Automatisiertes Charting des visuellen Raums von Stubenfliegen-Facettenaugen

Zusammenfassung

Das Protokoll beschreibt hier die Messung der räumlichen Organisation der visuellen Achsen von Stubenfliegenaugen, abgebildet durch ein automatisches Gerät, unter Verwendung des Pseudopupillenphänomens und des Pupillenmechanismus der Photorezeptorzellen.

Zusammenfassung

Dieses Papier beschreibt die automatische Messung der räumlichen Organisation der Sehachsen von Insektenfacettenaugen, die aus mehreren tausend visuellen Einheiten bestehen, die Ommatidien genannt werden. Jedes Ommatidium tastet die optische Information aus einem kleinen Raumwinkel ab, mit einer ungefähren Gauß-verteilten Empfindlichkeit (halbe Breite in der Größenordnung von 1°), zentriert um eine visuelle Achse. Zusammen sammeln die Ommatidien die visuellen Informationen aus einem fast panoramischen Sichtfeld. Die räumliche Verteilung der Sehachsen bestimmt somit die räumliche Auflösung des Auges. Die Kenntnis der optischen Organisation eines Facettenauges und seiner Sehschärfe ist entscheidend für quantitative Untersuchungen der neuronalen Verarbeitung der visuellen Information. Hier stellen wir ein automatisiertes Verfahren zur Abbildung der visuellen Achsen eines Facettenauges vor, wobei ein intrinsisches, in vivo optisches Phänomen, die Pseudopupille und der Pupillenmechanismus der Photorezeptorzellen verwendet werden. Wir skizzieren den optomechanischen Aufbau zum Scannen von Insektenaugen und verwenden experimentelle Ergebnisse einer Stubenfliege, Musca domestica, um die Schritte im Messverfahren zu veranschaulichen.

Einleitung

Die Kompaktheit visueller Insektensysteme und die Agilität ihrer Besitzer, die eine hochentwickelte visuelle Informationsverarbeitung demonstrieren, haben Menschen mit wissenschaftlichem und nicht-wissenschaftlichem Hintergrund fasziniert. Insektenfacettenaugen wurden als leistungsstarke optische Geräte anerkannt, die akute und vielseitige Sehfähigkeiten^{ermöglichen 1,2}. Fliegen zum Beispiel sind bekannt für ihre schnellen Reaktionen auf sich bewegende Objekte, und Bienen sind berühmt für ihre Farb- und Polarisationsvision².

Die Facettenaugen von Arthropoden bestehen aus zahlreichen anatomisch ähnlichen Einheiten, den Ommatidien, von denen jede von einer Facettenlinse bedeckt ist. Bei Diptera (Fliegen) nähert sich die Anordnung von Facettenlinsen, die zusammen als Hornhaut bekannt sind, oft einer Hemisphäre an. Jedes Ommatidium tastet einfallendes Licht aus einem kleinen Raumwinkel mit halber Breite in der Größenordnung von 1° ab. Die Ommatidien der beiden Augen zusammen tasten ungefähr den vollen Raumwinkel ab, aber die visuellen Achsen der Ommatidien sind nicht gleichmäßig verteilt. Bestimmte Augenpartien haben eine hohe Dichte an Sehachsen, wodurch eine Region von hoher räumlicher Schärfe entsteht, die umgangssprachlich als Fovea bezeichnet wird. Der verbleibende Teil des Auges hat dann eine gröbere räumliche Auflösung^von 3,4,5,6,7,8,9.

Eine quantitative Analyse der optischen Organisation der Facettenaugen ist entscheidend für detaillierte Untersuchungen der neuronalen Verarbeitung visueller Informationen. Untersuchungen der neuronalen Netzwerke des Gehirns eines Insekts¹⁰ erfordern oft Kenntnisse über die räumliche Verteilung der ommatidialen Achsen. Darüber hinaus haben Facettenaugen mehrere technische Innovationen inspiriert. Viele Initiativen zur Herstellung von bio-inspirierten künstlichen Augen wurden auf bestehenden quantitativen Studien von echten Facettenaugen^{aufgebaut 11,12,13}. Zum Beispiel wurde ein halbleiterbasierter Sensor mit hoher räumlicher Auflösung basierend auf dem Modell der Insektenfacettenaugen 11,14,15,16,17 entwickelt. Die bisher entwickelten Geräte haben jedoch nicht die tatsächlichen Eigenschaften bestehender Insektenaugen umgesetzt. Genaue Darstellungen von Insektenfacettenaugen und ihrer räumlichen Organisation erfordern detaillierte und zuverlässige Daten von natürlichen Augen, die nicht umfassend verfügbar sind.

Der Hauptgrund für den Mangel an Daten ist die extreme Langeweile der verfügbaren Verfahren zur Darstellung der räumlichen Eigenschaften der Augen. Dies hat zu Versuchen geführt, ein stärker automatisiertes Eye-Mapping-Verfahren zu etablieren. In einem ersten Versuch automatisierter Analysen von Insektenfacettenaugen entwickelten Douglass und^{Wehling 18} ein Scanverfahren zur Abbildung von Facettengrößen in der Hornhaut und demonstrierten dessen Machbarkeit für einige wenige Fliegenarten. Hier erweitern wir ihren Ansatz, indem wir Methoden entwickeln, um nicht nur die Facetten der Hornhaut zu scannen, sondern auch die visuellen Achsen der Ommatidien zu beurteilen, zu denen die Facetten gehören. Wir stellen den Fall der Stubenfliegenaugen vor, um die damit verbundenen Verfahren zu veranschaulichen.

Der Versuchsaufbau für scannende Insektenaugen ist: teilweise optisch, d.h. ein Mikroskop mit Kamera und Beleuchtungsoptik; teilweise mechanisch, d.h. ein Goniometersystem zum Drehen des untersuchten Insekts; und teilweise rechnerisch, d.h. die Verwendung von Softwaretreibern für die Instrumente und Programme zur Durchführung von Messungen und Analysen. Die entwickelten Methoden umfassen eine Reihe von Rechenverfahren, von der Aufnahme von Bildern, der Auswahl von Kamerakanälen und der Festlegung von Bildverarbeitungsschwellenwerten bis hin zur Erkennung einzelner Facettenpositionen über helle Lichtflecken, die von ihren konvexen Oberflächen reflektiert werden. Fourier-Transformationsmethoden waren in der Bildanalyse entscheidend, sowohl für die Erkennung einzelner Facetten als auch für die Analyse der Facettenmuster.

Das Papier ist wie folgt aufgebaut. Wir stellen zunächst den Versuchsaufbau und das Pseudopupillenphänomen vor - den optischen Marker, der verwendet wird, um die visuellen Achsen der Photorezeptoren in lebenden Augen zu identifizieren 19,20,21. Anschließend werden die Algorithmen skizziert, die im Scanvorgang und in der Bildanalyse verwendet werden.

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Protokoll

Das Protokoll entspricht den Insektenpflegerichtlinien der Universität.

1. Zubereitung einer Stubenfliege, Musca domestica

1. Sammle die Fliege von der im Labor aufgezogenen Population. Legen Sie die Fliege in den Messinghalter (Abbildung 1).
   1. Schneiden Sie 6 mm aus dem oberen Teil des Rückhalterohrs (siehe Materialtabelle). Der neue obere Teil des Rohres hat einen Außendurchmesser von 4 mm und einen Innendurchmesser von 2,5 mm (Abbildung 1A). Legen Sie die lebende Fliege in das Rohr, versiegeln Sie das Rohr mit Baumwolle, um eine Beschädigung der Fliege zu verhindern, und drücken Sie die Fliege so, dass der Kopf aus dem Rohr herausragt und ihr Körper zurückgehalten wird (Abbildung 1B). Immobilisieren Sie den Kopf mit Bienenwachs, so dass die Augen unbedeckt bleiben (Abbildung 1C-E).
   2. Schneiden Sie das Rohr erneut so ab, dass die Rohrlänge 10 mm beträgt (Abbildung 1C). Legen Sie das Kunststoffrohr mit der Fliege in den Messinghalter, so dass ein Auge der Fliege nach oben zeigt, wenn der Halter auf einer Tischplatte ruht (Abbildung 1D, E).
2. Stellen Sie die Ausrichtung der Röhre so ein, dass bei einer Goniometerhöhe bei 0° (d. h. der Azimuttisch befindet sich in einer horizontalen Position) der vertikale Beleuchtungsstrahl des Mikroskops senkrecht zur Augenoberfläche in einem zentralen Bereich, zwischen ventral und dorsal, und zwischen vorderen und hinteren Rändern des Auges steht, so dass das ganze Auge innerhalb des durch das Setup erlaubten Azimut- und Höhenbereichs gescannt werden kann.

2. Ausrichtung der rotierenden Azimutachse des Goniometers auf die optische Achse des Mikroskops

1. Montieren Sie einen Ausrichtungsstift auf der Azimut-Rotationsstufe, so dass die x-y-Position der Spitze so eingestellt werden kann, dass sie mit der Azimutachse auf der motorisierten Stufe übereinstimmt. Konzentrieren Sie sich beim Betrachten mit dem Mikroskop, das mit einem 5-fachen Objektiv ausgestattet ist, mit dem Joystick der z-Achse auf die Spitze (Abbildung 2).
2. Richten Sie die x-y-Einstellung der Azimutachse mit der optischen Achse des Mikroskops aus und stellen Sie sicher, dass die Höhen- und Azimut-Drehachsen mit den x- und y-Achsen-Joysticks mit dem zentrierten Pin vorausgerichtet sind.
3. Manipulieren Sie die Azimut- und Höhen-Joysticks, um zu überprüfen, ob der Pin in Bezug auf beide Freiheitsgrade zentriert ist. Wenn die Stiftspitze gut zentriert ist, bleibt sie während der Azimut- und Höhenrotationen ungefähr in der gleichen Position.

3. Ausrichtung des Fliegenauges mit den motorisierten Stufen

1. Wenn die Höhenstufe bei 0° ist, montieren Sie die Fliege und ihre Halterung auf der Azimutstufe. Beobachten Sie das Auge der Fliege mit dem Mikroskop.
2. Stellen Sie bei eingeschalteter Beleuchtungs-LED die horizontale Position der Fliege so ein, dass die Mitte der Pseudopupille mit dem Mikroskop ausgerichtet ist. Passen Sie die vertikale Position der Fliege mit der rotierenden Schraube des Halters an (Abbildung 1D), so dass die tiefe Pseudopupille (DPP; Abbildung 3) 19,20,21 wird auf der Ebene der Höhenachse in den Fokus gerückt.
3. Richten Sie den DPP in Bezug auf die Azimut- und Höhenachse aus, indem Sie ihn im Sichtfeld zentrieren (siehe Abbildung 2). Verwenden Sie die Magnete, die auf die Unterseite des Fliegenhalters geklebt sind, um ihn fest auf einer auf der Azimutstufe montierten Eisenplatte zu befestigen, während manuelle Schiebeeinstellungen möglich sind.
   1. Schalten Sie die Ansicht auf die am Mikroskop montierte Digitalkamera um. Führen Sie die Softwareinitialisierung des GRACE-Systems aus, einschließlich der Initialisierung der Motorsteuerungen und des Arduino-LED-Controllers (Abbildung 4). Öffnen Sie daher MATLAB R2020a oder eine höhere Version. Führen Sie das MATLAB-Skript Initialize_All_Systems (Supplementary File 1) aus.
4. Vergewissern Sie sich, ob sich die Pseudopupille der Fliege (Abbildung 3B,C) in der Mitte des projizierten Bildes auf dem Computerbildschirm befindet.

4. Autofokus und Autozentrierung

1. Bringen Sie den Fokus auf die Ebene der Hornhaut-Pseudopupille (CPP; Abbildung 3B) 19,20,21 ^manuell mit dem Joystick der Z-Achse.
2. Führen Sie den Autofokus-Algorithmus (Supplementary File 1, Skript AF) aus, um ein scharfes Bild auf Hornhautebene zu erhalten. Überprüfen Sie, indem Sie den Fokus auf die DPP-Ebene zurücksetzen, indem Sie die motorisierte Z-Achsenstufe einstellen. Speichern Sie den Abstand zwischen DPP und CPP (in Motorschritten).
3. Feinabstimmung der Pseudopupillenzentrierung durch Ausführen des Autozentrieralgorithmus (Zusatzdatei 1, Skript AC). Bringen Sie den Fokus zurück auf die CPP-Ebene.
4. Führen Sie den Autofokusalgorithmus erneut aus. Nullen Sie die motorisierten Stufen an ihren aktuellen Positionen (X,Y,Z,E,A) = (0,0,0,0,0), wobei E die Höhe und A das Azimut ist.
5. Führen Sie den Scan-Algorithmus (Supplementary File 1, Skript Scan_Begin) aus, der Augenbilder entlang von Trajektorien in 5°-Schritten abtastet, während er die Autozentrierungs- und Autofokusalgorithmen ausführt.
6. Schalten Sie am Ende der Probenahme den LED-Controller und die Motorsteuerungen aus.
7. Verarbeiten Sie die Bilder unter Anwendung der Bildverarbeitungsalgorithmen (Supplementary File 1, Skript ImProcFacets).

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Ergebnisse

Tiere und optische Stimulation
Die Experimente werden an Stubenfliegen (Musca domestica) durchgeführt, die aus einer Kultur stammen, die von der Abteilung für Evolutionäre Genetik der Universität Groningen unterhalten wird. Vor den Messungen wird eine Fliege immobilisiert, indem sie mit einem Low-Melting-Point-Wachs in ein gut passendes Rohr geklebt wird. Die Fliege wird anschließend auf der Bühne eines motorisierten Goniometers montiert. Die Mitte der beiden Drehtische fällt mit dem B...

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Diskussion

Die räumliche Verteilung der Sehachsen von Stubenfliegenaugen kann mit Hilfe des Pseudopupillenphänomens der Facettenaugen und der Reflexionsänderungen, die durch den lichtabhängigen Pupillenmechanismus verursacht werden, kartiert werden. Daher ist eine untersuchte Fliege in einem goniometrischen System montiert, das die Inspektion des lokalen Facettenmusters mit einem Mikroskop-Setup ermöglicht, das mit einer Digitalkamera ausgestattet ist, alles unter Computersteuerung. Die Bildanalyse liefert Eyemaps. Eine wesent...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digital Camera	PointGrey	BFLY-U3-23S6C-C	Acquision of amplified images and digital communication with PC
High power star LED	Velleman	LH3WW	Light source for observation and imaging the compound eye
Holder for the investigated fly	University of Groningen		Different designs were manufactured by the university workshop
Linear motor	ELERO	ELERO Junior 1, version C	Actuates the upper microscope up and down. (Load 300N, Stroke speed 15mm/s, nominal current 1.2A)
Low temperature melting wax	various		The low-temperature melting point wax serves to immobilize the fly and fix it to the holder
Microscope	Zeiss		Any alternative microscope brand will do; the preferred objective is a 5x
Motor and LED Controller	University of Groningen	Z-o1	Designed and built by the University of Groningen and based on Arduino and Adafruit technologies.
Motorized Stage	Standa (Vilnius, Lithuania)	8MT175-50XYZ-8MR191-28	A 6 axis motorized stage modified to have 5 degrees of freedom.
Optical components	LINUS		Several diagrams and lenses forming an epi-illumination system (see Stavenga, Journal of Experimental Biology 205, 1077-1085, 2002)
PC running MATLAB	University of Groningen		The PC is able to process the images of the PointGrey camera, control the LED intensity, and send control commants to the motor cotrollers of the system
Power Supply (36V, 3.34A)	Standa (Vilnius, Lithuania)	PUP120-17	Dedicated power supply for the STANDA motor controllers
Soldering iron	various		Used for melting the wax
Stepper and DC Motor Controller	Standa (Vilnius, Lithuania)	8SMC4-USB-B9-B9	Dedicated controllers for the STANDA motorized stage capable of communicating with MATLAB
Finntip-61	Finnpipette Ky, Helsinki	FINNTIP-61, 200-1000μL	PIPETTE TIPS FOR FINNPIPETTES, 400/BOX. It is used to restrain the fly
Carving Pen Shaping/Thread Burning Tool	Max Wax		The tip of the carving pen is designed to transfer wax to the head of fly
MATLAB	Mathworks, Natick, MA, USA	main program plus Image Acquisition, Image Analysis, and Instrument Control toolboxes.	Programming language used to implement the algorithms