Reverse Genetik zur Entwicklung von RNA-Virusvarianten mit positivem Sinn

Zusammenfassung

Das Protokoll beschreibt eine Methode zur Einführung einer kontrollierbaren genetischen Vielfalt in das Genom des Hepatitis-C-Virus durch die Kombination von mutierter RNA-Synthese in voller Länge mit fehleranfälliger PCR und umgekehrter Genetik. Die Methode stellt ein Modell für die Phänotypauswahl dar und kann für 10 kb lange RNA-Virusgenome verwendet werden.

Zusammenfassung

Das Fehlen einer geeigneten Methode für die iterative Generierung verschiedener Virusvarianten in voller Länge hat die Untersuchung der gerichteten Evolution in RNA-Viren behindert. Durch die Integration einer fehleranfälligen PCR mit vollständigem RNA-Genom und umgekehrter Genetik kann eine zufällige genomweite Substitutionsmutagenese induziert werden. Wir haben eine Methode entwickelt, die diese Technik verwendet, um verschiedene Bibliotheken zu synthetisieren, um virale Mutanten mit Phänotypen von Interesse zu identifizieren. Diese Methode, die als Full-Length-Mutanten-RNA-Synthese (FL-MRS) bezeichnet wird, bietet die folgenden Vorteile: (i) die Möglichkeit, eine große Bibliothek über eine hocheffiziente, fehleranfällige PCR in einem Schritt zu erstellen; (ii) die Fähigkeit, Gruppen von Bibliotheken mit unterschiedlichem Grad an genetischer Vielfalt zu erstellen, indem die Genauigkeit der DNA-Polymerase manipuliert wird; iii) die Herstellung eines PCR-Produkts in voller Länge, das direkt als Vorlage für die Synthese mutierter RNA dienen kann; und (iv) die Fähigkeit, RNA zu erzeugen, die als nicht selektierter Input-Pool in Wirtszellen eingebracht werden kann, um nach viralen Mutanten des gewünschten Phänotyps zu suchen. Mit Hilfe eines reversen genetischen Ansatzes haben wir herausgefunden, dass FL-MRS ein zuverlässiges Werkzeug ist, um die virale Evolution in allen Stadien des Lebenszyklus des Hepatitis-C-Virus, JFH1-Isolat, zu untersuchen. Diese Technik scheint ein unschätzbares Werkzeug zu sein, um die gerichtete Evolution einzusetzen, um die Anpassung, Replikation und die Rolle viraler Gene in der Pathogenese und antiviralen Resistenz in RNA-Viren mit positivem Sinn zu verstehen.

Einleitung

Das vorausschauende genetische Screening beginnt mit einem viralen Phänotyp von Interesse und versucht dann, durch Sequenzierung seines Genoms und Vergleich mit dem des ursprünglichen Stammes, die Mutation(en) zu identifizieren, die diesen Phänotyp verursachen. Im Gegensatz dazu werden bei umgekehrten genetischen Screenings zufällige Mutationen in ein Zielgen eingeführt, gefolgt von einer Untersuchung des resultierenden Phänotyps/der resultierenden Phänotypen1. Für den Ansatz der umgekehrten Genetik ist die In-vitro-Mutagenese die am weitesten verbreitete Technik, um einen Pool von Varianten zu erstellen, die anschließend auf interessante Phänotypen untersucht werden. Es wurden verschiedene genetische Werkzeuge beschrieben, um eine genomweite zufällige Mutagenese von RNA-Viren zu erreichen, darunter die fehleranfällige PCR (ep-PCR)^2,3, die zirkuläre Polymerase-Erweiterung⁴ und die Mu-Transposon-Insertionsmutagenese 5,6,7. Die beiden letztgenannten Methoden liefern Bibliotheken mit begrenzter Sequenzvielfalt und sind anfällig für die Einführung großer Insertionen und Deletionen, die für Viren hochgradig tödlich sind und die Genesung infektiöser Virusvarianten stark einschränken.

ep-PCR ist eine bekannte, leistungsstarke Mutagenesetechnik, die im Protein-Engineering weit verbreitet ist, um mutierte Enzyme für die Auswahl von Phänotypen mit gewünschten Eigenschaften wie verbesserter thermischer Stabilität, Substratspezifität und katalytischer Aktivität zu generieren ^8,9,10. Diese Technik ist einfach durchzuführen, da sie eine einfache Ausrüstung erfordert, keine langwierigen Manipulationen erfordert, handelsübliche Reagenzien verwendet und schnell ist. Darüber hinaus generiert es qualitativ hochwertige Bibliotheken.

Hier haben wir eine neuartige Methode zur Synthese von Mutanten-RNAs (FL-MRS) entwickelt, um vollständige Genome des Hepatitis-C-Virus (HCV) durch Integration von ep-PCR zu generieren, die eine zufällige genomweite Substitutionsmutagenese und umgekehrte Genetik induziert. Selbst die Insertion oder Deletion eines einzelnen Nukleotids ist für Positiv-Sense-RNA-Viren ([+]ssRNA) höchst schädlich; Daher ist die PCR-basierte Substitutionsmutagenese die bevorzugte Methode zur iterativen Generierung großer, vielfältiger Bibliotheken von vollständigen (+)ss-RNA-Virusgenomen mit guter Viabilität.

FL-MRS ist ein unkomplizierter Ansatz, der durch das sorgfältige Design eines Primer-Sets, das an den viralen cDNA-Klon bindet, auf jedes Positiv-RNA-Virus mit einer Genomlänge von ~10 kb angewendet werden kann. pJFH1 ist ein infektiöser cDNA-Klon, der für den HCV-Genotyp 2a kodiert und alle Schritte des Viruslebenszyklus rekapitulieren kann. Mit Hilfe des FL-MRS-Ansatzes demonstrierten wir die Synthese von zufällig mutagenisierten vollständigen Genombibliotheken (Mutant Libraries [MLs]), um replikationskompetente JFH1-Varianten zu erzeugen, für die es kein Vorwissen über die Eigenschaften gab, die mit Mutationen verbunden sind. Nach der Exposition gegenüber einem antiviralen Mittel überwanden einige der Virusvarianten schnell den Arzneimitteldruck mit der gewünschten phänotypischen Veränderung. Mit dem hier beschriebenen Protokoll kann eine Vielzahl von Virusvarianten erzeugt werden, was Möglichkeiten schafft, die Evolution von (+)ssRNA-Viren zu untersuchen.

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Protokoll

HINWEIS: Der hier verwendete JFH1-Stamm (WT) war ein freundliches Geschenk von Takaji Wakita, National Institute of Infectious Diseases. Die menschliche Hepatom-Zelllinie, Huh7.5, war ein freundliches Geschenk von Charles Rice, der Rockefeller University. Eine schematische Darstellung des Verfahrens ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Genomweite Substitutionsmutagenese von JFH1 mittels fehleranfälliger PCR

1. Um ep-PCR durchzuführen, wird der Mastermix für vier Versuchsreihen mit den Primern J-For 5'-GTTTTCCCAGTCAGCACGTTGTAAAACGACGGC-3' und J-Rev 5'-CATGATCTGCAGAGAGACCAGTTACGGCACTCTC -3' (Abbildung 1A) zusammen mit den in Tabelle 1 beschriebenen Reaktionskomponenten ohne das pJFH1-Template (aus dem JFH1-Stamm isoliertes Plasmid) vorbereitet.
2. Aliquotieren Sie die Mastermischung in vier Röhrchen, geben Sie 100 ng, 50 ng, 25 ng und 10 ng Template in die einzelnen Röhrchen und stellen Sie das Gesamtvolumen der Reaktion auf 50 μl ein. Wenden Sie die in Tabelle 2 beschriebenen Zyklusbedingungen an, um ein 9736-Basenpaar-Fragment (bp) zu amplifizieren, das den T7-Promotor und das HCV-Genom in voller Länge umfasst (Abbildung 2).
   HINWEIS: Das ep-PCR-Produkt muss die T7-Promotorsequenz enthalten, um die In-vitro-Transkription des viralen Genoms zu erleichtern. Daher muss sich der Vorwärtsprimer stromaufwärts des T7-Promotors des viralen cDNA-Klons befinden, und die umgekehrte Primersequenz sollte am 3'-Ende des Virusgenoms enden, um den Transkriptionsabfluss zu erleichtern. Optimieren Sie jede Komponente der ep-PCR-Reaktion innerhalb des vom Hersteller der Taq-DNA-Polymerase empfohlenen Bereichs, um eine Amplifikation mit hoher Ausbeute zu erreichen. Neben unterschiedlichen Template-Mengen können auch unbalancierte dNTPs (insbesondere niedrige dATP- und/oder dGTP-Konzentrationen) verwendet werden, um die Diversität in der Länge viraler Genome von 6-8 kb Länge zu erhöhen³.
3. Schätzung des amplifizierten ep-PCR-Produkts, indem gleiche Volumina der PCR-Produkte (5 μl) geladen und mit bekannten Mengen einer DNA-Leiter mit 1 Kilobase (kb) verglichen werden, indem eine 0,8%ige Agarose-Gelelektrophorese auf Trisacetat-EDTA (TAE)-Basis durchgeführt^{wird 11}. Reinigen Sie das Produkt mit einem Säulenreinigungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
4. Die Konzentration des gereinigten Produkts wird abgeschätzt, indem die Absorption bei 260 nm mit einem Mikrovolumen-Spektralphotometer¹² gemessen wird. Vakuumkonzentrieren Sie das ep-PCR-Produkt bei Bedarf, um eine Produktkonzentration ≥100 ng/μl zu erhalten.
   HINWEIS: Eine genauere Schätzung kann vorgenommen werden, indem zweifache serielle Verdünnungen des ep-PCR-Produkts geladen und ihre Intensitäten mit den bekannten Mengen der 1 kb DNA-Leiter verglichen werden.

2. Virale RNA-Synthese

1. Richten Sie eine 40-μl-Reaktion ein, um 5 μg klonales pJFH1 mit 4 U XbaI-Enzym bei 37 °C für 2 h zu verdauen, gefolgt von einer Säulenreinigung und der Messung der Absorption bei 260 nm in einem Mikrovolumen-Spektralphotometer¹². Richten Sie eine 20 μL In-vitro-Transkriptionsreaktion des säulengereinigten ep-PCR-Produkts oder des klonalen pJFH1 (WT) unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen RNA-Produktionssystems im großen Maßstab gemäß den Anweisungen des Herstellers ein.
2. In einem 200-μl-Mikrozentrifugenröhrchen werden ca. 1 μg des gereinigten ep-PCR-Produkts (Mutantenbibliotheken) oder XbaI-verdautes klonales pJFH1, 10 μl 2x Puffer mit Ribonukleotiden und 2 μl T7-Enzymmischung gemischt. Mischen Sie alle Komponenten und schleudern Sie die Komponenten kurz herunter. Das Reaktionsgemisch wird bei 37 °C für 45 min inkubiert, gefolgt von der Zugabe von 1 U RNase-freiem DNase-Enzym und der Inkubation bei 37 °C für 30 min (Abbildung 1C).
3. Reinigen Sie in vitro synthetisierte RNA mit einem RNA-Reinigungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers, eluieren Sie in 40 μl RNase- und DNase-freiem Wasser und schätzen Sie die Konzentration der gereinigten RNA ab, indem Sie die Absorption bei 260 nm mit einem Mikrovolumen-Spektralphotometer¹² messen. Bei Bedarf Aliquots herstellen (5 μg oder 2 μg), um Gefrier-Auftauen zu vermeiden, und bei −80 °C lagern. Überprüfen Sie die Integrität und Größe der viralen Transkripte, indem Sie 2 μg RNA für eine MOPS-Formaldehyd-Gelelektrophorese mit 0,8 % Agarose^{verwenden 13} (Abbildung 3).

3. Abschätzung des Anteils von Mutationen in ep-PCR-Produkten (Mutantenbibliotheken)

ANMERKUNG: In diesem Schritt mutiert der Anteil der Nukleotide durch Subklonierung des in Schritt 2 erhaltenen Produkts. Es wurde geschätzt, dass es den Vorteil des Einsatzes von ep-PCR zur Schaffung genetischer Heterogenität unter Verwendung von zwei vollständigen Genommutantenbibliotheken (ML50 und ML25) und klonaler pJFH1-abgeleiteter viraler RNAs demonstriert. Der Anteil der Mutationen wurde im HCV-NS5A-Gen geschätzt, das in dieser Studie auch das phänotypische Auslesegen (Arzneimittelresistenz) war.

1. Richten Sie eine 20-μl-cDNA-Synthesereaktion ein, indem Sie etwa 1 μg der in Schritt 2 synthetisierten viralen RNA, 5 μM Reverse-Primer 5'-GTGTACCTAGTGTGTGCCGCTCTA-3' und 200 U reverse Transkriptase gemäß den Empfehlungen des Herstellers hinzufügen.
2. Amplifizieren Sie mit der cDNA ein 2571 bp-Fragment, das das vollständige NS5A-Gen umfasst. Dazu wird ein Reaktionsgemisch mit 0,5 μM für 5272F- und 7848R-Primer (Endkonzentration; Tabelle 3), 1,5 mM_MgCl2, 1x PCR-Puffer und 1 U High-Fidelity-Taq-Polymerase in einem Gesamtvolumen von 50 μl und führen Sie einen Amplifikationszyklus unter den in Tabelle 4 beschriebenen Bedingungen durch.
3. Lassen Sie das Produkt auf einem Agarose-Gel auf 0,8 % TAE-Basis laufen, um die Produktgröße von 2571 bp zu bestätigen, und reinigen Sie das Produkt dann mit einem Säulenreinigungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Das säulengereinigte Produkt wird in 40 μl sterilem Wasser eluiert.
4. Um dem Produkt einen Überhang von 3' A hinzuzufügen, fügen Sie 0,5 μM dATP und 1 E Low-Fidelity-Taq-DNA-Polymerase hinzu und inkubieren Sie das gesamte PCR-Produkt bei 70 °C für 30 Minuten zusammen mit 1x PCR-Puffer und 1,5 mM MgCl2₍ Endkonzentration). Reinigen Sie das Gemisch mit einem Säulenreinigungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers
   HINWEIS: Alternativ können Sie das ~9,7 kb lange Produkt aus dem Gel aus Schritt 1.4 entfernen. und Klonierung unter Verwendung eines handelsüblichen Kits zum Klonen von Long-PCR-Produkten gemäß den Anweisungen des Herstellers durchführen oder NGS des ep-PCR-Produkts unter Verwendung einer Illumina-Plattform² durchführen.
5. Richten Sie eine Ligationsreaktion ein, indem Sie 5 μl 2-fachen Ligationspuffer, 50 ng der T-Vektor-DNA, etwa den 3-fachen molaren Überschuss der in Schritt 3.4 synthetisierten Insert-DNA, 3 Weiss-Einheiten T4-DNA-Ligase und nukleasefreies Wasser zu einem Gesamtvolumen von 10 μl hinzufügen. Diese Reaktion wird bei Raumtemperatur für 3 h inkubiert und dann 100 μl Escherichia coli DH5α mit der ligierten DNA zugegeben; Hitzeschock der Zellen bei 42 °C für 35 s (Abbildung 1B).
6. 1 ml Luria-Bertani (LB)-Medium (ohne Antibiotikum) zugeben und unter leichtem Schütteln 1 h bei 37 °C inkubieren, um sich zu erholen. Die Zellsuspension wird bei 13.800 x g zentrifugiert, der Überstand verworfen und in 200 μl frischem LB-Medium resuspendiert.
7. Platte 100 μl der transformierten E. coli DH5α-Zellen auf einer LB-Platte mit 50 μg/ml Ampicillin und Inkubation bei 37 °C für 16 Stunden. Richten Sie Minipreps von 25-30 Kolonien in 5 ml LB-Medium + 50 μg/ml Ampicillin ein und lassen Sie sie über Nacht bei 37 °C wachsen.
8. Extrahieren Sie am nächsten Tag die Plasmide mit einem Plasmid-Aufreinigungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers und führen Sie einen Restriktionsenzymverdau in einem Volumen von 10 μl mit 200 ng der isolierten Plasmide, 2 U EcoR1 und 1x Restriktionspuffer für alle Kolonien durch.
9. Nach der Inkubation der Aufschlussmischungen bei 37 °C für 3 h werden die Produkte auf einem Agarose-Gel auf 0,8 % TAE-Basis aufgelöst, um die Plasmid-DNA-Insertion zu bestätigen.
10. Sanger-Sequenzierung der Plasmide von 25 positiven Klonen unter Verwendung von M13 Forward-, M13 Reverse-, 6208-SPF- und 6748-SPF-Primern (Tabelle 3), um den Anteil der Mutationen (ausgedrückt als Anteil der mutierten Nukleotide) in den viralen RNAs aus den Bibliotheken und klonalem pJFH1 zu bestimmen (Abbildung 1B und Abbildung 4).

4. Virale RNA-Transfektion der Huh7.5-Zelllinie

HINWEIS: Verwenden Sie RNase/DNase-freie Gewebekulturmaterialien und arbeiten Sie in einer sterilen Biosicherheitswerkbank der Klasse II. Arbeiten Sie in der empfohlenen Eindämmungseinrichtung gemäß den Biosicherheitsrichtlinien der Organisation.

1. Aufrechterhaltung von Huh7,5-Zellen durch Inkubation in einem 5%igen CO 2 -Inkubator bei 37 °C in einem T75 cm² Gewebekulturkolben mit 15 ml vollständigem Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), ergänzt mit 10% (vol/vol) fötalem Kälberserum, Penicillin (100 U/ml) und Streptomycin (100 μg/ml; Abbildung 1D).
2. Teilen Sie die Zellen in einem Verhältnis von 1:3 auf, wenn die Konfluenz 90 % erreicht. Waschen Sie die Zellen mit 1x vorgewärmter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; pH 7,4). Geben Sie 5 ml 1x Trypsin-EDTA-Lösung hinzu, um die Zellschicht vollständig zu bedecken, schwenken Sie den Kolben vorsichtig und inkubieren Sie den Kolben dann 5 Minuten lang bei 37 °C.
   HINWEIS: Die Inkubationszeit kann variieren; Inkubieren Sie die Zellen, bis sich die Zellschicht vollständig von der Oberfläche des Zellkulturkolbens gelöst hat.
3. Fügen Sie 10 ml 1x vorgewärmtes vollständiges DMEM hinzu, dispergieren Sie die Zellen durch wiederholtes Pipettieren und sammeln Sie die Zellsuspension in einem sterilen Zentrifugenröhrchen mit 15 ml oder 50 ml. Die Zellsuspension wird bei 252 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert. Verwerfen Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Zellpellet in 6 ml vollständigem DMEM und inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂.
4. Zur kontinuierlichen Aufrechterhaltung von naiven, transfizierten oder virusinfizierten Huh7.5-Zellen wiederholen Sie Schritt 4.2. und Schritt 4.3.
5. 1 Tag vor der Transfektion werden die Zellen wie in den Schritten 4.1.-4.3 beschrieben geteilt, die Anzahl der lebensfähigen Zellen mit einem Hämozytometer gezählt, die Huh7,5-Zellen mit einer Dichte von 0,6 x 10⁶ in 35-mm-Schalen in 2 ml vollständigem DMEM ausgesät und die Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 %_CO2 inkubiert.
6. Am nächsten Tag bereiten Sie den Transkript-Lipid-Komplex vor. Verdünnen Sie dazu 10 μl Transfektionsreagenz in 50 μl minimalessentiellem Medium und verdünnen Sie separat 5 μg virale Transkripte in 50 μl minimal essentiellem Medium.
7. Inkubieren Sie beide Mischungen bei Raumtemperatur für 10 Minuten, mischen Sie sie dann in einem einzigen sterilen Mikrozentrifugenröhrchen und inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 30 Minuten, um den Transkript-Lipid-Komplex zu bilden.
8. Nach 16 Stunden Zellinkubation nehmen Sie das Kulturmedium aus der Kulturschale, waschen die Zellen 2x mit vorgewärmtem 1x PBS und fügen 1,5 ml minimales essentielles Medium hinzu. Geben Sie den Transkript-Lipid-Komplex langsam in die Schale und schwenken Sie ihn vorsichtig mit den Händen, um eine gleichmäßige Verteilung der Komplexe zu gewährleisten.
9. Die Zellen werden in einem 5%igen_{CO2-Inkubator} bei 37 °C für 10 h inkubiert. Entfernen Sie dann das Medium, waschen Sie die transfizierten Zellen 2x mit 1 ml vorgewärmtem 1x PBS und fügen Sie 2 ml vollständiges DMEM hinzu.

5. Virusproduktion

1. Teilen Sie die transfizierten Huh7,5-Zellen alle 2 Tage oder 3 Tage, wenn sie eine 90%ige Konfluenz erreicht haben. Sammeln Sie Virusüberstände bei jeder Spaltung und lagern Sie sie bei −80 °C für weitere Analysen.
2. Überwachen Sie bei jeder Teilung die Ausbreitung des Virus mit einem fokusbildenden Assay (FFA), wie in Schritt 6.2 beschrieben. Ernten Sie das Virus, bis die Ausbreitung des Virus >80 % der transfizierten Zellen erreicht hat (Abbildung 1D).
   HINWEIS: Teilen Sie die transfizierten Zellen im Verhältnis 1:1 für die ersten Passagen, um die maximale Anzahl von Virusvarianten zu retten. Die Ausbreitung des Virus verlangsamt sich und die Lebensfähigkeit nimmt mit zunehmendem Anteil von Mutationen in den MLs des vollständigen Genoms ab².

6. Quantifizierung von Virustitern

1. Quantifizierung viraler RNA
   1. Isolieren Sie virale RNA aus 140 μl Kulturüberständen mit einem viralen RNA-Isolierungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   2. Richten Sie eine 10-μl-qRT-PCR-Reaktion mit einem handelsüblichen qRT-PCR-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers ein. Verwenden Sie den Vorwärtsprimer R6-130-S17, den Reverse-Primer R6-290-R19 (Endkonzentration jeweils 0,2 μM) und die Sonde R9-148-S21FT (Endkonzentration 0,3 μM) zur Quantifizierung der HCV-RNA (Tabelle 3). Stellen Sie die Laufbedingungen auf 48 °C für 20 Minuten, 95 °C für 10 Minuten und dann 45 Zyklen mit 95 °C für 15 s und 60 °C für 1 Minute ein.
      HINWEIS: Die Sonde sollte den Fluoreszenz-Reporterfarbstoff 6-Carboxyfluorescein (FAM) und den Quencherfarbstoff 6-Carboxy-Tetramethyl-Rhodamin (TAMRA) an den 5'- bzw. 3'-Enden enthalten.
   3. Führen Sie Reaktionen in einem Real-Time-PCR-Gerät durch. Richten Sie gleichzeitig Negativkontrollen ein, d. h. RNA, die aus den Überständen von Scheinzellen extrahiert wird, und nukleasefreies Wasser, um sicherzustellen, dass es keine Kreuzkontamination gibt.
   4. Parallel dazu wird eine Standardkurve mit einer 10-fach verdünnten seriell verdünnten bekannten Kopienzahl von HCV-Transkripten (1 x 10⁸ bis 0) für die Quantifizierung der viralen RNA erstellt. Führen Sie die Quantifizierung in dreifacher Ausführung durch (Abbildung 1D).
2. Quantifizierung des infektiösen Virustiters mit einer infektiösen Dosis von 50 % der Gewebekultur (TCID₅₀)
   1. Etwa 16 Stunden vor der Zugabe des Virus werden 6,5 x 10³ Huh7,5-Zellen/Well in eine 96-Well-Platte gegeben und die Zellen bei 37 °C in einem 5%igen CO₂ -Inkubator inkubiert.
   2. In einem Schrank der Biosicherheitsklasse II werden 10-fache serielle Verdünnungen (je 1 ml) durchgeführt, die 1 x 10⁻¹ bis 1 x 10⁻⁶ Verdünnungen (acht Verdünnungen) des geernteten Virus abdecken (erhalten, wenn die Virusausbreitung >80 % der Zellen erreicht, wie in Schritt 5 beschrieben). Geben Sie 100 μl/Well (mit acht Replikaten) des verdünnten Virus hinzu, um die Huh7.5-Zellen zu infizieren, und bewahren Sie die Platte 3 Tage lang in einem Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO₂ auf.
   3. Waschen Sie die infizierten Zellen nach 3 Tagen 3x mit jeweils 0,1 ml PBS und fixieren und permeabilisieren Sie die Zellen mit 0,1 ml eiskaltem Methanol bei −20 °C für 20 Minuten. Waschen Sie die Vertiefungen mit 1x PBS, 3x und dann 1x mit PBS-T (1x PBS/0,1% [v/v] Tween-20).
   4. Nach dem Entfernen des PBS-T werden die Zellen für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit 0,1 ml 1%igem Rinderserumalbumin (BSA) blockiert, das 0,2 % Magermilch in PBST enthält. Entfernen Sie die blockierende Lösung und behandeln Sie die Zellen 5 min lang mit 0,1 ml 3%_H2O2, zubereitet in 1x PBS.
   5. Waschen Sie die Zellen wieder 2x mit 1x PBS und 1x mit PBS-T, fügen Sie dann 50 μl/well Anti-NS5A 9E10 mAb (1:10000, Vorrat 1 mg/ml; ein freundliches Geschenk von Charles Rice, The Rockefeller University) hinzu und inkubieren Sie 1 h lang bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Vertiefungen nochmals 3x mit 1x PBS und 1x mit PBS-T.
   6. 50 μl/Well HRP-konjugiertes sekundäres Ziegen-Anti-Maus-IgG (1:4000) hinzufügen, 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und dann den ungebundenen Antikörper entfernen, indem die Wells mit 0,1 ml 1x PBS gewaschen werden.
   7. Fügen Sie 30 μl DAB-Farbsubstrat (Diaminobenzidintetrahydrochlorid) hinzu und inkubieren Sie die Platte mit leichtem Schaukeln 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Das Substrat entwickelt einen braunen Niederschlag auf der Bohrlochoberfläche, der auf das HCV-NS5A-Antigen hinweist. Entfernen Sie die DAB-Lösung und waschen Sie die Vertiefungen 2x mit 1x PBS und 1x mit destilliertem Wasser. Fügen Sie 100 μl PBS mit 0,03 % Natriumazid hinzu.
   8. Untersuchen Sie jede Vertiefung unter einem inversen Lichtmikroskop mit einem 10-fach-Objektiv. Zählen Sie die Anzahl der positiven Vertiefungen. Wenn die Vertiefung eine oder mehrere NS5A-positive Zellen enthält, ist sie positiv. Wenn in der Vertiefung keine NS5A-positiven Zellen vorhanden sind, ist sie negativ. Verwenden Sie einen Reed- und Muench-Rechner, um die Endpunktverdünnung zu schätzen, die 50 % der Bohrlöcher infiziert (TCID₅₀)^14,15. Ein Kehrwert der Verdünnung, die erforderlich ist, um den TCID₅₀ zu erhalten, ist der Virusinfektiositätstiter (focibildende Einheiten) pro Volumeneinheit.
      HINWEIS: Die Titer der Virusinfektiosität variieren je nach Mutantenbibliothek.

7. Auswahl arzneimittelresistenter viraler Varianten

1. Lösen Sie Pibrentasvir (PIB), einen NS5A-Inhibitor, in 100% DMSO auf eine Konzentration von 1 mM auf und verdünnen Sie es weiter in vollständigem DMEM auf eine Konzentration von 10 nM.
2. Um die effektive Konzentration von 50 % PIB zu bestimmen, werden Huh7,5-Zellen mit einer Dichte von 0,6 x 10 6/Well in eine 6-Well-Platte gesät und die Zellen bei 37 °C in einem 5 % CO₂ -Inkubator inkubiert. Nach 16 Stunden Zellinkubation wird eine Virusdosis von ML50 oder dem klonalen JFH1-Virus hinzugefügt, um 50 % der Zellen zu infizieren, und dann, 12 Stunden nach der Infektion (h p.i.), werden die Zellen mit einer zweifachen Verdünnungsreihe von PIB im Bereich von 0,5-100 pM behandelt. Messen Sie die FFA und quantifizieren Sie die FFU wie in Schritt 6.2 beschrieben. nach 3 Tagen Inkubation.
3. Zeichnen Sie die Dosis-Wirkungs-Kurven unter Verwendung von FFU-Reduktions-Assay-Werten in einer statistischen Analysesoftware auf. Aus der sigmoiden Kurve erhält man die effektive Konzentration von 50 % (EC₅₀; Abbildung 5).
   HINWEIS: Der effektive Konzentrationsbereich kann je nach Klasse, zwischen antiviralen HCV-Medikamenten derselben Klasse und in Abhängigkeit von der Mutantenbibliothek variieren.
4. Für das Experiment werden naive Huh7,5-Zellen bei 70%iger Konfluenz mit einer ML50-Virusdosis (Varianten, die von ML50-RNA abgeleitet sind) infiziert, um 50 % der Zellen für 12 Stunden zu infizieren, und dann die infizierten Zellen 24 Stunden nach der Infektion auf 6-Well-Platten übertragen.
5. 1x EC₅₀ PIB (47,3 pM) nach 16 h Zellteilung zu den infizierten Zellen geben. Tun Sie dies nach jeder Zellteilung für sechs aufeinanderfolgende Passagen (18 Tage), gefolgt von drei arzneimittelfreien Passagezyklen, und überwachen Sie die Virusausbreitung mithilfe von FFAs, wie in Schritt 6.2 beschrieben. Scale-up-FFA-Reagenzien je nach Wachstumsbereich. Entnehmen Sie bei jeder Passage virale Überstände und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei −80 °C.
   HINWEIS: Die Ausbreitung des Virus auf mehr als 50 % der Zellen während der Nachbeobachtung der Behandlung kann als Durchbruch definiert werden, und die Ausbreitung des Virus während der Entzugsphase des Arzneimittels kann als Virusrezidiv definiert werden¹⁶.
6. Extrahieren Sie die virale RNA aus dem Überstand am 18. Tag, wie in Schritt 6.1.1 beschrieben, und synthetisieren Sie dann cDNA, wie in Schritt 3.1 gezeigt. Das NS5A-Gen wird mit 5 μl 1:5 verdünnter cDNA und den in Schritt 3.2 beschriebenen PCR-Komponenten amplifiziert. Führen Sie dann die Schritte 3.3.-3.5 aus. zur Bestimmung von NS5A-Arzneimittelresistenzmutationen in 6-8 positiven bakteriellen Plasmiden unter Verwendung der NS5A-Sequenzierungsprimer 6186F, 6862F und 6460R (Tabelle 3 und Tabelle 4).
   ANMERKUNG: Hier in dieser Studie berichteten wir über Substitutionen in NS5A von Varianten, die während der PIB-Behandlung bei 1x EC₅₀ ausgewählt wurden. Dadurch wird der Beitrag anderer Substitutionen als NS5A zu einer verringerten Anfälligkeit für PIB ausgeschlossen.

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Ergebnisse

Eine Vielzahl von HCV-Varianten in voller Länge kann generiert und nach den in Abbildung 1 beschriebenen Verfahren auf arzneimittelresistente Phänotypen von Interesse untersucht werden. Vollständige Genommutantenbibliotheken wurden mit klonalem pJFH1 in abnehmenden Mengen (100-10 ng) synthetisiert, wie in Abbildung 2 dargestellt. Die durchschnittlichen Ausbeuten von ep-PCR-Produkten (Mutantenbibliotheken) lagen zwischen 3,8 und 12,5 ng/μL.

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Diskussion

In dieser Studie haben wir ein einfaches und schnelles FL-MRS-Verfahren beschrieben, das ep-PCR¹⁸ und reverse Genetik für die Synthese von HCV-Vollgenombibliotheken integriert, die dann in einem Zellkultursystem verwendet werden können, um replikationskompetente Varianten für das Screening von arzneimittelresistenten Phänotypen zu generieren. Die Verwendung der Low-Fidelity-Taq-DNA-Polymerase ist eine Voraussetzung für die ep-PCR, die den Einbau von Substitutionen während der PCR-Amplifikati...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb plus DNA ladder	Thermo Fisher	10787018
1.5 ml centrifuge tube	Tarsons	500010
15 ml centrifuge tube	Tarsons	546021
35 mm cell culture dish	Tarsons	960010
50 ml centrifuge tube	Tarsons	546041
Acetic acid	Merck	A6283
Agarose	HiMedia	MB080
Agrose gel electrophoresis unit	BioRad	1704406
Biosafety Cabinet, ClassII	ESCO	AC2 4S
Bovine serum albumin	HiMedia	MB083
Centrifuge	Eppendorf	5424-R
CFX Connect Real-Time PCR Detection System	BioRad	1855201
Cloning plates 90 mm	Tarson	460091
CO2 Incubator	New Brunswick	Galaxy 170R
Colibri Microvolume Spectrometer	Titertek-Berthold	11050140
DAB Substrate Kit	Abcam	ab94665
dATP Solution	NEB	N0440S
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set	NEB	N0446
Diethyl Pyrocarbonate (DEPC)	SRL chemical	46791
Dimethyl sulphoxide (DMSO)	HiMedia	MB058
DMEM high glucose	Lonza	BE12-604F
EcoR1-HF	NEB	R3101
EDTA tetrasodium salt dihydrate	HiMedia	GRM4918
Ethidium Bromide	Amresco	X328
Fetal bovine serum	Gibco	26140079
Formaldehyde	Fishser Scientific	12755
Gel Documentation System	ALPHA IMAGER
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP	Thermo Fisher	A16066
Hydrogen peroxide 30%	Merck	107209
Inverted microscope	Nickon	ECLIPSE Ts2
LB broth	HiMedia	M1245
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher	116680270	transfection reagent
Mechanical Pipette Set	Eppendorf	3120000909
Methanol	Merck	106009
Micro Tips 0.2-10 µl	Tarsons	521000
Micro Tips 10 - 100 µl	Tarsons	521010
Micro Tips 200-1000 µl	Tarsons	521020
MOPS buffer	GeNei	3601805001730
Nonessential aminoacids (NEAA)	Gibco	11140050
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli	Invitrogen	C404010	E.coli DH5α
Opti-MEM	Gibco	1105-021	minimal essential medium
PCR tubes 0.2 ml	Tarsons	510051
Pencillin/streptomycin	Gibco	15070063
pGEM-T Easy Vector System	Promega	A1360	T-vector DNA
Phosphate buffer saline (PBS)	HiMedia	TI1099
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	M0530S
Pibrentasvir	Cayman Chemical	27546
Pipette controller	Gilson	F110120
Platinum Taq DNA Polymerase	Thermo	10966034
Prism	GraphPad		statistical analysis software
QIAamp Viral RNA Mini kit	Qiagen	52904	viral isolation kit
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28104	cokum purification kit
RNeasy Mini Kit	QIAGEN	74104	RNA cleanup kit
Serological Pipettes 25 ml	Thermo Fisher	170357N
Serological Pipettes 5 ml	Thermo Fisher	170355N
Serological Pipettes10 ml	Thermo Fisher	170356N
Single strand RNA Marker 0.2-10 kb	Merck	R7020
Skim milk	HiMedia	M530
Sodium azide 0.1 M solution	Merck	8591
SuperScript III Reverse Transcriptase	Invitrogen	18080044	reverse transcriptase
T100 Thermal Cycler	BioRad	1861096
T175 cell culture flask	Tarsons	159910
T25 cell culture flask	Tarsons	950040
T7 RiboMax Express Large Scale RNA Production System	Promega	P1320	Large Scale RNA Production System
T75 cell culture flask	Tarsons	950050
Taq DNA Polymerase	Genetix Biotech (Puregene)	PGM040
TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit	Applied Biosystems	4392653
TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit	Thermo Fisher	4392653	commercial qRT-PCR kit
TOPO-XL--2 Complete PCR Cloning Kit	Thermo Fisher	K8050-10	kit for cloning of long-PCR product
Tris base	HiMedia	TC072
Trypsin-EDTA solution	HiMedia	TCL007
Tween 20	HiMedia	MB067
Vacuum Concentrator	Eppendorf, Concentrator Plus	100248
Water bath	GRANT	JBN-18
Xba1	NEB	R0145S