Ein zuverlässiges schweinisches Faszien-Hautlappenmodell für vaskularisierte Komposit-Allografts Bioengineering-Studien

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt das schweinische Modell des faszio-kutanen Lappens und seine mögliche Verwendung in der vaskularisierten Kompositgewebeforschung.

Zusammenfassung

Vaskularisierte Composite Allografts (VCA) wie Hand-, Gesichts- oder Penistransplantationen stellen die modernste Behandlung für verheerende Hautdefekte dar, die durch die ersten Schritte der rekonstruktiven Leiter versagt haben. Trotz vielversprechender ästhetischer und funktioneller Ergebnisse bleibt der wichtigste limitierende Faktor die Notwendigkeit einer drastisch angewandten lebenslangen Immunsuppression und ihrer bekannten medizinischen Risiken, die breitere Indikationen verhindern. Daher ist die Aufhebung der Immunbarriere bei VCA unerlässlich, um die ethische Waage zu kippen und die Lebensqualität der Patienten mit den fortschrittlichsten chirurgischen Techniken zu verbessern. Die de novo Entwicklung eines patientenspezifischen Transplantats ist der bevorstehende Durchbruch in der rekonstruktiven Transplantation. Mit Hilfe von Tissue Engineering-Techniken können VCAs von Spenderzellen befreit und durch Perfusion-Dezellularisierung-Rezellularisierung auf den Empfänger zugeschnitten werden. Um diese neuen Technologien zu entwickeln, ist ein groß angelegtes Tier-VCA-Modell notwendig. Daher stellen Schweinefaszio-kutane Lappen, bestehend aus Haut, Fett, Faszien und Gefäßen, ein ideales Modell für Vorstudien in VCA dar. Dennoch umfassen die meisten VCA-Modelle, die in der Literatur beschrieben werden, Muskeln und Knochen. Diese Arbeit berichtet von einer zuverlässigen und reproduzierbaren Technik für die saphenöse faszio-kutane Lappenernte bei Schweinen, ein praktisches Werkzeug für verschiedene Forschungsbereiche, insbesondere vaskularisiertes zusammengesetztes Tissue Engineering.

Einleitung

Vaskularisierte Komposit-Allotransplantate (VCA) haben die Behandlung von schwer zu reparierenden Körperteilverlusten wie Händen, Gesicht und Penis revolutioniert ^1,2,3. Leider haben die ersten Langzeitergebnisse⁴ gezeigt, dass die lebenslange Verabreichung von hochdosierten Immunsuppressiva zu schweren Begleiterkrankungen führen kann, einschließlich Diabetes, Infektionen, Neoplasien und renovaskulärer Dysfunktion⁵. In letzter Zeit mussten VCA-Expertenteams das Risiko einer chronischen Abstoßung, die zu einem Transplantatverlust führt, bewältigen und die ersten Gesichtsretransplantationsfälle durchführen ^6,7. Verschiedene Strategien wurden beschrieben, um die Einschränkungen der Immunsuppression bei VCA zu überwinden. Die erste beruht auf der Herstellung einer langfristigen Transplantattoleranz durch Induktion eines immungemischten Chimärismuszustands beim Allograftempfänger ^8,9. Die zweite beinhaltet de novo die Erstellung eines patientenspezifischen Transplantats durch Tissue Engineering.

In jüngster Zeit hat die Perfusionsdezellularisierung von biologischem Gewebe native extrazelluläre Matrix (ECM) -Gerüste erzeugt, die die Erhaltung des vaskulären Netzwerks und der Gewebearchitektur ganzer Organe ermöglichen¹⁰. Daher würde die Rezellularisierung dieser ECM mit empfängerspezifischen Zellen ein maßgeschneidertes Transplantat ohne Immunbeschränkungen schaffen. In der Forschung zum VCA-Bioengineering haben mehrere Teams ein solches ECM dezellularisiert und erhalten, wobei die gesamte Architektur erhalten^{wurde 11,12,13}. Der Rezellularisierungsprozess bleibt jedoch schwierig und war in Großtiermodellen nicht erfolgreich^14,15. Die Entwicklung dieser bahnbrechenden Technologien erfordert zuverlässige und reproduzierbare Gewebemodelle für große Tiere. Schweinemodelle stellen die erste Wahl in der biotechnischen Entwicklungspipeline dar, da Schweinehaut der menschlichen Haut die nächsten anatomischen und physiologischen Eigenschaften aufweist¹⁶. Die Verwendung von fasziokutanen Lappen (FCF) ist ideal für die ersten Schritte zur Herstellung von "maßgeschneiderten" vaskularisierten Kompositgewebetransplantaten. Tatsächlich ist FCF ein elementares VCA-Modell, das Haut-, Fett-, Faszien- und Endothelzellen enthält. Eine Beschreibung der myokutanen Schweinelappen¹⁷ und osteomyokutanen Lappen¹⁸ findet sich in der Literatur. Dennoch fehlt der Fokus auf faszio-kutane Klappenerntetechniken.

Daher zielt diese Studie darauf ab, den Forschern eine detaillierte Beschreibung einer Schweine-Stamm-FCF-Beschaffungstechnik zu liefern und alle Eigenschaften der Klappe für ihren Einsatz in vielen Forschungsbereichen darzustellen, insbesondere im vaskularisierten zusammengesetzten Tissue Engineering.

Protokoll

Alle Tiere erhielten menschliche Pflege gemäß dem National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Das Institutional Animal Care and Use Committee genehmigte das Versuchsprotokoll (IACUC-Protokoll #2020N000015). Für alle Experimente wurden sieben weibliche Yorkshire-Schweine (20-25 kg) verwendet.

1. Präoperative Versorgung

1. Fasten Sie das Tier 12 h vor der Operation auf feste Nahrung.
2. Sediert das Tier mit 4,4 mg/kg Telazol, 2,2 mg/kg Xylazin und 0,04 mg/kg (IM) Atropinsulfat (siehe Materialtabelle).
3. Legen Sie einen 18 G peripheren intravenösen Katheter in eine Ohrvene.
4. Intubieren Sie die Schweine mit einem geeigneten Endotrachealtubus (6-15 mm können für 10-200 kg Schweine verwendet werden) und schließen Sie den Schlauch an ein Beatmungsgerät an. Präoperative Analgesie mit Buprenorphin (0,05 mg/kg, IM) verabreichen (siehe Materialtabelle).

2. Intraoperative Überwachung

1. Halten Sie die Anästhesie mit einer Inhalationsmischung von 1,5% -3% Isofluran mit 1,5 l / min Sauerstofffluss aufrecht.
2. Überwachen Sie kontinuierlich die Herzfrequenz, die Pulsoximetrie und das endtidale CO₂. Beurteilen Sie Blutdruck und Körpertemperatur alle 5 Minuten.
   HINWEIS: Der Zielbereich für die Herzfrequenz liegt zwischen 90-100 Schlägen / min, die Sauerstoffsättigung muss höher als 93% sein und der endtidale CO 2-Bereich liegt zwischen 5% -6% von CO₂.
3. Verabreichen Sie 5-10 ml / kg pro Stunde 0,9% Kochsalzlösung während des gesamten Verfahrens, um den mittleren arteriellen Druck zwischen 60 mmHg und 90 mmHg zu regulieren.

3. Bilaterale Beschaffung von FCF

1. Legen Sie das Tier in Rückenlage. Rasieren und schrubben Sie beide Leisten und Hinterbeine, schließen Sie die gesamten Hinterbeine in die Operationsstelle ein und drapieren Sie sie steril.
2. Palpieren Sie den Puls der Arteria saphena ~3 Fingerbreiten medial von der Patella und markieren Sie ihn.
3. Identifizieren und zeichnen Sie die Grenzen der Klappe.
   HINWEIS: Die obere Grenze ist eine Achse parallel zur Leistenfalte 3 cm darunter. Die laterale Grenze ist eine Achse von der vorderen oberen Beckenwirbelsäule zum medialen Teil der Patella.
4. Zeichnen Sie einen ovalen Lappen mit einem Durchmesser von 10 cm, der auf dem Stammstiel zentriert ist und in den zuvor beschriebenen Klappengrenzen enthalten ist (Schritt 3.3).
5. Machen Sie einen 1,5 cm Hautschnitt in Bezug auf den distalen Teil des Pedikels auf dem Lappen-Wahrzeichen.
6. Öffnen Sie die Faszie und sezieren Sie stumpf, um die Arteria saphena und ihre beiden Venae comitantes freizulegen. Führen Sie eine doppelte Ligatur durch und trennen Sie sie in einem Bündel.
7. Schneiden Sie die restliche Haut des Lappens mit einer Klinge ein.
8. Verwenden Sie Kauter, um das Unterhautgewebe und die umgebende Faszie zu öffnen. Führen Sie eine gründliche Blutstillung mit einer bipolaren Pinzette durch (siehe Materialtabelle).
9. Befestigen Sie die Hautkomponente des Lappens mit 3-0 nicht resorbierbaren Nähten an der darunter liegenden Faszie, um ein versehentliches Traktion und eine Störung der perforierenden Gefäße zu vermeiden.
10. Befreien Sie den Lappen von der Grazilis, indem Sie die Faszie vom Muskel weg sezieren.
    HINWEIS: Der distale Teil des Stammstiels verläuft in einer Ebene zwischen dem Musculus gracilis und der Faszie. Eine angemessene Spannung und eine vorsichtige bipolare Hämostase der Seitenäste sind entscheidende Elemente, um die Pedikeldissektion zu erleichtern.
11. Verwenden Sie ein Skalpell, um einen 12 cm langen Schnitt in der Leistenfalte zu machen. Führen Sie einen senkrechten Schnitt durch, der die Leistenfalte mit dem proximalen Teil des Lappens verbindet. Heben Sie die verbindende Haut ab und öffnen Sie die Unterhautschicht mit Kauter.
12. Setzen Sie die Pedikeldissektion fort, indem Sie den Stammgefäßen in Richtung der Femurgefäße folgen.
    HINWEIS: Der proximale Teil des Stammstiels kann entweder durch das intermuskuläre Septum verlaufen oder in den Musculus gracilis eintauchen.
13. Skelettieren Sie die Femurgefäße und ligieren Sie sie distal zum Stammast in zwei separaten Bündeln. Setzen Sie die Dissektion der Femurgefäße von distal nach proximal fort, bis das Niveau des Leistenbandes erreicht ist. Verwenden Sie bipolare Pinzetten zum Kauterisieren oder vaskuläre Clips und 2-0 Seidenbinden, um die tiefen Femurgefäße zu ligieren, dann schneiden.
    HINWEIS: Gefäßclips können auch vor dem Schneiden der Gefäße verwendet werden.
14. Wiederholen Sie die Schritte 3.2-3.13 an der kontralateralen Hinterbeine, um den zweiten Stammlappen zu entnehmen.
15. Heparinisieren Sie das Tier 5 min vor Schritt 3.16 mit einer intravenösen (IV) Heparininjektion (100 I.E./kg).
16. Ligieren Sie den Oberschenkelstiel (Arterie und Vene) möglichst proximal zum Leistenband und trennen Sie den Lappen vom Spenderschwein.
17. Erweitern Sie die Enden des Femurgefäßes und führen Sie einen 20 G Angiokatheter in Arterie und Vene ein. Verwenden Sie 3-0 Seidenbänder, um den Katheter an den Gefäßen zu befestigen.
18. Spülen Sie die Faszio-Hautlappenarterie langsam mit 10 ml Heparinkochsalzlösung (100 IE / ml), bis ein deutlicher venöser Abfluss beobachtet wird (Abbildung 1).

Abbildung 1: Nativer und dezellularisierter saphenöser faszio-kutaner Lappen . (A) Isolierter Hautlappen mit einem 20 G Angiokatheter, der in die Oberschenkelarterie eingeführt wird, so dass der Lappen aus dem Blut gewaschen und mit verschiedenen Experimenten (Angiographie, Perfusionsdezellularisierung) fortgefahren werden kann. (B) Dezellularisierter Hautlappen. Perfusionsdezellularisierung ergibt weiße, azelluläre Gerüste nach 10 Tagen Waschmittelperfusion. H&E-gefärbte Querschnitte in voller Dicke von (C) nativem Hautlappen und (D) dezellularisiertem Hautlappen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

19. Euthanasieren Sie das Tier mit einer intravenösen Injektion von Natriumphenobarbital (100 mg / kg). Bestätigen Sie den Tod durch das Fehlen von Herzschlag und Atembewegungen.

Ergebnisse

Dieser Arbeit an lebenden Tieren ging die Bestimmung des saphenösen Perforasoms an drei Leichenproben voraus (Abbildung 2). Eine farbige Füllungslösung wurde in die Arteria saphena injiziert, um das spezifische vaskuläre Netzwerk aus der Arterie zu trüben. Die Lösung besteht aus 10 ml blau gefärbtem Glycerinmittel, gemischt mit 10 ml des Verdünnungsmittels (siehe Materialtabelle). Dies erzeugte eine farbige Karte der Haut, die von der Arteria saphena vaskularisiert w...

Diskussion

Dieser Artikel beschreibt einen zuverlässigen und reproduzierbaren fasziokutanen Lappen, der an Schweinehinterbeinen geerntet wird. Nach diesem Schritt-für-Schritt-Operationsprotokoll können Sie in weniger als 2 Stunden zwei Lappen an nur einem Tier erhalten. Der kritischste Schritt der Operation ist die Skelettierung des Gefäßstiels innerhalb der Gracilis Muskelfasern, die eine gründliche Dissektion durch einen erfahrenen Chirurgen erfordert. Die Befestigung der Haut an der Faszie mit Hautnähten ist ein entscheid...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 G angiocatheter	BD Insyte Autoguard	381409
20 G angiocatheter	BD Insyte Autoguard	381411
Adson Tissue Forceps, 11 cm, 1 x 2 Teeth with Tying Platform	ASSI	ASSI.ATK26426
Atropine Sulfate	AdvaCare	212-868
Bipolar cords	ASSI	228000C
Buprenorphine HCl	Pharmaceutical, Inc	42023-179-01
Dilating Forceps	Fine science tools (FST)	18131-12
Endotrachel tube	Jorgensen Labs	JO615X	size from 6 to 15mm depending on the pig weight
Ethilon 3-0 16 mm 3/8	Ethicon	MPVCP683H
Euthasol	Virbac AH	200-071
Heparin Lock Flush Solution, USP, 100 units/mL	BD PosiFlush	306424
Isoflurane	Patterson Veterinary	14043-704-06
Jewelers Bipolar Forceps Non Stick 11 cm, straight pointed tip, 0.25 mm tip diameter	ASSI	ASSI.BPNS11223
Metzenbaum scissors 180 mm	B Braun	BC606R
Microfil blue	Flow tech	LMV-120
Microfil dilution	Flow tech	LMV-112	colored filing solution
Monopolar knife	ASSI	221230C
N°15 scalpel blade	Swann Morton	NS11
Omnipaque	General Electric	4080358	contrast product
Perma-Hand Silk 3-0	Ethicon	A184H
Small Ligaclip	Ethicon	MCM20
Stevens scissors 115 mm	B Braun	BC008R
Telazol	Zoetis	106-111
Xylamed (xylazine)	Bimeda	200-529