Kultur von Blasenkrebs-Organoiden als Werkzeuge der Präzisionsmedizin

Zusammenfassung

Patientenabgeleitete Organoide (PDOs) sind ein leistungsfähiges Werkzeug in der translationalen Krebsforschung, das sowohl die genetische als auch die phänotypische Heterogenität der Krankheit und das Ansprechen auf personalisierte Krebstherapien widerspiegelt. Hier wird ein konsolidiertes Protokoll zur Erzeugung von PDOs für primären Blasenkrebs beim Menschen in Vorbereitung auf die Bewertung von phänotypischen Analysen und Arzneimittelreaktionen detailliert beschrieben.

Zusammenfassung

Aktuelle therapeutische In-vitro-Testplattformen haben keine Relevanz für die Tumorpathophysiologie, da sie typischerweise Krebszelllinien verwenden, die als zweidimensionale (2D) Kulturen auf Gewebekulturplastik etabliert sind. Es besteht ein kritischer Bedarf an repräsentativeren Modellen der Tumorkomplexität, die das therapeutische Ansprechen und die Sensitivität genau vorhersagen können. Die Entwicklung einer dreidimensionalen (3D) Ex-vivo-Kultur von patientenabgeleiteten Organoiden (PDOs), die aus frischem Tumorgewebe gewonnen werden, zielt darauf ab, diese Mängel zu beheben. Organoidkulturen können parallel zum routinemäßigen klinischen Management als Tumorsurrogate verwendet werden, um therapeutische Entscheidungen zu treffen, indem potenziell wirksame Interventionen identifiziert und Therapien angezeigt werden, die möglicherweise nutzlos sind. Hier zielt dieses Verfahren darauf ab, Strategien und ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll zu beschreiben, um Blasenkrebs-PDOs aus frischem, lebensfähigem klinischem Gewebe zu etablieren. Unsere gut etablierten, optimierten Protokolle sind praktisch, um 3D-Kulturen für Experimente mit begrenztem und vielfältigem Ausgangsmaterial direkt aus Patienten oder patientenabgeleitetem Xenotransplantat-Tumormaterial (PDX) einzurichten. Dieses Verfahren kann auch von den meisten Labors angewendet werden, die mit Standard-Gewebekulturgeräten ausgestattet sind. Die mit diesem Protokoll erzeugten Organoide können als Ex-vivo-Surrogate verwendet werden, um sowohl die molekularen Mechanismen zu verstehen, die der urologischen Krebspathologie zugrunde liegen, als auch Behandlungen zu bewerten, um das klinische Management zu informieren.

Einleitung

Blasenkrebs ist der am weitesten verbreitete Harnwegskrebs und der zehnthäufigste menschliche Malignitätskarzinom weltweit¹. Es umfasst ein genetisch vielfältiges und phänotypisch komplexes Krankheitsspektrum². Urotheliale nicht-muskel-invasive Formen von Blasenkrebs (NMIBC) sind die häufigsten Blasenkrebsdiagnosen (70%-⁸⁰%), und diese Krebsarten weisen eine beträchtliche biologische Heterogenität und variable klinische Ergebnisse^{auf 2,3,4}. Patienten mit NMIBC haben typischerweise ein hohes Risiko für ein Wiederauftreten der Krankheit (50-70%) und ein Drittel der Krebserkrankungen wird fortschreiten und sich zu signifikant aggressiverem muskelinvasivem Blasenkrebs (MIBC) ^entwickeln2. Obwohl die 5-Jahres-Überlebensraten für NMIBC hoch sind (>90%), müssen sich diese Patienten einem langfristigen klinischen Management^{unterziehen 5}. Auf der anderen Seite wird lokal fortgeschrittene (insektierbare) oder metastasierende MIBC im Allgemeinen als unheilbar^{angesehen 6}. Folglich hat Blasenkrebs eine der höchsten lebenslangen Behandlungskosten in der Krebsbehandlung und ist eine erhebliche Belastung sowohl für den Einzelnen als auch für das Gesundheitssystem ^3,7. Die zugrunde liegenden genetischen Aberrationen bei fortgeschrittenen Erkrankungen machen die therapeutische Behandlung von Blasenkrebs zu einer klinischen Herausforderung, und die therapeutischen Optionen für invasive Urotheltumoren haben sich erst kürzlich seit der Zulassung von Immuntherapien für fortgeschrittene und Hochrisiko-NMIBC ^8,9 verbessert. Derzeit wird die klinische Entscheidungsfindung von konventionellen klinischen und histopathologischen Merkmalen geleitet, obwohl einzelne Blasenkrebstumoren große Unterschiede in der Krankheitsaggressivität und dem Ansprechen auf die Therapie^{zeigen 10}. Es ist dringend notwendig, die Erforschung klinisch nützlicher Modelle zu beschleunigen, um die Vorhersage der individuellen Patientenprognose und die Identifizierung wirksamer Behandlungen zu verbessern.

Dreidimensionale (3D) Organoide zeigen ein großes Potenzial als Tumormodelle aufgrund ihrer Fähigkeit, die intrinsische In-vivo-Architektur und das pharmakogenomische Profil des ursprünglichen Tumors selbst zu organisieren und zu rekapitulieren, und ihrer Fähigkeit, die native zelluläre Funktionalität des ursprünglichen Gewebes, aus dem sie abgeleitet wurden, zu spiegeln^11,12,13 . Obwohl etablierte Blasenkrebs-Zelllinien leicht verfügbar, relativ kostengünstig, skalierbar und einfach zu manipulieren sind, können die In-vitro-Zelllinien das Spektrum verschiedener genetischer und epigenetischer Veränderungen, die bei klinischen Blasenkrebserkrankungen beobachtet wurden, weitgehend nicht nachahmen^12,14 und wurden alle unter 2D-, adhärenten Kulturbedingungen etabliert und aufrechterhalten^. Darüber hinaus weisen Zelllinien, die von primären und metastasierten Blasentumoren stammen, eine signifikante genetische Divergenz vom ursprünglichen Tumormaterial auf. ^8,15

Ein alternativer Ansatz ist die Verwendung gentechnisch veränderter und karzinogeninduzierter Mausmodelle. Während diese Modelle jedoch einige der natürlichen onkogenen Kaskaden rekapitulieren, die an der menschlichen Neoplasie beteiligt sind (überprüft in Refs 16, ^{17, 18}), fehlt es ihnen an Tumorheterogenität, sie sind teuer, stellen invasiven und metastasierenden Blasenkrebs schlecht dar und sind nicht für schnelle Medikamententests geeignet, da die Entwicklung von Tumoren viele Monate dauern kann ^14,19 . Von Patienten abgeleitete Krebsmodelle (einschließlich Organoide, bedingt umprogrammierte primäre Zellkultur und Xenotransplantate) bieten unschätzbare Möglichkeiten, die Auswirkungen der medikamentösen Behandlung vor der klinischen Behandlung^{zu verstehen 20}. Trotzdem verwenden nur wenige Gruppen routinemäßig diese patientenproximalen Modelle, da der Zugang zu frischem primärem Patientengewebe begrenzt ist und eine umfassende Optimierung erforderlich ist, um reproduzierbare Bedingungen für die Kultur von Patienten abgeleitete Organoide (PDO) zu erzeugen. In einer In-vivo-Umgebung können onkogene Zellen mit verschiedenen Zusammensetzungen der umgebenden Bestandteile interagieren und kommunizieren, einschließlich Stromazellen, gewebeinfiltrierende Immunzellen und Matrix¹². In ähnlicher Weise kann bei PDOs, die in einem 3D-Format gezüchtet werden, die Zell-/Matrixkomplexität angepasst werden, um andere relevante Komponenten einzubeziehen. PDOs können schnell erzeugt werden und können oft extensiv durchgelassen oder für die spätere Verwendung kryokonserviert werden, obwohl sie eine begrenzte Lebensdauer^{von 21,22,23} haben. Die Pharmakodynamik (d. h. das Ansprechen auf ein Arzneimittel) kann anhand mehrerer Auslesungen bewertet werden, einschließlich der Organoidlebensfähigkeit und -morphologie sowie der Charakterisierung von immunhistochemischen Zielen oder transkriptionellen Veränderungen.

Hier werden die Verfahren zur Etablierung von Blasenkrebs-Organoiden aus Patientenmaterial beschrieben, das bei der transurethralen Resektion von Blasentumoren (TURBT) oder der chirurgischen Entfernung der Blase (radikale Zystektomie) gesammelt wurde. Die Methode zur Generierung von g.U. wird unter Verwendung leicht verfügbarer nasser Labormaterialien und -werkzeuge veranschaulicht. Endpunkte sind Veränderungen der morphologischen Eigenschaften und der Lebensfähigkeit der Zellen. Diese wurden mittels Fluoreszenzmikroskopie, In-vitro-Lebensfähigkeit (metabolische und Zellmembranintegrität) und histopathologische Analyse gemessen. Abbildung 1 zeigt den Workflow zur Etablierung menschlicher Blasenkrebs-PDOs aus klinischem Material, das während einer elektiven Operation erhalten wurde.

Protokoll

Die Patienten haben dieser Studie zugestimmt, nachdem sie im Rahmen des Urologie-Teams am Princess Alexandra Hospital, Brisbane, Australien, aufgenommen wurden. Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den Grundsätzen der Erklärung von Helsinki und innerhalb ethischer und institutioneller Richtlinien (Ethiknummer HREC/05/QPAH/95, QUT 1000001165) durchgeführt.

HINWEIS: Als Zulassungskriterien waren die Patienten im Alter von ≥ 18 Jahren mit Krebs und in der Lage, zu verstehen und ihre Zustimmung zu geben. Diejenigen, die nicht in der Lage waren, eine Einwilligung nach Aufklärung zu geben, wurden ausgeschlossen. Personen, die eine andere Hauptsprache als Englisch hatten, wurden ausgeschlossen, da die Bereitstellung von Dolmetschern aus logistischen und budgetären Gründen nicht möglich war. Ebenfalls ausgeschlossen waren Patienten, deren Tumore für eine Biopsie nicht zugänglich waren oder nach einer Routinepathologie wahrscheinlich nicht in ausreichender Menge verfügbar waren.

1. Vorbereitung des Organoidmediums

HINWEIS: Menschliches Blasenkrebs-Organoid-Medium erfordert Wachstumsfaktoren, die das Überleben, das Wachstum und die kontinuierliche Expansion von Organoiden aus dissoziiertem klinischem Material unterstützen (Tabelle 1). Ausführliche Informationen zu jeder in diesem Verfahren verwendeten Ergänzung finden Sie in der Materialtabelle.

1. Gefrorene Zutaten auf Eis oder im Kühlschrank bei 2-8 °C auftauen. Vermeiden Sie wiederholte Frost-/Tauzyklen und arbeiten Sie mit gefrorenen Aliquots (gelagert bei -20 °C).
2. Basalmedium: Bereiten Sie das Basalmedium vor, indem Sie das modifizierte Adlermedium von Dulbecco/Ham's F-12 (adDMEM/F12) mit HEPES (10 mM) und Glutamin (2 mM) ergänzen. Dies wird auch als Transportmedium und bei organoiden Waschschritten verwendet.
   HINWEIS: Advanced DMEM/F-12 wird als basales Medium verwendet, um die Expansion von Organoiden in Gegenwart von begrenztem Serum zu unterstützen; Es erfordert jedoch eine Supplementierung mit HEPES und L-Glutamin.
3. Zentrifugieren Sie kurz den Fibroblasten-Wachstumsfaktor 10 (FGF-10), den Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF-2), den Epithelwachstumsfaktor (EGF), SB202190, das Prostaglandin E2 (PGE2) und A 83-01 vor dem Öffnen, um sicherzustellen, dass sich die Komponenten am Boden der Durchstechflasche befinden.
4. Vollständiges Organoidmedium: Ergänzung des basalen Mediums mit humanem Noggin- und R-Spondin-1-konditioniertem Medium in einer Endkonzentration von 5% v/v, humanem EGF (50 ng/ml), humanem FGF-2 (5 ng/ml), humanem FGF-10 (20 ng/ml), A 83-01 (500 nM), SB202190 (10 μM), B27 (1x), Nicotinamid (10 mM), N-Acetylcystein (1,25 mM), Y-27632 (10 μM), PGE2 (1 μM) und einer Breitbandantibiotikabildung in der vom Hersteller angegebenen Konzentration.
5. Lagern Sie Organoidmedien bei 4 °C im Dunkeln und verwenden Sie sie innerhalb von 2 Wochen (maximal 1 Monat). Nicht einfrieren. Vermeiden Sie eine längere Exposition gegenüber Lichtquellen.
   HINWEIS: Das Organoidmedium wird serumfrei hergestellt; Serum und Penicillin/Streptomycin könnten jedoch bei Bedarf von Benutzer zu Benutzer ergänzt werden.

2. Einen Tag vor dem Verfahren, wie in 3 beschrieben.

1. Auftauwachstumsfaktor reduzierte Basalmembran (BME; siehe Materialtabelle) über Nacht für mindestens 12 h, bevor sie in einem 4 °C Kühlschrank oder Kühlraum verwendet werden. Geben Sie BME bei Bedarf in 1 ml Aliquots in einem 1,5 ml Polypropylen-Einwegröhrchen ab, um Frost-Tau-Zyklen zu vermeiden.
2. Legen Sie gefilterte Pipettenspitzen in einen 4 ° C-Kühlschrank oder Kühlraum.
   HINWEIS: Dieser Abschnitt bezieht sich auf Pipettenspitzen, die bei der Handhabung von BME verwendet werden, um eine vorzeitige Polymerisation zu verhindern und die Beschichtung von BME auf der Oberfläche der Spitzen zu reduzieren.
3. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Geräte, die für den Eingriff erforderlich sind.

3. Generierung von Blasentumor-Organoiden

HINWEIS: Dies ist ein erster Schritt für die Etablierung von PDO-Mitteln aus Primärpatiententumoren. Dieses Verfahren ist für Blasenkrebsgewebe aus Methoden angepasst, die von Gao et ^al.24 festgelegt wurden.

1. Verwenden Sie eine Biohazard-Haube der Klasse II, um die Probe vorzubereiten. Rufen Sie trockenes und nasses Eis auf und drucken Sie das Verarbeitungsblatt für Patientenproben (Supplemental File).
2. Rufen Sie das Forschungspersonal in den Operationssaal, wenn die chirurgische Resektion fast abgeschlossen ist.
   HINWEIS: Bestätigen Sie, dass der Patient die Zulassungskriterien erfüllt und die Einverständniserklärung des Teilnehmers unterschrieben hat. Gewebe wird nur dann für die Forschung bereitgestellt, wenn es die Anforderungen für die klinische histopathologische Beurteilung übersteigt.
3. Sammeln Sie eine frische makroskopisch lebensfähige Tumorprobe aus der Operation. Stellen Sie sicher, dass die Probe während des Transports in ein Transportmedium (entweder 1x adDMEM/F12 oder 1x Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS)) in ein steriles 50 ml konisches Röhrchen oder Urinprobenglas eingetaucht wird.
   HINWEIS: In einigen klinischen Zentren muss Gewebe möglicherweise in ein Pathologielabor transportiert werden, um für die Forschung zugewiesen zu werden. Unter diesen Umständen wird empfohlen, dem Transportmedium Antibiotika und Antimykotika zuzusetzen. Gewebe kann bei 4 °C in basalem Medium für bis zu 24 h nach der Operation gelagert werden und dennoch lebensfähige Organoidkulturen erzeugen.
4. Notieren Sie Probendetails, einschließlich Gewebegewicht (g oder mg), Probenbeschreibung und Details zu Blut- und Urinproben auf dem Patientenprobenverarbeitungsblatt (Zusatzakte).
5. Entfernen Sie vorsichtig das Transportmedium und ersetzen Sie es durch 10 ml Basalmedien. Lassen Sie das Tumorgewebe durch Schwerkraft absetzen.
   HINWEIS: Transportmedium gilt als klinischer Abfall und muss in einem entsprechend gekennzeichneten Abfallbehälter in einer angemessenen Menge Dekontaminationslösung gesammelt werden. Sobald die Flüssigkeit chemisch dekontaminiert wurde, kann sie gemäß den institutionellen Richtlinien für gefährliche Abfälle entsorgt werden.
6. Entfernen Sie das Tumorgewebe mit einer Pinzette und legen Sie es in eine sterile 90 mm Petrischale (Abbildung 2A). Notieren Sie das Gewicht des Gewebes in mg oder g auf dem klinischen Probenverarbeitungsblatt und dem Dissektionsgitter (Abbildung 2B).
7. Entfernen Sie nicht krebsartiges Gewebe (einschließlich Fettgewebe) und makroskopisch sichtbare nekrotische Regionen mit steriler Pinzette und Einweg-Skalpellklinge, die am Skalpellgriff montiert ist (Abbildung 2C). Tumorstücke 1-2 mal mit kaltem 1x DPBS waschen. Sammeln Sie die Tumorstücke und geben Sie sie in eine neue sterile 90 mm Petrischale.
   HINWEIS: Da Skalpellklingen scharf sind, seien Sie vorsichtig, wenn Sie manuell schneiden. Tumorbenachbartes Fettgewebe kann durch deutlich weiche, gallertartige, blasse Bereiche identifiziert werden, die unmittelbar an den visuellen Tumorumfang angrenzen. Makroskopisches Fettgewebe und fokal dunkle Regionen, die Bereiche der Nekrose darstellen, erfordern ein persönliches Urteilsvermögen, wenn sie von einer Exzisionsblasentumorbiopsie getrennt werden.
8. Machen Sie ein Foto, zeichnen Sie ein Diagramm des Gewebes und planen Sie die Gewebedissektion auf einem klinischen Verarbeitungsraster (Abbildung 2B und Abbildung 2C).
   HINWEIS: Es ist wichtig, eine visuelle Aufzeichnung und grobe Skizze der einzelnen makroskopischen Tumormerkmale und der Dissektion für jeden spezifischen Fall zu führen.
9. Zerlegen Sie Tumorgewebestücke und ordnen Sie sie für histopathologische (Abbildung 2D) und molekulare Analysen (Abbildung 2E) zu.
   1. Für histologische Analysen: Geben Sie etwa 50 mg Tumorgewebe in eine markierte Einweg-Histologiekassette (Abbildung 2D). Tauchen Sie die Histologiekassette in einen Behälter mit 5x bis 10x Volumen von 10% neutralem gepuffertem Formalin (NBF). Inkubieren Sie über Nacht bei RT.
   2. Entfernen Sie 10% NBF und ersetzen Sie es am nächsten Tag durch 70% (w / w) Ethanol für die Lagerung bei 4 ° C, bis das Gewebe mit dem routinemäßigen Gewebeverarbeitungsprotokoll verarbeitet werden kann
   3. Für molekulare Analysen: Mindestens ein 1-3 mm³ Tumorstück in einem RNase/DNase-freien 1,5 ml Kryo mit flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -80 °C lagern (Abbildung 2E).
10. 5 ml Organoidmedium (Tabelle 1) werden in die 90-mm-Petrischale gegeben, die das/die verbleibende(n) Tumorstück(e) enthält.
11. Zerkleinern Sie das Gewebe mechanisch so fein wie möglich (0,5-1 mm³ Stück oder kleiner) mit einer sterilen #10 Skalpellklinge.
    HINWEIS: Größere Fragmente oder ganze Gewebestücke (>3 mm³) benötigen erheblich länger, um verdaut zu werden, und verringern die Lebensfähigkeit der Probe. Lassen Sie den obigen Schritt weg, wenn das Gewebe disaggregiert ist und die Fragmente klein genug sind, um mit einer serologischen 5-ml-Pipettenspitze zu pipettieren.
12. Übertragen Sie fein gehacktes Gewebe in einen 50 ml konischen Schlauch und fügen Sie 4 ml Organoidmedium, 1 ml 10x Kollagenase / Hyaluronidas und 0,1 mg / ml Desoxyribonuklease 1 (DNase 1) hinzu, um Zellverklumpungen zu vermeiden.
    HINWEIS: Enzymlösung sollte jedes Mal frisch zubereitet werden. Erhöhen Sie das Volumen des Mediums auf etwa das 10-fache der sichtbaren Menge der Tumorfragmente für große Proben.
13. Inkubieren Sie das gehackte Tumorgewebe und die Enzymlösung für 1-2 h auf einem Orbitalschüttler oder Rotator (150 U / min) in einem Inkubator (37 ° C, 5% CO₂), um Fragmente in eine Zellsuspension zu dissoziieren und Kollagen abzubauen. Dies kann mit einer histologischen Analyse überprüft werden (Abbildung 3A).
    HINWEIS: Wenn die Gewebemenge groß ist oder nach 1-1,5 h keine offensichtliche Dissoziation beobachtet wird, erhöhen Sie die Inkubationszeit und überprüfen Sie den Grad der Dissoziation alle 30 Minuten. Der Zeitpunkt für diesen Schritt hängt von der Probe ab und muss jedes Mal empirisch bestimmt werden. Eine merklich klarere Lösung mit für das Auge nicht erkennbaren Gewebefragmenten (oder sehr wenigen Fragmenten) weist auf eine erfolgreiche Verdauung hin.
14. Beenden Sie den Aufschluss mit der Zugabe von 2x Volumen (20 ml) Basalmedium zur Probe.
15. Die Probe bei 261 x g für 5 min bei Raumtemperatur (RT) zentrifugieren, absaugen und den Überstand verwerfen.
16. Um kontaminierende rote Blutkörperchen (RBCs) zu lysieren, resuspendieren Sie das aus dem obigen Schritt erhaltene Pellet in 5 ml Ammoniumchlorid-Kalium (ACK) -Puffer. Inkubieren Sie die Tube bei RT für 3 min oder bis die vollständige Lyse der RBCs gesehen wird (Suspension wird deutlich).
    HINWEIS: Wenn RBCs nicht als kleiner roter Klumpen im Pellet beobachtet werden, kann dieser Schritt weggelassen werden.
17. Geben Sie 20 ml des Basalmediums in die Röhre. Zentrifen Sie das Röhrchen bei 261 x g für 5 min bei RT und saugen Sie den Überstand ab.
18. In diesem Schritt ein 10 ml Aliquot aus 2x und 1x Organoidmedium in ein 37 °C warmes Wasserbad geben.
19. Filtern Sie die Probe durch ein vornasses reversibles 100-μm-Sieb in ein neues 50-ml-Rohr, um großes unlösliches Material zu entfernen.
    HINWEIS: Großes, unverdautes Material (>100 μm), das vom Filter gesammelt wird, kann Zellen von Interesse enthalten und kann in einer 90-mm-Petrischale oder einer 6-Well-Zellkulturplatte in Organoidmedium kultiviert werden, um 2D-Kulturen abzuleiten (Abbildung 1 (Schritt 5) und Abbildung 3B).
20. Filtern Sie das Eluat durch ein vornasses reversibles 37-μm-Sieb, um einzelne Zellen und kleine Cluster für die Einzelzell- und Immunzellisolierung zu sammeln (Tube 37-1; Abbildung 1 (Schritt 6) und Abbildung 3B).
    HINWEIS: Die Ausbeute an Tumorzellen während dieses Schrittes kann erhöht werden, indem die gefilterte Zellsuspension erneut durch das Sieb geleitet wird.
21. Kehren Sie das 37-μm-Sieb um und verwenden Sie 10 ml Basalmedien, um kleine und mittelgroße Cluster (37-100 μm) (Röhrchen 70-1; Abbildung 3B).
22. Füllen Sie jede der neuen 50-ml-Röhren (Röhren 70-1 und 37-1) mit DPBS auf 40 ml auf. Zentrifen Sie die Suspension bei 261 x g für 5 min bei RT. Aspirieren und verwerfen Sie den Überstand.
23. Fügen Sie 10 ml Basalmedien in Tube 37-1 hinzu und zählen Sie die Zellen mit Trypanblau-Ausschlussfarbstoff und einem automatisierten Zellzähler (gemäß den Angaben des Herstellers). Bestimmen Sie die Zellzahl und Lebensfähigkeit von Zellen.
24. Zentrifugieren Sie den Rest der Probe bei 261 x g für 5 min bei RT. Saugen Sie das Medium ab und ersetzen Sie es durch Zellgefrierlösung oder Basalmedien, die 10% fetales Rinderserum (FBS), 1% Penicillin/Streptomycin und 10% Dimethylsulfoxid (DMSO) enthalten.
25. Proben in 1,5 ml Kryovitale geben und in einem Zellgefrierbehälter aufbewahren. Den Behälter sofort in einen Gefrierschrank von -80 °C geben, um eine optimale Abkühlrate zu erzielen. Nach der Nachtlagerung im Gefrierschrank bei -80 °C werden die Kryofrüchte zur Langzeitlagerung in eine kryogene Flüssigkeits- oder Luftphasenlagerung (-196 °C) überführt.
26. Resuspendieren Sie Zellen aus Röhrchen 70-1 mit 500 μL vorerwärmtem 2x-Organoidmedium.
    HINWEIS: Die Aussaatdichte muss für eine erfolgreiche Organoidvermehrung hoch sein. Das Volumen des Organoidmediums und anschließend der BME sollte empirisch an der Anzahl der aus dem Filtrationsschritt isolierten Zellen verändert werden. Dieser Schritt bietet einen relevanten Ausgangspunkt basierend auf Studien in unserem Labor.
27. Fügen Sie BME zu den Zellen (im Verhältnis 1: 1 mit 2x Organoidmedium) mit eiskalten P1000 sterilen Filterpipettenspitzen hinzu und mischen Sie vorsichtig, um die Zellen zu suspendieren. Pipettieren Sie schnell und vorsichtig 100 μL rekonstituierte Zellen / BME-Mischung in Vertiefungen einer extrem niedrigen Befestigung mit 96-Well-Platte mit flachem Boden. Legen Sie die 96-Well-Platte in einen Inkubator (37 °C, 5% CO₂) für 20-30 Minuten, um zu erstarren.
28. Fügen Sie 1: 2 Verhältnis von 1x Organoidmedium auf BME-Zellsuspension hinzu, abhängig vom empirisch bewerteten Volumen. Fügen Sie im relevanten Ausgangspunkt 50 μL 1x organoide Medienmedien zu 100 μL rekonstituierter Zellen / BME-Mischung hinzu.
29. Legen Sie die 96-Well-Platte in einen Inkubator (37 °C, 5% CO₂) für 20 Minuten, um sich auszugleichen.
30. Nehmen Sie die Zellkulturplatte aus dem Inkubator und montieren Sie sie auf einem Probenhalter auf dem Tisch eines Mikroskops. Beurteilen Sie Organoide visuell unter Phasenkontrast- oder Hellfeldeinstellungen.
    HINWEIS: Die Bilder werden am besten mit einem invertierten Phasenkontrastmikroskop aufgenommen, das mit einer DIC-Optik (Differential Interference), einer Digitalkamera und der zugehörigen Software ausgestattet ist, um die Bildung sphärischer PDOs in Vorbereitung auf die Endpunktanalyse zu beobachten.
    1. Wenn verschiedene Cluster sichtbar sind, platzieren Sie die Zellkulturplatte in einer elektronisch beheizten Mikroskopkammer auf der Bühne (37 °C, 5% CO₂) für die Live-Cell-Bildgebung über die ersten 24-72 h.
    2. Stellen Sie sicher, dass der flexible beheizte Kragen an der Linse befestigt ist, um die thermische Drift zu reduzieren und der Luftbefeuchter mit dH₂O gefüllt ist.
    3. Führen Sie die erste Bildgebung mit einem 4-fachen oder 10-fachen Objektiv (N.A. 0,30, B.D. 15,2 mm) durch. Zeitraffer alle 5-10 Minuten bei der Phasenkontrasteinstellung.
    4. Überprüfen Sie die erfolgreiche Isolierung, die durch das Auftreten von >10 selbstorganisierenden Organoiden pro Bohrung nach einer Periode von 24-72 h gekennzeichnet ist.
    5. Lassen Sie die Kulturen bis zu zwei Wochen weiterlaufen, wenn die Organoidzahlen niedrig sind (Abbildung 3C).
31. Füllen Sie das Medium alle 2-3 Tage mit 50 μL vorerwärmtem Organoidmedium auf, um erschöpfte Wachstumsfaktoren und das Gesamtvolumen wieder aufzufüllen.
32. Erfassen Sie Bilder (wie in Schritt 3.30 beschrieben) an den Tagen 1, 2 und 3 (Zeitrafferreihen) und an den Tagen 5, 7 und 10 vor dem Passieren (falls zutreffend).
    HINWEIS: Organoide (beobachtet als im Allgemeinen runde Strukturen, bei denen Sie die Kanten einzelner Zellen nicht sehen können) werden typischerweise 7-10 Tage nach dem Aufbau durchlaufen, abhängig vom Erfolg der Isolierung. Vor oder nach dem Passieren können Organoide bis zu 6 Tage lang mit Zytostatika oder Therapeutika behandelt und die Arzneimittelreaktion mit Hilfe von Zelllebensfähigkeits- und Zytotoxizitätstests gemessen werden. Alternativ können Organoide aus BME (unter Verwendung von 1 mg/ml Dispase) entnommen und kryokonserviert (biobanked), für molekulare Tests vorbereitet oder histologisch eingebettet und bewertet werden (Abbildung 4).

Ergebnisse

3D-Organoide wurden erfolgreich aus humanem Blasenkrebspatienten TURBT und Zystektomiegewebe nachgewiesen. Kurz gesagt, diese Technik hebt eine schnelle Bildung von 3D-multizellulären Strukturen hervor, die sowohl lebensfähig als auch für andere Endpunktanalysen wie histologische Bewertung, molekulare Charakterisierung (durch Immunhistochemie oder quantitative Echtzeit-PCR) und Wirkstoffscreening geeignet sind. Während des Verfahrens (Abbildung 1) konnten die verschiedenen Eluate während unserer Filtrationsphasen (<...

Diskussion

Während 3D-Organoidprotokolle, die aus Blasenkrebsgewebe gewonnen werden, noch in den Kinderschuhen stecken, sind sie ein Bereich der aktiven Forschung und klinischen Untersuchung. Hier wird ein optimiertes Protokoll zur erfolgreichen Etablierung von Blasenkrebs-PDOs beschrieben, die sowohl für NMIBC- als auch für MIBC-Proben geeignet sind. Dieser Workflow integriert sich parallel in klinische Studien im Krankenhaus und berücksichtigt die Rückstellung von Biobankproben, einschließlich der histologischen Probenverar...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.2 mL cryogenic vial	Corning	430487
1.5 mL Eppendorf tubes	Sigma-Aldrich	T9661-500EA	polypropylene single-use tube
100 µM reversible strainer	STEMCELL Technologies	#27270
100 mm Petri dish	Corning	430167
10x Collagenase/ Hyaluronidase	STEMCELL Technologies	#07912
37 µM reversible strainer	STEMCELL Technologies	#27250
37°C incubator
37°C water bath
50 mL falcon tube	Corning	CLS430829-500EA
6-well plate	Corning	CLS3516
70% (w/w) ethanol
-80°C freezer
96 well ultra low attachment plate (Black)	Sigma-Aldrich	CLS3474-24EA
A 83-01	BioScientific	2939	Prevents the growth-inhibitory effects of TGF-β
ACK lysis buffer	STEMCELL Technologies	#07850
adDMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	12634028	Base medium
Animal-free recombinant EGF	Sigma-Aldrich	518179	Growth factor
Automated cell counter (TC20)	Bio-rad	1450102
B27 additive	Gibco	17504044	Increases sphere-forming efficiency
Cell Counting Slides	Bio-rad	1450015
Centrifuge	Eppendorf	EP022628188
Computer system
CryoStor CS10	STEMCELL Technologies	#07930	Cell freezing solution
Dispase II, powder	Thermofisher	17105041	To enzymatically disrupt Matrigel
DNAse 1	STEMCELL Technologies	#07900
DPBS	Thermofisher	14190144
Dry and wet ice
Esky
Farmdyne (Iodine 16g/L)	Ecolab
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma	HT501128	Histological tissue fixative
Glutamax (L-alanine-L-glutamine)	Invitrogen	35050061	Source of nitrogen for the synthesis of proteins, nucleic acids
HEPES	Gibco	15630-080	All-purpose buffer
Histology cassette	ProSciTech	RCH44-W
Human FGF-10	Peprotech	100-26-25	Growth factor
Human FGF-2	Peprotech	100-18B-50	Growth factor
Liquid nitrogen
Matrigel (Growth Factor Reduced (GFR), phenol red-free, LDEV free)	In Vitro Technologies	356231	Basement membrane extract (BME)
Mr. Frosty freezing container	ThermoFisher	5100-0001	cell freezing container
N-acetyl-L-cysteine (NAC)	Sigma	A7250	Anti-oxidant required to protect against ROS-induced cytotoxicity
Nicotinamide	Sigma	N0636-100G	SIRT-1 inhibitor
NikonTs2U inverted microscope	Nikon	MFA510BB
NIS-Elements Advanced Research	Nikon	MQS31000
Noggin conditioned media	In-house		BMP inhibitor
Pipetboy acu 2	Integra	155000
Pipettes (p20, p100, p1000) with tips
Primocin	Jomar Bioscience	ant-pm2	Combination of antibacterial and antifungal compounds to protect cell cultures from contaminations
Prostaglandin E2 (PGE2)	Tocris	2296	support proliferation of cells
Rotary tube mixer	Ratek	RSM7DC
R-spondin 1 conditioned media	In-house		WNT signalling regulator
SB202190	Jomar Bioscience	s1077-25mg	Selective p38 MAP kinase inhibitor
Scale
Scalpel handle	Livingstone	WBLDHDL03
Scalpels, #11 blade	Medical and Surgical Requisites	EU-211-1
Serological pipettes (5, 10, 25 mL)
Specimen Waste Bags	Medical Search	SU09125X16
Urine specimen jar
Y27632	Jomar Bioscience	s1049-10mg	Selective ROCK inhibitor. Increases survival of dissociated epithelial cells