verbindungen nach Formel suchen , um Verbindungen von Interesse in der Probe zu identifizieren.

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Ergebnisse

Der schrittweise Prozess zur Identifizierung phenolischer Metaboliten durch die semi-gezielte UPLC-MS/MS-Analyse von Plasmaproben im negativen Modus ist in Abbildung 2 dargestellt. Zuerst wurde das Gesamtionenchromatogramm (TIC) aus dem Plasmaphenolextrakt (erhalten nach Proteinausfällung der gesamten Plasmaprobe) durch die qualitative Software des Instruments erhalten. Dann wurde das extrahierte Ionenchromatogramm verwendet, und das genaue Massen- und Fragmentierungsm...

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Diskussion

Die Identifizierung und Quantifizierung der bioaktiven Phytochemikalien, die nach dem Verzehr eines Lebensmittels oder Nahrungsergänzungsmittels absorbiert werden, ist entscheidend für den Nachweis und das Verständnis der gesundheitlichen Vorteile dieser Verbindungen und der Lebensmittel, die sie enthalten. In der vorliegenden Arbeit wurde die UPLC-MS/MS-Methode entwickelt, die nur auf die Identifizierung der wichtigsten phenolischen Verbindungen und ihrer Metaboliten abzielt, deren Konzentration im Plasma nach einer ...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile	Tedia	Al1129-001	LC Mass spectrometry
Autosampler	Agilent Technologies	G4226A	1290 Infinity series
C18 reverse phase column	Agilent Technologies	959757-902	Zorbax Eclipse plus C18 2.1x50 mm, 1.8 μm; Rapid resolution HD
Centrifuge	Eppendorf	5452000018	Mini Spin; Rotor F-45-12-11
Column compartment with thermostat	Agilent Technologies	G1316C	1290 Infinity series
Diode Array Detector (UV-Vis)	Agilent Technologies	G4212B	1260 Infinity series
Electrospray ionnization source	Agilent Technologies	G3251B	Dual sprayer ESI source
Formic acid	J.T. Baker	0128-02	Baker reagent, ACS
Mass Hunter Data Acquisition	Agilent Technologies	G3338AA
Mass Hunter Personal Compound Datbase and Library Manager	Agilent Technologies	G3338AA
Mass Hunter Qualitative Analysis	Agilent Technologies	G3338AA
Microcentrifuge tube	Brand	BR780546	Microcentrifuge tube, 2 mL with lid
Pure ethanol	Sigma-Aldrich	E7023-1L	200 proof, for molecular biology
Q-TOF LC/MS	Agilent Technologies	G6530B	6530 Accurate Mass
Quaternary pump	Agilent Technologies	G4204A	1290 Infinity series
Syringe filter	Thermo Scientific	44514-NN	17 mm, 0.45 μm, nylon membrane
Thermostat	Agilent Technologies	G1330B	1290 Infinity series
Vial	Agilent Technologies	8010-0199	Amber, PFTE red silicone 2 mL with screw top and blue caps
Vial insert	Agilent Technologies	5183-2089	Vial insert 200 μL for 2mL standard opening, conical
Water	Tedia	WL2212-001	LC Mass spectrometry