Markierungsfreie nichtlineare Optik zur Untersuchung von Tubulin-abhängigen Defekten im zentralen Myelin

Zusammenfassung

In diesem Artikel stellen wir ein Protokoll zum Nachweis von Mikrotubuli-beladenen Oligodendrozyten in einem Modell der Tubulinopathie durch einen einfachen, innovativen Mikroskopieansatz der zweiten harmonischen Generation vor.

Zusammenfassung

Die zufriedenstellende Visualisierung von Zytoskelettkomponenten im Gehirn ist eine Herausforderung. Die ubiquitäre Verteilung der Netzwerke von Mikrotubuli, Mikrofilamenten und intermediären Filamenten in allen neuronalen Geweben, zusammen mit der Variabilität der Ergebnisse von fluoreszierenden Proteinfusionsstrategien und ihrer begrenzten Anwendbarkeit auf dynamische Studien von Antikörpern und Medikamenten als Chromophorvehikel, machen klassische optische Ansätze nicht so effektiv wie für andere Proteine. Wenn Tubulin untersucht werden muss, ist die markierungsfreie Erzeugung von zweiten Oberschwingungen aufgrund der nicht-zentrosymmetrischen Organisation des Moleküls eine sehr geeignete Option. Diese Technik kann, wenn sie mit der Mikroskopie konjugiert wird, die volumetrische Verteilung paralleler Bündel von Mikrotubuli in biologischen Proben qualitativ beschreiben, mit dem zusätzlichen Vorteil, mit frischem Gewebe zu arbeiten, das nicht fixiert und nicht permeabilisiert ist. Diese Arbeit beschreibt, wie Tubulin mit einem kommerziellen Mikroskopieaufbau der zweiten harmonischen Generation abgebildet werden kann, um Mikrotubuli in den mit Tubulin angereicherten Strukturen der Oligodendrozyten hervorzuheben, wie bei der Hypomyelinisierung mit Atrophie der Basalganglien und der Tbulinopathie des Kleinhirns (H-ABC), einer kürzlich beschriebenen Myelinerkrankung.

Einleitung

Die optische Bildgebung von Zytoskelettstrukturen in Geweben und Organpräparaten ist keine leichte Aufgabe. Zytoskelettfilamente sind allgegenwärtig, so dass, wenn eine generische Färbung durchgeführt wird, zum Beispiel gegen Alpha-Tubulin oder Beta-Aktin oder möglicherweise Keratin in einer Epithelprobe, das Signal wahrscheinlich ziemlich homogen über die gesamte Probe verteilt wird. Um die Färbung auf eine aussagekräftigere Teilmenge zellulärer Komponenten zu beschränken, kann man entweder transgene Mäuse mit gezielter Expression¹ verwenden oder isoformspezifische Antikörper verwenden. Während nur sehr wenige der letzteren auf dem Markt sind (und nur sehr wenige existieren ^2,3,4), könnte ein transgenes Tiermodell verfügbar sein. Es muss jedoch vom Labor erworben und ordnungsgemäß untergebracht werden, mit allen Kosten, die mit dem Prozess verbunden sind. Bestimmte Antikörper oder Chemikalien, z. B. Fluorophor-konjugierte Arzneimittel wie Phalloidin oder Paclitaxel, können teilweise oder vollständig mit der Anwendung in lebenden Zellen oder Geweben unvereinbar sein, so dass ihre Anwendbarkeit auf Studien an festen Proben beschränkt ist.

Im Falle von Tubulin muss ein weiterer Aspekt berücksichtigt werden, nämlich die Empfindlichkeit des Polymers gegenüber der Fixierung. Die konventionelle chemische Fixierung mit Formaldehyd ist dafür bekannt, dass sie nicht ausreicht, um die Integrität von Mikrotubuli optimal zu erhalten⁵. Darüber hinaus bestätigt ein kürzlich veröffentlichter Bericht, dass die Formaldehydvernetzung subtile Veränderungen in der Ultrastruktur des Mikrotubuli induziert, ähnlich wie bei der Bindung einiger Medikamente oder physiologischer Moleküle wie GTP⁶.

Die direkte Visualisierung von Mikrotubuli in ungefärbten, nicht fixierten Proben ist daher oft wünschenswert. Um dies zu erreichen, ist die Mikroskopie der zweiten harmonischen Generation (SHG)⁷, die auf der Fähigkeit von Bündeln paralleler Mikrotubuli basiert, als Harmonophore zu fungieren und frequenzverdoppeltes Licht zu emittieren, wenn sie mit einem intensiven, gepulsten Infrarotlaser richtig beleuchtet werden. Obwohl ein stärkeres und stabileres Signal der zweiten Harmonischen aus Kollagen und Myosin erzeugt werden kann, die die einzigen beiden anderen biologischen Materialien sind, von denen bekannt ist, dass sie zur Frequenzverdopplung fähig sind, wurde das Signal von Tubulin bisher hauptsächlich verwendet, um mitotische Spindelumlagerungen ^8,9,10 und axonale Mikrotubuli^{Morphologie 11,12,13} zu untersuchen.

In dieser Arbeit stellen wir eine neuartige Anwendung der SHG-Mikroskopie als diagnostisches Werkzeug vor, um Gewebe des zentralen Nervensystems (ZNS), die von Tubulin-beta-4-A (TUBB4A)-Tubulinopathie betroffen sind, von ihren gesunden Gegenstücken^{zu unterscheiden 14}. Einige der Mutationen, die in dieser überwiegend neuralen Isoform von Tubulin auftreten, wie diejenigen, die Hypomyelinisierung und Atrophie der Basalganglien und des Kleinhirns (H-ABC) verursachen, induzieren eine Überfüllung der Mikrotubuli in den Oligodendrozyten^15,16; Die Veränderungen des Zytoskeletts sind wiederum mit nachgeschalteten Effekten wie Dysmyelinisierung verbunden, mit einer tiefgreifenden Beeinträchtigung der motorischen und sensorischen Bahnen^16,17,18,19. Das in dieser Arbeit verwendete Taiep-Mausmodell zeigt einen abnormalen Mikrotubuli-Gehalt in den Oligodendrozyten und rekapituliert die meisten sensomotorischen Symptome von H-ABC-Patienten¹⁷. Das Protokoll erklärt, wie Strukturen wie das Corpus callosum und das Kleinhirn, die normalerweise stark myelinisiert sind und die sowohl bei menschlichen Patienten als auch bei der Taiep-Ratte ¹⁹ stark betroffen sind, abgebildet werden können, um die Unterschiede in den SH-Signalen zwischen gesundem und mutiertem Gewebe hervorzuheben.

Protokoll

Alle beschriebenen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Gesetzen und Kodizes durchgeführt, die im siebten Titel der Verordnung des Allgemeinen Gesundheitsgesetzes über die Gesundheitsforschung der mexikanischen Regierung (NOM-062-ZOO-1999) genehmigt wurden, und in Übereinstimmung mit den Empfehlungen des Leitfadens der Nationalen Gesundheitsinstitute für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren und wurden vom institutionellen Ausschuss für Bioethik in der Forschung der Universidad de Guanajuato und der Benemérita Universidad Autónoma de Guanajuato genehmigt. Puebla.

1. Mikroskop-Einstellungen

1. Schalten Sie das Mikroskopiesystem ein.
2. Schalten Sie den gepulsten Laser ein, um sicherzustellen, dass er nach der Probenextraktion und -vorbereitung mit einem optimalen und konstanten Leistungsniveau lasieren kann.
3. Stellen Sie den Laser auf 810 nm ein. Zur Untersuchung von Tisular-Mikrotubuli werden 10%-20% der verfügbaren Laserleistung verwendet, was im beschriebenen System 13-26 mW entspricht, gemessen an der hinteren Brennebene des Objektivs.
4. Stellen Sie sicher, dass das Mikroskop Köhler-ausgerichtet ist (Ergänzungsdatei 1) mit dem Objektiv, das für die SHG-Bildgebung verwendet wird.
   HINWEIS: Dies ist wichtig, da in der kommerziellen Einrichtung, die in dieser Arbeit verwendet wird, die Detektion im Übertragungsmodus und durch den Kondensator durchgeführt wird.
5. Entfernen Sie unerwünschte Filter aus dem optischen Erkennungspfad (Abbildung 1A).
6. Stellen Sie sicher, dass die Kondensatormembran vollständig geöffnet ist, um sicherzustellen, dass kein Licht unnötig auf diesem Niveau gestoppt wird.
7. Bereiten Sie ein 25x/0,8-faches Ölimmersionsobjektiv mit numerischer Apertur (NA) und einem kleinen Tropfen Immersionsöl im Objektiv vor.
   HINWEIS: Dieses Objektiv wurde verwendet, um am besten mit dem Kondensator NA übereinzustimmen, der 0,55 betrug (idealerweise NA_cond≥ NA_obj).

2. Vorkontrollen des Mikroskops

HINWEIS: Führen Sie die vorbereitenden Mikroskopkontrollen einmal durch, es sei denn, der Aufbau wurde geändert.

1. Stellen Sie trockene Maisstärke zwischen Objektträgern mit SHG-Parametern dar, um SHG-Bilder zu erzeugen, die die Polarisationsrichtung des Lasers anzeigen. Befolgen Sie die in Ergänzungsdatei 2 beschriebenen Schritte, mit Ausnahme der Laserleistung, die bei Maisstärke weniger als 5% beträgt.
2. Nehmen Sie ein Bild von spärlichen Maisstärkekörnern und markieren Sie die Ausrichtung der SHG-Läppchen in der x-y-Ebene. Diese Ausrichtung entspricht der Laserorientierung (Abbildung 2A).
3. Nehmen Sie zur Kontrolle ein weiteres Bild derselben Probe auf, indem Sie eine Halbwellenplatte (Position in Abbildung 1A) in den optischen Pfad einfügen, um die Schwingungsrichtung des Lasers zu ändern. Das resultierende Bild zeigt gedrehte SHG-Signalläppchen (Abbildung 2B, C).
4. Wenn Sie einen anderen Bandpassfilter für das SHG verwenden, stellen Sie sicher, dass es optimale Übertragungseigenschaften aufweist, indem Sie die Bilder (Abbildung 2D, E) und die Signalintensitäten Pixel für Pixel entlang einer Zeilenabtastung vergleichen (Abbildung 2F).

3. Gewebeentnahme

HINWEIS: Verwenden Sie immer saubere Werkzeuge, um die chirurgischen Eingriffe durchzuführen.

1. Verwenden Sie 6-12 Monate alte Taiep-Ratten und altersangepasste Sprague-Dawley-Kontrollen (WT).
2. Betäuben Sie die Tiere mit einer i.p. Injektion einer Mischung aus Ketamin und Xylazin (0,125 mg/kg und 5 mg/kg), verdünnt in einer 0,9%igen sterilen NaCl-Lösung.
   1. Überprüfen Sie die Schmerzreflexe und fahren Sie nur fort, wenn sie fehlen.
3. Opfere das Tier durch Enthauptung.
4. Sobald der Kopf isoliert ist, öffnen Sie die Knochen des Schädelgewölbes vorsichtig entlang der Mittellinie, beginnend mit dem kaudalsten Punkt oben in Richtung Nase, von den Augenhöhlen in Richtung der Mittellinie und dann vom kaudalsten Punkt bis unter das Gehirn und das Kleinhirn.
   HINWEIS: Knochenschneider und Rongeurs ermöglichen eine ordnungsgemäße Entfernung der Kopfknochen, ohne die Gehirnstrukturen zu beschädigen.
5. Lösen Sie das Gehirn und das Kleinhirn vom Knochen. Die beiden Hemisphären konnten getrennt werden. Wenn die Hemisphären geteilt sind, verwenden Sie eine Hälfte für die SHG-Bildgebung und fixieren Sie die andere Hälfte in 3,7% Paraformaldehyd in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für 20 Minuten in einer chemischen Haube für das anschließende Schneiden und Färben.

4. Vibratom-Schnitte

1. Bereiten Sie eine Vibratom-Pufferschale vor, die mit warmer (37 °C) Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) gefüllt ist.
2. Befestigen Sie das Gehirn mit Cyanacrylatkleber über ein Stück Klebeband an der Probenplatte. Der kaudalste Teil / die kaudalste Region berührt den Klebstoff, so dass die verwendbaren koronalen Abschnitte aus dem gegenüberliegenden, rostralen Teil geschnitten werden können.
   1. Lassen Sie ~10 s für die Polymerisation des Klebstoffs zu, um eine effektive Bindung der Probe zu erhalten.
      HINWEIS: Die besten Ergebnisse werden erzielt, wenn das Gehirn so ausgerichtet ist, dass die Klinge "von oben nach unten" und nicht "von einer Seite zur anderen" schneidet (Abbildung 1B).
3. Übertragen Sie die Probenplatte auf ihre magnetische Halterung in der Pufferschale.
4. Beginnen Sie mit dem Schneiden von 300-500 μm-Abschnitten, bis die produzierten Scheiben die gesamte Oberfläche des Gehirns umfassen.
5. Reduzieren Sie an dieser Stelle die Dicke des Abschnitts auf 160 μm.
6. Sobald ein vollständiger 160-μm-Schnitt auf Höhe des Corpus callosum geschnitten wurde, wird er mit einer modifizierten Pasteur-Glaspipette mit einer großen, geflammten Öffnung zurückgewonnen (Abbildung 1C).
7. Übertragen Sie es in eine saubere Petrischale mit neuem warmen HBSS oder direkt auf den Glasträger für die Mikroskopie (Deckglas oder Glasbodenschale).
   HINWEIS: Unter den beschriebenen Versuchsbedingungen ist das Hinzufügen eines Deckglases über der Probe schädlich für die Bildgebung.

5. Übertragung auf das Mikroskop

1. Wenn sich das Mikroskop in einem anderen Raum befindet, bereiten Sie eine isolierte Box mit erwärmten Gelpackungen vor, um die Gewebeschnitte unter Beibehaltung der Temperatur zu übertragen. Die Box dient auch dazu, die Abschnitte warm zu halten, bis sie abgebildet sind.
2. Legen Sie die Probe unter das Mikroskop und stellen Sie sicher, dass sie durch direkte Beobachtung durch das Okular mit Durchlicht richtig unter dem Objektiv positioniert ist.
   HINWEIS: Ziel ist es, die vorhergesagten emittierenden Strukturen mit der Schwingungsrichtung des Lasers in Einklang zu bringen, um das emittierte (und damit detektierte) SHG-Signal zu maximieren.
3. Entfernen Sie das überschüssige HBSS, so dass ein dünner Flüssigkeitsfilm die gesamte Probe bedeckt. Überprüfen Sie den Flüssigkeitsfilm alle paar Minuten, um eine übermäßige Verdunstung und Trocknung der Probe zu vermeiden.
   HINWEIS: Unter den beschriebenen Bedingungen wird ein Abschnitt nicht länger als 20 Minuten verwendet. Das Trocknen der Probe verursacht drastische künstliche Effekte (ergänzende Abbildung 1A). Anstatt mehr HBSS hinzuzufügen, wird ein regelmäßiges Einweichen des Abschnitts in warmem, frischem Medium empfohlen, wenn längere Bildgebungszeiten erforderlich sind. Die Verwendung von Perfusionskammern und Klebstoff oder niedrigschmelzender Agarose zur Immobilisierung des Gewebes wird auch empfohlen, wenn längere Experimente durchgeführt werden sollen.
4. Bereiten Sie den Mikroskoptisch für die nicht gescannte Bildgebung vor, die das Schließen aller Türen der dunklen Inkubationskammer oder das Abdecken der Inkubationskammer mit einem schwarzen Nylon-Polyurethan-beschichteten Gewebe umfassen kann.

6. Bildgebung

1. Wählen Sie den Bildgebungsmodus "nicht gescannt" entlang des Übertragungspfads. Auf diese Weise wird die Erfassung des schwachen SH-Signals von Tubulin optimiert.
2. Wählen Sie das Ziel LCI Plan-Neofluar 25x/0,8 NA aus.
3. Stellen Sie eine Laserleistung zwischen 13 mW und 26 mW ein, mit einer Pixelverweilzeit von 12,6 μs. Nehmen Sie Bilder mit einer Größe von nicht mehr als 512 x 512 Pixeln mit einer Geschwindigkeit von 5 und einem Durchschnitt von 2 auf, was einer durchschnittlichen Aufnahmezeit von etwa 15 s entspricht.
   HINWEIS: Die Verwendung höherer Laserleistungen und/oder längerer Verweilzeiten kann die Probe beschädigen (ergänzende Abbildung 1B).
4. Nehmen Sie zunächst Bilder mit einem 485-nm-Kurzpassfilter (SP485) auf und fügen Sie in einem zweiten Schritt einen scharfen 405-nm-Bandpassfilter (BP405; Abbildung 3). Befolgen Sie die in Ergänzungsdatei 2 beschriebenen Schritte.
   HINWEIS: Pseudo-Hellfeld-Bilder können durch den gleichen Detektor mit dem verbleibenden Laserlicht einer sichtbaren Linie aufgenommen werden (405 nm oder 488 nm Laser funktionieren am besten).

7. Verarbeitung des Kleinhirns

1. Schneiden Sie zuerst das Kleinhirn mit einem Skalpell in zwei Hemisphären und kleben Sie sie dann mit dem mittleren Teil (dem flachen Teil, der nach dem Schneiden erhalten wird) auf die Vibratomstütze.
2. Schnitt und Bild des Kleinhirns auf die gleiche Weise, wie es für das Gehirn beschrieben wurde (160 μm Schnitte, gleiche Vibratomeinstellungen, gleiche Klinge, gleiche Mikroskopeinstellungen usw.).
   HINWEIS: Aufgrund der Anatomie des Kleinhirns ist seine Ausrichtung zum Zeitpunkt des Schneidens nicht kritisch. In den meisten Schichten, die von der Oberfläche entfernt erzeugt werden, werden Folien gut in die weiße Substanz geschnitten.

Ergebnisse

Die mit dieser Methodik erhaltenen Bilder weisen aufgrund der sehr begrenzten Anzahl von Harmonophoren, die in biologischen Geweben vorhanden sind, ein intrinsisch niedriges Hintergrundniveau auf, was einer der wesentlichen Vorteile der Methode ist.

Wenn die Fasern des Corpus callosum abgebildet werden, finden sich im Taiep-Gehirn durchweg faserartige Kurzstrukturen und abgerundete Elemente (Abbildung 3B), während das Corpus callosum des Kontrollgehirns ein viel heterogeneres und iso...

Diskussion

Die SHG-Mikroskopie ist Teil einer Gruppe nichtlinearer optischer Techniken, zu denen die Zwei-Photonen-Anregungsmikroskopie, die Mikroskopie der dritten harmonischen Generation und die kohärente Anti-Stokes-Raman-Streumikroskopie gehören, die dazu beigetragen haben, das Anwendungsspektrum der konventionellen optischen Mikroskopie auf die Biowissenschaften auszudehnen²⁰.

Insbesondere beziehen sich die Hauptstärken und Schwächen der SHG-Mikroskopie auf die gleiche Be...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
405/10 nm BrightLine(R) single-band bandpass filter	Semrock	FF01-405/10-25	32 mm diameter, with housing ring
Black Nylon, Polyurethane-Coated Fabric	Thorlabs	BK5	5' x 9' (1.5 m x 2.7 m) x 0.005" (0.12 mm) Thick
Blades for vibratome	any commercial; e.g. Wilkinson Sword		Classic stainless steel double edge razor blades
Cell culture dishes, 35 mm	any commercial; e.g. Falcon	351008
Confocal microscope	Zeiss	LSM710NLO AxioObserver Z1	Inverted microscope, objective used is LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA
Cooler	any commercial		Any insulated, polystyrene box could work, to mantain the sample at about 37 °C
Corn stach	e.g. Maizena		From the supermarket
Coverslips #1.5	any commercial		Rectangular
Cyanoacrylate glue	e.g. Loctite		To glue the brain to the masking tape
Fine forceps	fine science tools	11412-11	To manipulate tissue sections by handling from the meninges
Fine scissors	fine science tools	14370-22	To cut the skin
Fine scissors curved tip	fine science tools	14061-09	To cut along the midline
Formaldehyde 37%	Sigma-Aldrich	252549	To dilute 1:10 in PBS
Friedman Rongeur	fine science tools	16000-14	To cut the bone
Gel packs	any commercial		Prewarmed to 37 °C, to help mantaining the temperature inside the cooler
Glass Pasteur pipette, modified	any commercial		To transfer the tissue section
Hanks′ Balanced Salt solution (HBSS)	Gibco	14025-076	Could be prepared from powders
Kelly hemostats	fine science tools	13018-14	To separate the bone
Masking tape	any commercial		To protect th surface of the specimen plate
NDD module, type C	Zeiss	000000-1410-101	To detect the signal, reducing light loss. Housing the 000000-1935-163 filter set with the SP485
Offset bone nippers	fine science tools	16101-10	To cut the bone
Phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	10010-031	Could be prepared from powders or tabs
Pulsed laser	Coherent	Chameleon Vision II	680–1080 nm tunable laser
Scalpel	any commercial		Straight blade with sharp point
Standard pattern forceps	fine science tools	11000-18
Vannas spring scissors	fine science tools	15018-10	To cut meninges that remain joined to both the slice obtained from vibratome cutting and the section glued to the specimen plate.
Vibratome	any commercial; e.g. Leica	VT1200