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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein konfokales Bildgebungsverfahren zum Nachweis von drei Fusionsmodi in rindischen Nebennierenchromaffinzellen. Diese Fusionsmodi umfassen 1) Close-Fusion (auch Kiss-and-Run genannt), bei der sich die Fusionspore öffnet und schließt, 2) Stay-Fusion, bei der die Fusionspore geöffnet und die geöffnete Pore erhalten bleibt, und 3) Shrink-Fusion, einschließlich der Schrumpfung der fusionierten Vesikel.

Zusammenfassung

Dynamische Fusionsporenöffnung und -verschluss vermitteln Exozytose und Endozytose und bestimmen deren Kinetik. Hier wird detailliert demonstriert, wie die konfokale Mikroskopie in Kombination mit der Patch-Clamp-Aufzeichnung eingesetzt wurde, um drei Fusionsmodi in Primärkultur-Rindernebennieren-Chromaffinzellen nachzuweisen. Die drei Fusionsmodi umfassen 1) Close-Fusion (auch Kiss-and-Run genannt) mit Fusionsporenöffnung und -verschluss, 2) Stay-Fusion, bei der die Fusionspore geöffnet und die geöffnete Pore erhalten bleibt, und 3) Shrink-Fusion, bei der das fusionserzeugte Ω-Form-Profil geschrumpft wird, bis es vollständig an der Plasmamembran verschmilzt.

Um diese Fusionsmodi nachzuweisen, wurde die Plasmamembran durch Überexpression von mNeonGreen markiert, das mit der PH-Domäne der Phospholipase C δ (PH-mNG) verbunden ist, die an Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PtdIns(4,5)P2) an der Zytosol-zugewandten Packungsbeilage der Plasmamembran bindet; Vesikel wurden mit dem fluoreszierenden falschen Neurotransmitter FFN511 beladen, um die Freisetzung von vesikulärem Inhalt nachzuweisen; und Atto 655 wurde in die Badlösung aufgenommen, um einen Fusionsporenverschluss zu erkennen. Diese drei fluoreszierenden Sonden wurden gleichzeitig mit ~ 20-90 ms pro Bild in lebenden Chromaffinzellen abgebildet, um die Öffnung der Fusionsporen, die Freisetzung von Inhalten, den Fusionsporenverschluss und die Änderung der Fusionsvesikelgröße zu erkennen. Die Analysemethode wird beschrieben, um drei Fusionsmodi von diesen Fluoreszenzmessungen zu unterscheiden. Das hier beschriebene Verfahren kann prinzipiell auf viele sekretorische Zellen jenseits von Chromaffinzellen angewendet werden.

Einleitung

Die Membranfusion vermittelt viele biologische Funktionen, einschließlich synaptischer Übertragung, Blutzuckerhomöostase, Immunantwort und viralem Eintritt 1,2,3. Exozytose, bei der die Vesikelfusion an der Plasmamembran stattfindet, setzt Neurotransmitter und Hormone frei, um viele wichtige Funktionen wie neuronale Netzwerkaktivitäten zu erreichen. Fusion öffnet eine Pore, um vesikulären Inhalt freizusetzen, wonach sich die Pore schließen kann, um das fusionierende Vesikel zu erhalten, das als Kiss-and-Run 1,4 bezeichnet wird. Sowohl irreversible als auch reversible Fusionsporenöffnung können mit zellgebundenen Kapazitätsaufzeichnungen in Kombination mit Fusionsporenleitfähigkeitsaufzeichnungen der Einzelvesikelfusion gemessen werden.

Dies wird oft so interpretiert, dass es die vollständige Kollapsfusion widerspiegelt, bei der die Fusion bis zur Abflachung des Schmelzvesikels dilatiert wird, und Kiss-and-Run, bei dem die Fusionsporen geöffnet und geschlossen werden, bzw. 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Jüngste konfokale und stimulierte Emissionsdepletionsstudien (STED) in chromaffinen Zellen beobachteten direkt die Öffnung und den Verschluss der Fusionsporen (Kiss-and-Run, auch Close-Fusion genannt), die Fusionsporenöffnung, die lange Zeit eine Ω-Form mit einer offenen Pore beibehält, die als Stay-Fusion bezeichnet wird, und das Schrumpfen des Fusionsvesikels, bis es vollständig mit der Plasmamembran verschmilzt, die die vollständige Kollapsfusion für die Verschmelzung von Fusionsvesikeln mit der Plasmamembran4 ersetzt. 8,14,15,16,17.

In Neuronen wurde die Öffnung und der Verschluss der Fusionsporen mit Bildgebung nachgewiesen, die die Freisetzung von Quantenpunkten zeigt, die in Vesikeln vorgeladen sind, die größer als die Fusionspore sind, und mit Fusionsporenleitfähigkeitsmessungen an der Freisetzungsfläche von Nerventerminals 5,18,19. Nebennierenchromaffinzellen werden häufig als Modell für die Untersuchung von Exo- und Endozytoseverwendet 20,21. Obwohl Chromaffinzellen große Vesikel mit dichtem Kern enthalten, während Synapsen kleine synaptische Vesikel enthalten, sind die Exozytose- und Endozytoseproteine in chromaffinen Zellen und Synapsen ziemlich analog 10,11,12,20,21,22,23.

Hier wird ein Verfahren beschrieben, um diese drei Fusionsmodi mit einem konfokalen Bildgebungsverfahren in Kombination mit Elektrophysiologie in Rindernebennieren-Chromaffinzellen zu messen (Abbildung 1). Diese Methode beinhaltet das Laden von fluoreszierenden falschen Neurotransmittern (FFN511) in Vesikel, um Exozytose zu erkennen; Zugabe von Atto 655 (A655) in der Badlösung, um das fusionserzeugte Ω-Form-Profil zu füllen, und Markierung der Plasmamembran mit der PH-Domäne der Phospholipase C δ (PH), die an PtdIns(4,5)P2 an der Plasmamembran 8,15,24 bindet. Die Dynamik der Fusionsporen kann durch Änderungen verschiedener Fluoreszenzintensitäten nachgewiesen werden. Obwohl für Chromaffinzellen beschrieben, kann das hier beschriebene Prinzip dieser Methode weit über Chromaffinzellen hinaus auf viele sekretorische Zellen angewendet werden.

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Protokoll

HINWEIS: Das Tierverwendungsverfahren entsprach den NIH-Richtlinien und wurde vom NIH Animal Care and Use Committee genehmigt.

1. Rinderchromaffin-Zellkultur

  1. Bereiten Sie Lockes Lösung (Tabelle 1) und Autoklavwerkzeuge 1 Tag vor der Chromaffin-Zellkultur vor.
  2. Erhalten Sie am Kulturtag Rindernebennieren von einem lokalen Schlachthof und halten Sie sie vor der Dissektion in eiskalte Locke-Lösung getaucht.
    HINWEIS: Nebennieren sind von 21-27 Monate alte, gesunde, schwarze Angus beiderlei Geschlechts (hauptsächlich männlich) mit einem Körpergewicht von etwa 1.400 Pfund (~ 635 kg).
  3. Vor der Dissektion werden 30 ml (für 3 Nebennieren) frische Enzymlösung mit Kollagenase P, Trypsininhibitor und Rinderserumalbumin (Tabelle 1) hergestellt und bei Raumtemperatur aufbewahrt.
  4. Wählen Sie 3 intakte Drüsen ohne Schnitte oder Blutungen an der Oberfläche und entfernen Sie das Fettgewebe mit einer Schere (Abbildung 1A). Waschen Sie die Drüsen durch Durchblutung mit Lockes Lösung, bis kein Blut mehr herauskommt. Um dies zu erreichen, blähen Sie die Drüse durch die Nebennierenvene auf (Abbildung 1B) mit einer 30-ml-Spritze, die mit einem 0,22-μm-Filter verbunden ist, so oft wie nötig25.
    HINWEIS: Ungefähr 150 ml Lockes Lösung werden normalerweise benötigt, um 3 Drüsen zu waschen.
  5. Zur Verdauung injizieren Sie die Enzymlösung durch die Nebennierenvene mit einer 30-ml-Spritze, die mit einem 0,22-μm-Filter verbunden ist, bis die Drüse anschwillt. Dann lassen Sie die Drüsen bei 37 ° C für 10 Minuten. Noch einmal injizieren und die Drüsen weitere 10 min bei 37 °C stehen lassen.
    HINWEIS: Ungefähr 30 ml Enzymlösung werden benötigt, um 3 Drüsen zu verdauen.
  6. Nach der Verdauung schneiden Sie die Drüse längs von der Vene bis zum anderen Ende mit einer Schere, um die Drüse zu entfalten (Abbildung 1C). Isolieren Sie die Medullae, indem Sie die weiße Medulla in eine 10 cm große Petrischale mit Lockes Lösung zünden.
    HINWEIS: Der Vergleich des Inneren der Drüse vor und nach der Verdauung ist in Abbildung 1C dargestellt. Die Details der Verdauung und der Medullae-Isolierung werden zuvorberichtet 23,25.
  7. Schneiden und zerkleinern Sie das Markbild mit einer Schere in kleine Stücke (Abbildung 1D). Filtern Sie die Medulla-Suspension mit einem 80-100 μm Nylonnetz in ein Becherglas. Dann das Filtrat zur Zentrifugation bei 48 × g, Raumtemperatur, für 3 min mit einer Verzögerung von 3 min in ein 50 ml konisches Röhrchen geben.
    HINWEIS: Das Hacken der Medullae dauert normalerweise ~ 10 min. Um eine gute Ausbeute an Zellen zu erhalten, müssen die gehackten Stücke sehr klein sein, bis sie nicht aufgepeppt werden können.
  8. Entfernen Sie nach der Zentrifugation den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet mit Lockes Lösung durch Pipettieren. Filtern Sie die Zellsuspension mit einem 80-100 μm Sieb und zentrifugieren Sie bei 48 x g, Raumtemperatur, für 3 min mit einer Verzögerung von 3.
  9. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet mit 30 ml Kulturmedium (Tabelle 1). Bestimmen Sie die Zellzahl mit Hämacytometer-Zählkammern25.

2. Transfektion mit Elektroporation

  1. Übertragen Sie 2,8 ×10 6 Zellen in eine 15-ml-Röhre. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 48 × g für 2 min mit einer Verzögerung von 3. Geben Sie 100 μL Transfektionspuffer (siehe Materialtabelle), den der Hersteller dem Zellpellet zur Verfügung stellt, und fügen Sie dann 2 μg des PH-mNG-Plasmids hinzu.
    HINWEIS: Das PH-mNG-Plasmid wurde durch Ersetzen des Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) durch mNG in PH-EGFP15 erzeugt (siehe Materialtabelle).
  2. Mischen Sie die Suspension vorsichtig, indem Sie die Lösung nach oben und unten pipettieren, und übertragen Sie die Mischung unverzüglich in eine Elektroporationsküvette (Abbildung 1E). Übertragen Sie die Küvette sofort auf den Elektroporator (siehe Materialverzeichnis), wählen Sie das O-005-Programm in der Bildschirmliste aus und drücken Sie die Eingabetaste , um die Elektroporation durchzuführen.
    HINWEIS: Bereiten Sie die Zellsuspension für die Transfektion in einer Zellkulturhaube vor. Während des Mischschritts keine Luftblasen in die Suspension einbringen. Fahren Sie ohne Verzögerung mit dem nächsten Schritt fort.
  3. Nach der Elektroporation sofort 1,8 ml Medium in die Küvette geben und vorsichtig mit einem Mikropipettor mischen, der mit einer sterilen Spitze ausgestattet ist. Fügen Sie dann 300 μL der Suspension der elektropolierten Zellen auf das Deckglas (siehe Materialtabelle) in jede Schale und plattieren Sie insgesamt 5-6 Schalen für eine Elektroporationsreaktion.
  4. Das Geschirr vorsichtig für 30 min in einen befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 9% CO 2 geben und nach 30 min vorsichtig2 ml vorerwärmtes Medium zu jedem Gericht geben.
  5. Halten Sie die transfizierten Zellen im befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 9% CO 2 für2-3 Tage vor dem Experiment.
    HINWEIS: Die kultivierten Zellen halten eine Woche lang. Es ist am besten, kultivierte Zellen an den Tagen 2-3 zu verwenden.

3. Vorbereitung für Patch-Clamp-Recording und konfokale Bildgebung

HINWEIS: Dieses Protokoll wurde mit einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop und einem Patch-Clamp-Verstärker mit Spannungs-Clamp-Aufzeichnung zusammen mit einem Lock-in-Verstärker für die Kapazitätsaufzeichnung durchgeführt. Eine konfokale Bildgebung der XY-Ebene an einer festen Z-Ebene (XY/Zfixed scanning) wurde verwendet, um alle drei fluoreszierenden Signale gleichzeitig abzubilden. Die Z-Ebene wurde auf den Zellboden fokussiert, wo die Plasmamembran an den Deckgläsern haftete.

  1. Beobachten Sie am Tag des Patch-Clamp- und Imaging-Experiments die Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop. Verwenden Sie Hellfeld, um sicherzustellen, dass die Zellkultur nicht kontaminiert ist (Abbildung 1F), und Epifluoreszenz, um die korrekte Expression des fluoreszierend markierten Proteins zu überprüfen.
    HINWEIS: Zum Beispiel wird PH-mNG an der Plasmamembran von ~ 20-30% der Zellen exprimiert.
  2. Bereiten Sie Patchpipetten aus Borosilikatglaskapillaren vor. Ziehen Sie dazu die Pipetten mit einem Pipettenzieher, beschichten Sie ihre Spitzen mit flüssigem Wachs und polieren Sie sie mit einer Mikroschmiede (siehe Materialtabelle).
  3. Schalten Sie den Patch-Clamp-Aufnahmeverstärker ein und starten Sie die Patch-Clamp-Aufnahmesoftware (siehe Materialtabelle). Stellen Sie die entsprechenden Parameter für die Calciumstrom- und Kapazitätserfassung in der Software ein (siehe Materialtabelle).
    1. Stellen Sie ein Aufzeichnungsprotokoll von insgesamt 60 s Dauer ein, wobei die Stimulation bei 10 s beginnt.
    2. Stellen Sie das Haltepotential für die Spannungsklemmaufzeichnung auf -80 mV ein. Stellen Sie eine 1 s Depolarisation von -80 mV auf 10 mV als Stimulus ein, um Kalziumeinstrom und Kapazitätssprung zu induzieren.
    3. Stellen Sie für Kapazitätsmessungen die Frequenz des sinusförmigen Reizes auf einen Bereich von 1.000-1.500 Hz mit einer Spitzenspannung von nicht mehr als 50 mV ein.
  4. Speichern Sie das Protokoll und erstellen Sie eine neue Datei für die Aufzeichnung.
  5. Schalten Sie das konfokale Mikroskopsystem ein und stellen Sie die entsprechenden Parameter in der Software ein (siehe Materialtabelle).
    1. Schalten Sie die Laser ein, einschließlich 458 nm, 514 nm und 633 nm, und stellen Sie den Emissionssammelbereich für jeden Laser entsprechend jeder Fluoreszenzsonde wie folgt ein. FFN511: Anregungswellenlänge (EX), 458 nm; Emissionswellenlänge (EM), 468-500 nm. mNG: EX, 514 nm; EM, 524-560 nm A655: EX, 633 nm; EM, 650-700 nm
    2. Verwenden Sie sequenzielle Bildgebung für FFN511 und mNG, um Übersprechen zwischen diesen beiden Sonden zu vermeiden. Legen Sie für die Bildaufzeichnung einen Zeitraffer von 1 Minute fest (Abbildung 1G).

4. Patch-Clamp-Aufnahme und konfokale Bildgebung

  1. Wählen Sie eine Schale mit gutem Zellzustand und richtiger Expression und geben Sie 2 μL fluoreszierenden falschen Neurotransmitters FFN511 (10 mM Stamm, 1:1.000 Arbeitslösung) in das Medium. Stellen Sie die Schale für 20 Minuten zurück in den Inkubator. Alternativ können Sie FFN511 nach Schritt 3.2 laden und die Schritte 3.3-3.5 ausführen, während Sie warten, um Zeit zu sparen.
  2. Nachdem die FFN511-Beladung abgeschlossen ist, bereiten Sie die Aufnahmekammer vor und geben Sie 2 μL Fluoreszenzfarbstoff A655 in 500 μL der Badlösung (Abbildung 2A und Tabelle 1). Übertragen Sie den Deckglas mit einer Pinzette von der Schale in die Aufzeichnungskammer (siehe Materialtabelle) und fügen Sie sofort eine A655-haltige Badelösung hinzu (Abbildung 2B).
    HINWEIS: Der A655 wird in -20 °C mit einer Konzentration von 10 mM gehalten und die Arbeitskonzentration beträgt 40 μM.
    ACHTUNG: Tragen Sie Handschuhe, um direkten Hautkontakt mit FFN511 oder A655 zu vermeiden.
  3. Legen Sie einen Tropfen Öl (Brechungsindex: 1,518; siehe Materialtabelle) auf das 100-fache Öltauchobjektiv (numerische Apertur = 1,4). Montieren Sie die Kammer im Mikroskop und verwenden Sie den Einstellknopf, damit das Öl einfach den Boden des Deckglases berührt, und tauchen Sie dann die geschliffene Drahtspitze in die Badlösung ein (Abbildung 2C, D).
    HINWEIS: Wählen Sie ein Tauchöl, das für die Arbeit bei Raumtemperatur geeignet ist. Ein Wechsel zwischen der Linse mit niedriger und hoher Vergrößerung ist nicht erforderlich. Die Raumtemperatur wird während der Aufnahme um 20-22 °C gehalten.
  4. Bringen Sie die Zellen in den Fokus und verwenden Sie Hellfeld- und konfokale Bildgebung, um eine gute Zelle mit mNG-Expression zu finden. Vergrößern Sie die ausgewählte Zelle und passen Sie sie an die Mitte der Ansicht an, um leere Bereiche zu minimieren.
    HINWEIS: Die schematische Zeichnung der Fluoreszenzmarkierung ist in Abbildung 3A dargestellt. Eine gute Zelle hat normalerweise eine glatte Membran und eine saubere Kante (Abbildung 3B). Bei Epifluoreszenz oder konfokaler Bildgebung scheint eine gute Zelle einen großen und flachen Boden mit heller mNG-Expression zu haben (Abbildung 3C).
    Die Pixelgröße beträgt ~50 nm, in einem Bereich von ~40-80 nm je nach Zellgröße und Zoomfaktor.
  5. Richten Sie Parameter für die konfokale Bildgebung der XY-Ebene bei einer festen Z-Ebene (XY/ZFixed Scanning) von FFN511, PH-mNG und A655 mit einem minimierten Zeitintervall ein. Stellen Sie den Fokus mit dem Feinjustierknopf auf die Unterseite der Zelle ein.
    HINWEIS: PH-mNG signalisiert die Kontur der Zellplasmamembran am konfokalen XY-Ebenenquerschnitt (außer dem Zellboden). In der Nähe des Zellmembranbodens können A655-Flecken beobachtet werden, die Ω-förmige oder B-förmige Membraninvaginationen widerspiegeln. Wenn die Z-fokale Ebene niedriger ist als der Zellboden, wird die Intensität der gesamten Fluoreszenz schwächer.
  6. Stellen Sie die Anregungslaserleistung in der Software ein, um eine Einstellung zu finden, um das beste Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten und eine signifikante Fluoreszenzbleiche zu vermeiden. Beginnen Sie dazu mit einem anfänglichen Testwert von 2,5 mW Leistung für FFN511 angeregt bei 458 nm und 1 mW für mNG angeregt bei 514 nm. Für A655, der mit einem HeNe-Laser bei 633 nm angeregt wird, verwenden Sie eine hohe Laserleistung, ~ 12-15 mW (dh 70% -80% des Maximums), die bei kontinuierlicher Anregung alle fluoreszierenden A655 in einem Ω-förmigen Profil bleichen kann, wenn seine Pore geschlossen ist.
    HINWEIS: Wenn die Laserleistung zu hoch ist, wird die PH-mNG- und FFN511-Fluoreszenz schnell gebleicht. Wenn die Laserleistung zu niedrig ist, sind die Signale zu schwach oder verrauscht, um analysiert zu werden.
  7. 9 μL interne Lösung (Tabelle 1) in eine Patchpipette geben und die Pipette an der Halterung in der Patch-Clamp-Verstärkerstufe befestigen (siehe Materialtabelle).
  8. Wenden Sie mit einer Spritze eine kleine Menge Überdruck an und bewegen Sie die Pipettenspitze, um die Badelösung mit einem Mikromanipulator zu berühren. Stellen Sie sicher, dass der Verstärker anzeigt, dass der Pipettenwiderstand ~ 2-4 MΩ mit einem Spannungsimpulstest beträgt. Drücken Sie LJ/Auto, um die Flüssigkeitsverbindung abzubrechen.
  9. Bewegen Sie die Pipette mit dem Mikromanipulator in Richtung der ausgewählten Zelle. Um einen zellgebundenen Modus zu bilden, bewegen Sie die Pipettenspitze, um die Zelle zu berühren (der Widerstand nimmt zu); Unterdruck sanft mit der Spritze ausüben (Widerstand erhöht sich auf mehr als 1 GΩ), Ändern Sie das Haltepotential von 0 auf -80 mV.
  10. Sobald der Widerstand 1 GΩ überschritten hat, warten Sie ~ 30 s, bis sich die Konfiguration stabilisiert hat. Drücken Sie C-fast/Auto, um die schnelle Kapazität zu kompensieren.
  11. Um einen Ganzzellenmodus zu bilden, wenden Sie einen gepulsten kurzen, aber starken Unterdruck mit der Spritze an, um die Membran zu reißen (die Form des Stromimpulses ändert sich mit einem geladenen und entladenen Membrankondensator). Drücken Sie C-slow/Auto, um die langsame Kapazität zu kompensieren.
  12. Passen Sie den Bildgebungsfokus leicht an, um sich auf den Zellboden zu konzentrieren. Starten Sie die konfokale Zeitrafferbildgebung und die Patch-Clamp-Aufzeichnung gleichzeitig, indem Sie gleichzeitig auf die Startschaltflächen in den beiden verschiedenen Softwareanwendungen klicken.
    HINWEIS: Die konfokale Bildgebungssoftware macht einen Film mit einer Rate von ~ 20-90 ms / Bild. Die Patch-Clamp-Aufzeichnung umfasst den Ruhezustand für 10 s, die 1 s Depolarisationsstimulation und weitere 49 s nach der Stimulation. Die Patch-Clamp-Konfiguration ermöglicht die Aufzeichnung von Kalziumstrom, Kapazitätssprung und Zerfall, der durch die 1 s-Depolarisation von -80 bis +10 mV induziert wird (Abbildung 3D).
  13. Sobald die Aufzeichnung abgeschlossen ist, stellen Sie sicher, dass die Daten gespeichert sind. Ändern Sie das Haltepotenzial wieder auf 0 mV. Bewegen Sie die Pipette aus der Badelösung und entsorgen Sie sie.
  14. Wiederholen Sie die Schritte 4.7-4.13, um eine weitere Zelle in der Schüssel aufzuzeichnen. Wechseln Sie nach 1 Stunde der Aufnahme zu einer anderen Schüssel.
    HINWEIS: Nach 1 Stunde der Aufnahme nimmt die Erfolgsrate der Patch-Clamp-Aufnahme deutlich ab. Um die Effizienz der Datenerfassung zu erhöhen, wird die Aufzeichnung für nur 1 Stunde in jedem Gericht empfohlen.

5. Patch-Clamp-Datenanalyse

  1. Öffnen Sie die entsprechende Software (siehe Materialverzeichnis) für die Datenanalyse. Klicken Sie auf die PPT-| PULSE-Datei | laden Dateischaltflächen zum Laden der .dat Datei. Klicken Sie auf Ausführen , und vier Spuren werden automatisch in einem Diagramm dargestellt, einschließlich der Calciumstrom- und Kapazitätsspuren.
  2. Klicken Sie auf die Windows-| Neue Diagrammschaltflächen , wählen Sie die Pulse_1_1_1, die erste Welle in Y-Welle(n) aus und klicken Sie auf Ausführen , um das Kalziumstromdiagramm zu plotten. Klicken Sie auf die Windows-| Neue Tabellenschaltflächen , wählen Sie die Pulse_1_1_1 aus und klicken Sie auf Ausführen , um die Rohdaten des Kalziumstroms anzuzeigen, mit denen die gemittelte Spur mehrerer Zellen dargestellt werden kann.
  3. Zeichnen Sie ein Quadrat entsprechend im Kalziumstromdiagramm, klicken Sie mit der rechten Maustaste und erweitern Sie das Stromsignal, um die Basislinie und die Spitze des Kalziumstroms einzubeziehen. Klicken Sie auf Diagramm | Info anzeigen , um die Cursor A und B anzuzeigen und sie auf die Baseline bzw. den Peak zu verschieben. Die Diagramminformationen werden unten angezeigt und die Parameter können geschätzt werden.
  4. Wiederholen Sie Schritt 5.2, aber wählen Sie die Pulse_1_1_1_Cm, die zweite Welle in Y-Welle(n), um die Kapazitätsspur zu plotten. Wiederholen Sie Schritt 5.3, und platzieren Sie die A- und B-Cursor an der entsprechenden Position, um die Kapazitätsparameter wie Basislinie, Amplitude und Abklingrate zu messen.
  5. Kopieren Sie Rohdaten in Schritt 5.2 in eine Tabelle, berechnen Sie den Mittelwert und den Standardfehler des Mittelwerts für eine Gruppe aufgezeichneter Zellen und zeichnen Sie die gemittelten Spuren des Kalziumstroms und der Membrankapazität (Abbildung 3E) in einer geeigneten Software auf.

6. Konfokale Bilddatenanalyse

  1. Öffnen Sie die Rohbilddateien mit einer vom Hersteller bereitgestellten Software (siehe Materialverzeichnis).
    HINWEIS: Einige andere kostenlose Programme, wie ImageJ oder Fiji, könnten für die Datenverarbeitung und Quantifizierung der in Abschnitt 4 erhaltenen Bilder verwendet werden.
  2. Klicken Sie auf | verarbeiten ProcessTools und verwenden Sie die Tools, um gleitende Durchschnittsdateien (z. B. gleitender Durchschnitt für jeweils 4 Bilder) für jedes Zeitrafferbild zu generieren und diese Dateien zu speichern.
    HINWEIS: Nach dem gleitenden Durchschnitt könnte eine entsprechende Anpassung der Helligkeit und des Hintergrunds vorgenommen werden, um die Fluoreszenzänderungen von drei Kanälen besser darzustellen, was zur Identifizierung von Fusionsereignissen beitragen kann. Überprüfen Sie die Fluoreszenzintensität in einigen Regionen ohne Fusionsereignis kann helfen, das fluoreszierende Signal von Fusionsereignissen von Hintergrundsignalen zu unterscheiden.
  3. Klicken Sie auf die Schaltflächen | quantifizieren Tools | Stack Profile, überprüfen Sie die Zeitpunkte vor und nach der Stimulation, um Fluoreszenzänderungen in jedem Kanal zu identifizieren. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ellipse zeichnen , um die Regionen von Interesse (ROIs) für Fusionsereignisse einzukreisen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Bild und klicken Sie auf ROIs speichern, um die ROIs zu speichern .
    HINWEIS: Die Größe des ROI, der alle drei fluoreszierenden Signale abdeckt, war ähnlich wie die Vesikelgröße in Chromaffinzellen24. Für die Analyse wurden Rohdaten verwendet, während die rollierenden Mittelungsdaten, die das Signal-Rausch-Verhältnis erhöhen, zur Verfügung gestellt wurden, um die drei Signale deutlich zu zeigen.
  4. Klicken Sie auf Projekte öffnen , um die RAW-Datei zu suchen, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Bild und klicken Sie auf ROIs laden, um die ROI-Datei in die Rohbilddateien zu laden , um die Fluoreszenzintensitäten zu messen.
    HINWEIS: Das rohe Fluoreszenzsignal wird verwendet, um Spuren verschiedener Kanäle darzustellen. Für jeden ROI wird die Baseline als die Intensität vor der Stimulation definiert, und die Intensitätsspuren können auf die Baseline normalisiert werden.
  5. Klicken Sie | auf Extras Sortieren Sie ROIs in der Software und zeichnen Sie die Spuren für alle drei Kanäle jedes ROI. Klicken Sie auf Bericht , um die ROI-Daten, einschließlich digitaler Daten und Imaging-Traces für jeden ROI, in einem Dateiordner zu speichern.
    1. Identifizieren Sie ein Fusionsereignis durch die gleichzeitige Erhöhung der Intensität der PH-mNG (FPH) und A655 (F655) Spotfluoreszenz (innerhalb eines einzelnen Frames), begleitet von einer Abnahme der FFN511-Spotfluoreszenz (FFFN).
    2. Achten Sie auf das Auftreten von F PH und F 655, was auf die Bildung von PH-mNG / A655-Punkten aufgrund eines durch Fusion erzeugten Ω-Profils hinweist, das die Diffusion von PH-mNG aus der Plasmamembran und die anhaltende Diffusion vonA655 aus dem Bad ermöglicht.
    3. Achten Sie auf FFFN-Abnahme , was auf seine Freisetzung aus einem Vesikel aufgrund der Öffnung der Fusionsporen hinweist und die Möglichkeit ausschließt, dass das Aussehen von FPH und F655 von einer durch Endozytose verursachten Membraninvagination herrühren kann.
    4. Überprüfen Sie diefesten Zeitraffer-XY/Z-Bilder, die Fusionsereignisse auf dem Zellboden zeigen. Analysieren Sie drei Modi von Fusionsereignissen: 1) Close-Fusion, 2) Stay-Fusion und 3) Shrink-Fusion.
      HINWEIS: Fusionsereignisse wurden selten vor der Depolarisation beobachtet, während Dutzende von Fusionsereignissen nach der Depolarisation beobachtet werden konnten. Nach der Fusion kann das Ω-Profil seine Pore schließen, seine offene Pore beibehalten oder schrumpfen, um mit der Plasmamembran zu verschmelzen.
      1. Um eine enge Fusion zu identifizieren, suchen Sie nach einer Verdunkelung von F 655, da der Fusionsporenverschluss den Austausch von Bad A655 verhindert, während F PH anhält, was die fortgesetzte Umwandlung von PtdIns(4,5)P2 in PtdIns(4)P widerspiegelt, oder FPH zerfällt mit einer Verzögerung, die das Einklemmen des Vesikels widerspiegelt (Close-Fusion, Abbildung 4A,B).
      2. Suchen Sie nach anhaltenden FPH und F655, um die Stay-Fusion zu identifizieren (Abbildung 4C).
      3. Suchen Sie nach parallelen Abnahmen von FPH und F655, was auf eine Schrumpfung Ω-Profils hinweist, um die Schrumpffusion zu identifizieren (Abbildung 4D).
        HINWEIS: Überprüfen Sie die ursprünglichen Imaging-Dateien, um die Imaging-Ablaufverfolgungen zu überprüfen, wenn der Ereignistyp nicht sicher ist. Die Überprüfung der Fluoreszenzintensität in einigen Regionen ohne Fusionsereignis kann helfen, das Fluoreszenzsignal von Fusionsereignissen von Hintergrundsignalen zu unterscheiden.
  6. Zeichnen Sie repräsentative Spuren von Intensitätsänderungen für diese drei Kanäle auf: FFN511, PH-mNG und A655. Quantifizieren Sie den Prozentsatz der verschiedenen Fusionsmodi in jeder Zelle und zeichnen Sie die Zahlen auf.

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Ergebnisse

Nach den in Abbildung 1 und Abbildung 2 gezeigten experimentellen Verfahren wurden chromaffine Zellen aus den Nebennieren der Rinder mit PH-mNG transfiziert, um die Plasmamembran zu markieren; A655 wurde der Badlösung hinzugefügt, um einen Fusionsporenverschluss zu erkennen; und der fluoreszierende falsche Neurotransmitter FFN511 wurde in Vesikel geladen, um die Freisetzung nachzuweisen. Als nächstes wurde die konfokale Zeitrafferbildgebung der XY-Ebene von F...

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Diskussion

Ein konfokales mikroskopisches Bildgebungsverfahren wird beschrieben, um die Dynamik der Fusionsporen- und Transmitterfreisetzung sowie drei Fusionsmodi, Close-Fusion, Stay-Fusion und Shrink-Fusion in bovinen Nebennieren-Chromaffin-Zellenzu erkennen 4,24. Es wird eine elektrophysiologische Methode beschrieben, um die Zelle zu depolarisieren und dadurch Exo- und Endozytose hervorzurufen. Die systematische konfokale Bildverarbeitung liefert Informationen über vers...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken den NINDS Intramural Research Programs (ZIA NS003009-13 und ZIA NS003105-08) für die Unterstützung dieser Arbeit.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Adenosine 5'-triphosphate magnesium saltSigmaA9187-500MGATP for preparing internal solution
Atto 655ATTO-TEC GmbHAD 655-21Atto dye to label bath solution
Basic Nucleofector for Primary NeuronsLonzaVSPI-1003Electroporation transfection buffer along with kit
Boroscilicate capillary glass pipetteWarner Instruments64-0795Standard wall with filament OD=2.0 mm ID=1.16 mm Length=7.5 cm
Bovine serum albuminSigmaA2153-50GReagent for gland digestion
Calcium Chloride 2 MQuality Biological351-130-721Reagent for preparing bath solution
Cell Strainers, 100 µmFalcon352360Material for filtering chromaffin cell suspension
Cesium hydroxide solutionSigma232041Reagent for preparing internal solution and Cs-glutamate/Cs-EGTA stock buffer
Collagenase PSigma11213873001Enzyme for gland digestion
CoverslipNeuvitroGG-14-LamininGG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 thick 60 pieces Laminin coated German coverslips
D-(+)-GlucoseSigmaG8270-1KGReagent for preparing Locke’s solution and bath solution
DMEMThermoFisher Scientific11885092Reagent for preparing culture medium
EGTASigma324626-25GMReagent for preparing Cs-EGTA stock buffer for bath solution
Electroporation and NucleofectorAmaxa BiosystemsNucleofector IITransfect plasmids into cells
Fetal bovine serumThermoFisher Scientific10082147Reagent for preparing culture medium
FFN511Abcamab120331Fluorescent false neurotransmitter to label vesicles
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrateSigmaG8877-250MGGTP for preparing internal solution
HEPESSigmaH3375-500GReagent for preparing Locke’s solution
Igor ProWaveMetricsIgor proSoftware for patch-clamp analysis and imaging data presentation
Leica Application Suite X softwareLeicaLAS X softwareConfocal software for imaging data collection and analysis
Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning MicroscopeLeicaLeica TCS SP5Confocal microscope for imaging data collection
L-Glutamic acidSigma49449-100GReagent for preparing Cs-glutamate stock buffer for bath solution
Lock-in amplifierHekaLock-inSoftware for capacitance recording
Magnesium Chloride 1 MQuality Biological351-033-721EAReagent for preparing internal solution and bath solution
Metallized Hemacytometer Hausser Bright-LineHausser Scientific3120Counting chamber
MicroforgeNarishigeMF-830Polish pipettes to enhance the formation and stability of giga-ohm seals
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µmMilliporeSLGPR33RBMaterial for glands wash and digestion
mNG(mNeonGreen)Allele BiotechnologyABP-FP-MNEONSBTemplate for PH-mNeonGreen construction
Nylon mesh filtering screen 100 micronEIKO filtering co03-100/32Material for filtering medulla suspension
Patch clamp EPC-10HekaEPC-10Amplifier for patch-clamp data collection
PH-EGFPAddgenePlasmid #51407Backbone for PH-mNeonGreen construction
Pipette pullerSutter InstrumentP-97Make pipettes for patch-clamp recording
Potassium ChlorideSigmaP5404-500GReagent for preparing Locke’s solution and bath solution
Pulse softwareHekaPulseSoftware for patch-clamp data collection
Recording chamberWarner Instruments64-1943/QR-40LPcoverslip chamber, apply patch-clamp pipette on live cells
Sodium chlorideSigmaS7653-1KGReagent for preparing Locke’s solution, bath solution and internal solution
Sodium hydroxideSigmaS5881-500GReagent for preparing Locke’s solution
Sodium phosphate dibasicSigmaS0876-500GReagent for preparing Locke’s solution
Sodium phosphate monobasicSigmaS8282-500GReagent for preparing Locke’s solution
Stirring hot plateBarnsted/Thermolynetype 10100Heater for pipette coating with wax
Syringe, 30 mLBecton Dickinson302832Material for glands wash and digestion
Tetraethylammonium chlorideSigmaT2265-100GTEA for preparing bath solution
Trypsin inhibitorSigmaT9253-5GReagent for gland digestion
Type F Immersion liquidLeica195371-10-9Leica confocal mounting oil

Referenzen

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