Ein Nagetiermodell der Ross-Operation: Syngene Lungenarterientransplantatimplantation in einer systemischen Position

Zusammenfassung

Wir zeigen, wie man ein murines Modell der Lungenwurzelimplantation in die absteigende Aorta etabliert, um das Ross-Verfahren zu simulieren. Dieses Modell ermöglicht die mittel- / langfristige Bewertung des pulmonalen Autotransplantat-Remodelings in einer systemischen Position und stellt die Grundlage für die Entwicklung therapeutischer Strategien zur Förderung seiner Anpassung dar.

Zusammenfassung

Die Ross-Operation für Aortenklappenerkrankungen hat aufgrund ihrer hervorragenden Langzeitergebnisse wieder neues Interesse geweckt. Dennoch wird beim Einsatz als freistehender Wurzelersatz die mögliche Erweiterung des Lungenautotransplantats und die anschließende Aorteninsuffizienz beschrieben. Mehrere Tiermodelle wurden vorgeschlagen. Diese beschränken sich jedoch in der Regel auf Ex-vivo-Modelle oder In-vivo-Experimente mit relativ teuren Großtiermodellen. In dieser Studie versuchten wir, ein Nagetiermodell der Implantation von Lungenarterientransplantaten (PAG) in einer systemischen Position zu etablieren. Insgesamt wurden 39 erwachsene Lewis-Ratten eingeschlossen. Unmittelbar nach der Euthanasie wurde die Lungenwurzel von einem Spendertier geerntet (n=17). Syngene Empfänger- (n=17) und scheinoperierte (n=5) Ratten wurden sediert und beatmet. In der Empfängergruppe wurde dem PAG eine End-to-End-Anastomose in infrarenaler Bauchaortenposition implantiert. Scheinoperierte Ratten wurden nur einer Transektion und Reanastomose der Aorta unterzogen. Die Tiere wurden mit seriellen Ultraschalluntersuchungen für zwei Monate und postmortalen histologischen Analysen verfolgt. Der mittlere PAG-Durchmesser in der nativen Position betrug 3,20 mm (IQR = 3,18-3,23). Bei der Nachbeobachtung betrug der mediane Durchmesser des PAG 4,03 mm (IQR = 3,74-4,13) nach 1 Woche, 4,07 mm (IQR = 3,80-4,28) nach 1 Monat und 4,27 mm (IQR = 3,90-4,35) nach 2 Monaten (p<0,01). Die maximale systolische Geschwindigkeit betrug 220,07 mm/s (IQR=210,43-246,41) nach 1 Woche, 430,88 mm/s (IQR=375,28-495,56) nach 1 Monat und 373,68 mm/s (IQR=305,78-429,81) nach 2 Monaten (p=0,02) und unterschied sich nicht von der scheinoperierten Gruppe am Ende des Experiments (p=0,5). Die histologische Analyse zeigte keine Anzeichen einer Endothelthrombose. Diese Studie zeigte, dass Nagetiermodelle die Bewertung der langfristigen Anpassung der Lungenwurzel an ein Hochdrucksystem ermöglichen können. Eine systemisch platzierte syngene PAG-Implantation stellt eine einfache und praktikable Plattform für die Entwicklung und Bewertung neuartiger Operationstechniken und medikamentöser Therapien dar, um die Ergebnisse der Ross-Operation weiter zu verbessern.

Einleitung

Die angeborene Aortenklappenstenose ist eine Untergruppe der angeborenen Herzkrankheit, die durch eine Obstruktion des linksventrikulären Traktes gekennzeichnet ist, bei der sich die Läsion auf der Valvularebene befindet. Die Fehlbildung betrifft etwa 0,04-0,38 pro 1000 Lebendgeburten1.

Die verfügbaren Optionen für die Korrektur sind vielfältig, jede mit ihren eigenen Vor- und Nachteilen. Bei ^{Patienten, die} für eine biventrikuläre Korrektur2 geeignet sind, kann der Ansatz auf eine Klappenreparatur (perkutane oder chirurgische Valvulotomie) oder deren Ersatz ^abzielen3. Letzteres ist bevorzugt, wenn die Aortenklappe als unrettbar gilt; Die verfügbaren Optionen sind jedoch für pädiatrische Patienten begrenzt. Tatsächlich sind bioprothetische Klappen aufgrund ihrer frühen Verkalkung nicht für den Aortenersatz in der jungen Bevölkerung ^indiziert4. Auf der anderen Seite ist die Degeneration in mechanischen Klappen wesentlich langsamer, aber diese erfordern eine lebenslange Antikoagulanzientherapie5. Darüber hinaus wird die Haupteinschränkung dieser Prothesen durch das fehlende Wachstumspotenzial dargestellt, das die Patienten für zusätzliche Reinterventionen prädisponiert.

Eine interessante Therapieoption in der pädiatrischen Population ist die Übertragung des pulmonalen Autotransplantats auf die Aortenposition namens "Ross-Operation". In diesem Fall wird die Pulmonalklappe dann durch ein Homotransplantat ersetzt (Abbildung 1)⁶. Dieses Verfahren kann möglicherweise die beste chirurgische Wahl für Kinder darstellen, da das Lungenautotransplantat sein Wachstumspotenzial bewahrt und nicht die Risiken einer lebenslangen Gerinnungshemmungstherapie birgt. Darüber hinaus kann das Ross-Verfahren auch bei jungen Erwachsenen von großem Wert sein, um eine mechanische oder biologische Klappe zu vermeiden, die das Potenzial hat, die beste chirurgische Lösung zu werden.

Die Ergebnisse nach Aortenklappenersatz mit pulmonalem Autotransplantat sind ausgezeichnet, mit einem Überleben von mehr als 98% und guten Langzeitergebnissen7. Literaturstudien berichten von 93% bzw. 90% Freiheit vom Ersatz des Lungenhomotransplantats nach 4 bzw. 12 ^Jahren8.

Die Haupteinschränkung dieses Verfahrens ist die Tendenz des Autotransplantats, sich langfristig zu erweitern, insbesondere wenn es als freistehender Wurzelersatz eingesetzt wird. Dies kann zu einer klappenförmigen Inkompetenz führen, die eine erneute Intervention erfordern kann. Tatsächlich berichtet die bisher am längsten durchgeführte Follow-up-Studie von einer Reoperationsfreiheit für den Autotransplantatersatz von 88% nach 10 Jahren und 75% nach 20 ^Jahren9.

Die Möglichkeit, eine Ross-Operation in einem experimentellen Setting nachzubilden, stellt eine Grundvoraussetzung dar, um den zugrunde liegenden Mechanismus der Anpassung des pulmonalen Autotransplantats an systemische Belastungen zu untersuchen. In der Vergangenheit wurden mehrere Modelle vorgeschlagen. Diese beschränken sich jedoch meist auf Ex-vivo-Experimente oder In-vivo-Tiermodelle mit relativ teuren Großtieren. In dieser Studie versuchten wir, ein Nagetiermodell der Implantation von Lungenarterientransplantaten (PAG) in einer systemischen Position als freistehende Wurzel zu etablieren.

Protokoll

Alle Verfahren wurden vom Tierpflegeausschuss der Universität Padua (OPBA, Protokollnummer Nr. 55/2017) genehmigt und vom italienischen Gesundheitsministerium (Genehmigung Nr. 700/2018-PR) in Übereinstimmung mit der Richtlinie 2010/63/EU der Europäischen Union und dem italienischen Gesetz 26/2014 über die Pflege und Verwendung von Versuchstieren genehmigt.

1. Tierpflege und Versuchsmodell

1. Stellen Sie sicher, dass alle Lewis-Ratten von einem einzigen Unternehmen bezogen werden (Materialtabelle). Halten Sie die Ratten in konventionellen Einrichtungen mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser.
2. Stellen Sie sicher, dass das Gewicht der Ratten zwischen 320 und 400 g für die Empfängergruppe und 200-250 g für die Spendergruppe liegt.

2. Präoperatives Protokoll

HINWEIS: Alle Operationen müssen unter sauberen Bedingungen durchgeführt werden. Verwenden Sie männliche und weibliche erwachsene Lewis-Ratten als Empfänger und Spender, um eine syngene Transplantation durchzuführen.

1. Führen Sie 15 Minuten vor der Operation eine intraperitoneale Injektion von Tramadol (5 mg/kg) durch.
2. Verabreichen Sie unmittelbar vor der Operation eine Einzeldosis intramuskuläres Gentamicin (5 mg/kg).
3. Zur Anästhesieinduktion 4% Sevofluran in 1 l/min Sauerstoff in eine Poly(methylmethacrylat)-Kammer geben, in der das Tier platziert wird. Verwenden Sie zur Aufrechterhaltung der Anästhesie während des gesamten Verfahrens 2,0-2,5% Sevofluran in 1 l / min Sauerstoff.
4. Rasieren Sie das Tier entlang der Mittellinie für 2 cm Breite vom Brustbein bis 1 cm über dem Genitalbereich mit einem Rasiermesser. Dann sterilisieren Sie die Haut mit Jodlösung.
5. Um zu verhindern, dass das Tier nass wird und um eine Wärmeausbreitung während der Operation zu verhindern, bedecken Sie das Tier mit einer transparenten Kunststofffolie.
6. Bewerten Sie das Niveau der Anästhesie vor der Durchführung des Verfahrens, indem Sie das Fehlen einer Reaktion auf einen schädlichen Reiz beurteilen.

3. Geberbetrieb

1. Tier- und Herzpräparation:
   1. Legen Sie das betäubte Tier auf ein Korktablett mit der Schwanzseite zum Chirurgen. Führen Sie einen xipho-schamartigen Schnitt von ca. 5-6 cm durch und ziehen Sie die beiden muskulokutanen Klappen seitlich zurück.
   2. Verabreichen Sie ein Volumen von 1 ml Kochsalzlösung bei 4 °C mit 500 IE Heparin durch die abdominale Hohlvene.
   3. Schneiden Sie nach 1 Minute das Zwerchfell von links nach rechts und führen Sie eine vordere Thorakotomie durch, um das Herz freizulegen.
   4. Kühlen Sie das schlagende Herz ab, indem Sie Kochsalzlösung bei 4 °C tropfen lassen.
   5. Führen Sie eine Perikardektomie und eine Thymektomie durch, um einen vollständigen Überblick über den Aortenbogen zu erhalten. Entfernen Sie das verbleibende Fettgewebe, das die Aorta umgibt.
   6. Schnitt am Bogen, knapp über dem Ursprung der innominaten Arterie; Trennen Sie auch die letztere.
   7. Schneiden Sie die thorakale Vena cava inferior (IVC) ab und führen Sie eine 22 G Kanüle ein, um das Herz mit 20-25 ml Kochsalzlösung bei 4 ° C unter leichtem Druck zu infundieren. Beenden Sie die Durchblutung, wenn das Herz aufhört zu schlagen und der Fluss aus der Aorta klar wurde.
2. PAG explant:
   HINWEIS: Eine genaue Ernte und schonende Handhabung des PAG ist zwingend erforderlich, um eine optimale Implantation beim Empfänger zu erreichen. Berühren Sie es nicht direkt mit Instrumenten, sondern verwenden Sie Stattdessen Wattestäbchen.
   1. Führen Sie eine Ultraschalluntersuchung durch, um den PA-Durchmesser in seiner nativen Position zu beurteilen.
   2. Führen Sie eine Mikrozange unter die hintere Wand des Gefäßes ein und schneiden Sie diese mit einer Mikroschere so nah wie möglich an ihrer Verzweigung, um die Länge des PAG zu maximieren.
   3. Halten Sie die PA vorsichtig mit der ringförmigen Mikrozange fest und trennen Sie sie mit der Mikrofederschere von der rechten Herzkammer. Ernte den PAG, einschließlich einiger rechtsventrikulärer Muskeln.
3. PAG-Vorbereitung:
   1. Legen Sie den PAG auf eine mit kalter Kochsalzlösung angefeuchtete Gaze auf den Operationstisch und untersuchen Sie das Gefäß unter dem Operationsmikroskop.
   2. Schneiden Sie reichlich vorhandenes umgebendes Gewebe ab und lassen Sie nur 1 mm Ventrikelmuskel zurück. Stellen Sie die Länge des Behälters auf 5 mm ein.

4. Implantation der Lungenarterientransplantation (PAG)

1. Vorbereitung des Empfängertieres:
   1. Legen Sie das betäubte Tier auf ein Korktablett mit der Schwanzseite zum Chirurgen.
   2. Führen Sie einen medianen Längsschnitt durch und verwenden Sie zwei Mini-Retraktoren, um den Bauch offen zu halten.
   3. Extrahieren Sie den Darm mit zwei Wattestäbchen und bedecken Sie ihn mit einer mit 39 ° C Kochsalzlösung getränkten Gaze, die die Visualisierung des retroperitonealen Bereichs unter Exposition der infrarenalen Bauchaorta (AA) ermöglicht.
      HINWEIS: Während der Operation ist es wichtig, den Darm gelegentlich mit einer Spritze mit 39 ° C Kochsalzlösung zu befeuchten, um Hypothermie zu verhindern, ein kritischer Zustand, der bei Nagetieren häufig auftritt.
   4. Streifen Sie das hintere parietale Peritoneum zwischen den beiden Nierenarterien und der Beckenverzweigung mit zwei Wattestäbchen ab und entfernen Sie das Fettgewebe um die infrarenale AA. Lassen Sie nur einen kleinen Teil Fett über dem AA, um die Handhabung auf dem Gefäß zu erleichtern.
   5. Trennen Sie den AA vom IVC. Um dieses Verfahren durchzuführen, passieren Sie zunächst eine gekrümmte Pinzette hinter der hinteren Aortenwand und öffnen Sie damit einen Durchgang zwischen AA und IVC. Verwenden Sie dann eine 2-0-Seidennaht, um eine Schlaufe um die AA zu erstellen, um das Gefäß anzuheben und das AA von IVC zu trennen. Ligatieren Sie jede Lendenarterie, die aus der infrarenalen AA entsteht, mit 6/0 Seidennaht und teilen Sie sie.
   6. Drehen Sie das Tier um 90 ° gegen den Uhrzeigersinn und legen Sie den Kopf auf die linke Seite des Bedieners. Die AA lagen nun horizontal im mikroskopischen Feld.
   7. Verwenden Sie zwei Yasargil-Clips, um das infrarenale AA zu klemmen und platzieren Sie sie in einem Abstand von 1,5 cm voneinander. Transektieren Sie die AA in der Mitte zwischen den beiden Clips.
   8. Bewässern Sie die beiden Enden der Gefäße mit Heparin (1 UI / ml) in Kochsalzlösung, um Gerinnsel zu entfernen. Entfernen Sie alle abenteuerlichen Trümmer aus den Gefäßen.
2. PAG-Implantation:
   1. Platzieren Sie den PAG zwischen den beiden Enden, wobei das ventrikuläre Ende in Richtung des kranialen Teils des Tieres verläuft.
   2. Verwenden Sie eine 10-0-Polypropylennaht, um zwei markante Einzelstiche durchzuführen, die das PG mit dem AA verbinden. Führen Sie den Vorgang an beiden Enden des PAG durch, indem Sie die Naht auf gegenüberliegenden Seiten des Gefäßumfangs platzieren.
   3. Führen Sie eine End-to-End-Anastomose zwischen PAG und AA durch, beginnend mit dem distalen Ende. Verwenden Sie eines der beiden Enden der distalen Landmarknaht für die hintere Anastomose mit einer Empfänger-zu-Transplantat-Out-in/In-Out-Sequenz, um eine laufende Naht von etwa sechs Stichen durchzuführen.
   4. Sobald die Naht die proximale Landmarke erreicht hat, führen Sie eine doppelte halbe Kupplung durch, die durch einen quadratischen Knoten mit der Naht und einem der beiden Enden der proximalen Landmarknaht vervollständigt wird. Tragen Sie eine gummibeschlagene Mückenzange auf die Nähte auf, um Traktion zu gewährleisten.
   5. Führen Sie die gleiche Anastomose an der Vorderwand durch. Setzen Sie den gesamten Vorgang am proximalen Ende des PAG fort. Achten Sie besonders darauf, wenn Sie die proximale Anastomose durchführen, um zu vermeiden, dass eine Packungsbeilage in die Nahtlinie aufgenommen wird.
   6. Lassen Sie zuerst den distalen Clip los, um den PAG mit retrogradem Blut (Niederdruckfluss) füllen zu lassen, um die Anastomose zu überprüfen. Reparieren Sie alle Blutleckagen mit einer einzigen Naht. Sobald die distale Anastomose ausgewertet ist, führen Sie das gleiche Verfahren am proximalen Ende durch.
3. Letzte Schritte der Operation am Empfänger:
   1. Beurteilen Sie die Durchgängigkeit des PAG und tragen Sie zwei Streifen Gelatineschwamm über die Nahtlinien auf beiden Seiten des PAG auf (falls erforderlich). Üben Sie sanften Druck für ein paar Sekunden mit zwei Wattestäbchen aus, um die Hämostase zu unterstützen.
   2. Versetzen Sie den Darm in die Bauchhöhle und schließen Sie die Wände mit einer 4/0 Polypropylen-Laufnaht.

5. Scheinoperatives Verfahren

1. Führen Sie eine identische Vorbereitung des Tieres durch, wie zuvor für Empfängerratten dargestellt.
2. Schneiden Sie die infranale AA, auf halbem Weg zwischen dem Ursprung der Nieren- und der Beckenarterien.
3. Nähern Sie sich den beiden Enden der AA mit einer End-to-End-Anastomose, wie zuvor beschrieben. Entfernen Sie die beiden Clips und führen Sie ein genaues Hämostaseverfahren durch.
4. Positionieren Sie den Darm neu und schließen Sie die Bauchdecke in Schichten, wie bei den Empfängertieren.

6. Postoperative Versorgung und Nachsorge

1. Verabreichen Sie warme Kochsalzlösung (5 ml) in das Unterhautgewebe des Rückens des Tieres zur Hydratation. Legen Sie die Ratte unter eine Heizlampe und überwachen Sie sie visuell bis zum Erwachen, was normalerweise bis zu 5 Minuten dauert, nachdem die Narkose gestoppt wurde. Stellen Sie das Tier in einen Käfig mit einer Raumtemperatur von 22-24 °C mit sofortigem und uneingeschränktem Zugang zu Futter und Wasser.
2. Intramuskuläres Tramadol (5 mg/kg) zur postoperativen Analgesie in den ersten 48 h nach der Operation zweimal täglich verabreichen. Danach überwachen Sie regelmäßig den Gesundheitszustand und das Körpergewicht des Empfängers täglich.
3. Follow-up: Führen Sie während des Follow-ups Seriat-Ultraschalluntersuchungen nach einer Woche, einem Monat und zwei Monaten durch, um die PAG-Funktion zu bewerten. Messen Sie während dieser Studien den Gefäßdurchmesser, die maximale systolische Geschwindigkeit (PSV) und die enddiastolische Geschwindigkeit. Messen Sie diese Parameter innerhalb des PAG und auf der Ebene der proximalen und distalen AA.
4. Euthanasieren Sie die Tiere nach zwei Monaten Follow-up durch Anwendung von _CO2 für einige Minuten und explantieren Sie dann das PAG, das einer histopathologischen Analyse unterzogen wird.

Ergebnisse

Insgesamt wurden 39 erwachsene Lewis-Ratten in diese Studie eingeschlossen: 17 Tiere wurden als PAG-Spender, 17 Tiere als Empfänger und 5 als scheinoperierte (Kontrollgruppe) verwendet (Tabelle 1). Männliche Ratten waren 22 (56%) und weibliche 17 (44%); Letztere wurden nur in der Spendergruppe verwendet.

Während der Operation trat kein tödliches Ereignis mit 100% igem Überleben auf. Während der Nachuntersuchung hatten zwei Tiere der Transplantationsgruppe nach 12 bzw. 51...

Diskussion

Der Aortenklappenersatz mit der autologen Lungenwurzel (Ross-Operation) stellt aufgrund des günstigen Profils und des potenziellen Wachstums des Autotransplantats10 eine attraktive Option für die Reparatur der angeborenen Aortenklappenstenose dar. Die Haupteinschränkung dieses Verfahrens ist die mögliche Dilatation der Aorten-Neoklappe, die für die Entwicklung einer langfristigen Regurgitation prädisponiert. Die Möglichkeit, die Veränderungen an der Lungenarterie nach Exposition gegenüber...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride	Monico SpA	AIC 030805105	Two bottles of 100 mL. The cold one (4°C) for flushing the harvesting organ; the warm one (39°C) for moistening, and rehydration of the recipient
7.5% Povidone-Iodine	B Braun	AIC 032151211
Barraquer	Aesculap	FD 232R	Straight micro needle holder for the vascular anastomoses
Castroviejo needle holder	Not available	J 4065	To close the animal
Clip applying forceps	Rudolf Medical	RU 3994-05	For clip application
Cotton swabs	Johnson & Johnson Medical SpA	N/A	Supermarket product. Sterilized
Curved micro jeweller forceps	Rudolf Medical	RU 4240-06	Used to pass sutures underneath the vases.
Depilatory cream	RB healthcare	N/A	Supermarket product
Electrocautery machine	LED SpA	Surton 200
Fine scissors	Rudolf Medical	RU 2422-11	For opening the abdomen (recipient)
Fine-tip curved Vannas micro scissors	Aesculap	OC 497R	Only for preparing the pulmonary root, cut the lumbar vases and the 10/0 Prolene
Fluovac Isoflurane/Halotane Scavanger unit	Harvard Apparatus Ltd	K 017041	Complete of anesthesia machine, anesthesia tubing, induction chamber and scavenger unit with absorbable filter
Gentamycin	MSD Italia Srl	AIC 020891014	Antibiotic. Single dose, 5 mg/kg intramuscular, administered during surgery
Heparin	Pharmatex Italia Srl	AIC 034692044	500 IU into the recipient abdominal vena cava
I.V. Catheter	Smiths Medical Ltd	4036	20G
Insulin Syringe, 1 mL	Fisher Scientific	14-841-33	To inject heparin in the harvesting animal and to flush the sectioned aorta in the recipient
Jeweler bipolar forceps	GIMA SpA	30665	0.25 mm tip. For electrocautery of very small vases
Lewis rats (LEW/HanHsd)	Envigo RMS SRL, San Pietro al Natisone, Udine, Italy	86104M	Male or female, weighing 200-250 g (pulmonary root harvesting animals) and 320-400 g (recipients)
Micro-Mosquito	Rudolf Medical	RU 3121-10	In number of four, with tips covered with silicon tubing. To keep in traction the Prolene suture during anastomosis
Operating microscope	Leica Microsystems	M 400-E	Used with 6x, 10x and 16x in-procedure interchangeable magnifications
Perma-Hand silk 2-0	Johnson & Johnson Medical SpA	C026D	To lift the aorta
Petrolatum ophthalmic ointment	Dechra	NDC 17033-211-38
Prolene 10-0	Johnson & Johnson Medical SpA	W2790	Very fine non-absorbable suture, with a BV75-3 round bodied needle, for the vascular anastomoses
Retractors	Not any	N/A	Two home-made retractors
Ring tip micro forceps	Rudolf Medical	RU 4079-14	For delicate manipulation
Sevoflurane	AbbVie Srl	AIC 031841036	Mixed with oxygen, for inhalatory anesthesia
Spring type micro scissors	Rudolf Medical	RU 2380-14	Straight; 14 cm long
Standard aneurysm clips	Rudolf Medical	RU 3980-12	Two clips (7.5 mm; 180 g; 1.77 N) to close the aorta
Sterile gauze of non-woven fabric material	Luigi Salvadori SpA	26161V	7.5x7.5 cm, four layers
Straight Doyen scissors	Rudolf Medical	RU/1428-16	For use to the donor
Straight micro jeweller forceps	Rudolf Medical	RU 4240-04	10.5 cm long. Used throughout the anastomosis
Syringes	Artsana SpA	N/A	20 mL (for the harvesting animal) and 5 mL (for the recipient). For saline flushing and dipping
TiCron 4-0	Covidien	CV-331	For closing muscles and skin
Tissue forceps V. Mueller	McKesson	CH 6950-009	Used for skin and muscles
Tramadol	SALF SpA	AIC 044718029	Analgesic. Single dose, 5 mg/kg intramuscular
Virgin silk 8-0	Johnson & Johnson Medical SpA	W818	For arterial branch ligation