Ein kompetentes Hepatozytenmodell, das den Eintritt von Hepatitis-B-Viren durch Natriumtaurocholat cotransportierendes Polypeptid als therapeutisches Ziel untersucht

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein Protokoll zum Screening von Anti-Hepatitis-B-Virus-Verbindungen (HBV), die auf prä- und postvirale Eintrittsphasen abzielen, wobei die isotherme Titrationskalorimetrie verwendet wird, um die Bindungsaffinität (K_D) mit dem Wirtsnatriumtaurocholat-Cotransport-Polypeptid zu messen. Die antivirale Wirksamkeit wurde durch die Unterdrückung viraler Lebenszyklusmarker (cccDNA-Bildung, Transkription und virale Assemblierung) bestimmt.

Zusammenfassung

Die Infektion mit dem Hepatitis-B-Virus (HBV) gilt als entscheidender Risikofaktor für das hepatozelluläre Karzinom. Die derzeitige Behandlung kann nur die Viruslast verringern, aber nicht zu einer vollständigen Remission führen. Ein effizientes Hepatozytenmodell für HBV-Infektionen würde einen lebensechten viralen Lebenszyklus bieten, der für das Screening von Therapeutika entscheidend wäre. Die meisten verfügbaren Anti-HBV-Wirkstoffe zielen auf Lebenszyklusphasen nach dem viralen Eintritt ab, aber nicht vor dem Viruseintritt. Dieses Protokoll beschreibt die Generierung eines kompetenten Hepatozytenmodells, das in der Lage ist, nach Therapeutika zu suchen, die auf prävirale und postvirale Eintrittsphasen abzielen. Dies umfasst das Targeting der Natriumtaurocholat-Cotransport-Polypeptid-Bindung (NTCP), die cccDNA-Bildung, die Transkription und die virale Assemblierung basierend auf imHC oder HepaRG als Wirtszellen. Hier verwendete der HBV-Eintrittshemmungsassay Curcumin, um HBV-Bindungs- und Transportfunktionen über NTCP zu hemmen. Die Inhibitoren wurden auf Bindungsaffinität (K_D) mit NTCP unter Verwendung der isothermen Titrationskalorimetrie (ITC) - einem universellen Werkzeug für das HBV-Arzneimittelscreening basierend auf thermodynamischen Parametern - untersucht.

Einleitung

Die Infektion mit dem Hepatitis-B-Virus (HBV) gilt weltweit als lebensbedrohliche Krankheit. Eine chronische HBV-Infektion birgt ein Risiko für Leberzirrhose und hepatozelluläres Karzinom¹. Die derzeitige Anti-HBV-Behandlung konzentriert sich hauptsächlich auf den postviralen Eintritt unter Verwendung von Nukleos(t)ide-Analoga (NAs) und Interferon-alpha (IFN-α)^2,3. Die Entdeckung eines HBV-Eintrittsinhibitors, Myrcludex B, hat ein neues Ziel für Anti-HBV-Wirkstoffe identifiziert⁴. Die Kombination von Eintrittsinhibitoren und NAs bei chronischem HBV hat die Viruslast im Vergleich zu denen, die nur auf die Virusreplikation abzielen, signifikant verringert ^5,6. Das klassische Hepatozytenmodell für das Screening von HBV-Eintrittsinhibitoren ist jedoch durch niedrige virale Rezeptorspiegel (Natriumtaurocholat-Cotransporting-Polypeptid, NTCP) begrenzt. Die Überexpression von hNTCP in Hepatomzellen (d.h. HepG2 und Huh7) verbessert die HBV-Infektiosität ^7,8. Dennoch exprimieren diese Zelllinien geringe Mengen an medikamentenmetabolisierenden Enzymen der Phasen I und II und weisen eine genetische Instabilität auf⁹. Hepatozytenmodelle, die helfen können, verschiedene Mechanismen von Anti-HBV-Kandidatenverbindungen wie präviralen Eintrag, NTCP-Bindung und viralen Eintritt anzusprechen, würden die Identifizierung und Entwicklung wirksamer Kombinationsschemata beschleunigen. Die Studie zur Anti-HBV-Aktivität von Curcumin hat die Hemmung des Viruseintritts als neuen Mechanismus zusätzlich zur postviralen Eintrittsunterbrechung aufgeklärt. Dieses Protokoll beschreibt ein Wirtsmodell für das Screening von Anti-HBV-Eintrittsmolekülen¹⁰.

Das Ziel dieser Methode ist es, mögliche Anti-HBV-Verbindungen für die Hemmung des Viruseintritts zu erforschen, insbesondere die Blockierung der NTCP-Bindung und des NTCP-Transports. Da die NTCP-Expression ein kritischer Faktor für den HBV-Eintritt und die Infektion ist, haben wir das Hepatozyten-Reifungsprotokoll optimiert, um die NTCP-Werte^{zu maximieren 11}. Darüber hinaus kann dieses Protokoll die hemmende Wirkung auf den HBV-Eintritt als Hemmung der HBV-Bindung gegenüber Hemmung der Internalisierung unterscheiden. Der Aufnahmetest für Taurocholsäure (TCA) wurde ebenfalls unter Verwendung einer ELISA-basierten Methode anstelle eines Radioisotops modifiziert, um den NTCP-Transport^12,13 darzustellen. Die Rezeptor- und Ligandeninteraktion wurde durch ihre 3D-Strukturen^{bestätigt 14,15}. Die Hemmung der NTCP-Funktion kann durch Messung der TCA-Aufnahmeaktivität¹⁶ bewertet werden. Diese Technik lieferte jedoch keinen direkten Nachweis einer NTCP-Bindung an die Kandidaten-Inhibitoren. Daher kann die Bindung mit verschiedenen Techniken untersucht werden, wie z.B. Oberflächenplasmonresonanz 17, ELISA, fluoreszenzbasierter Thermoverschiebungsassay (FTSA)¹⁸, FRET¹⁹, AlphaScreen und verschiedenen anderen Methoden²⁰. Unter diesen Techniken ist ITC ein Zielstandard in der Bindungsanalyse, da es Wärmeabsorption oder -emission in fast jeder Reaktion beobachten kann²¹. Die Bindungsaffinität (K_D) von NTCP und Kandidatenverbindungen wurde direkt mittels ITC bewertet; Diese Affinitätswerte waren genauer als diejenigen, die mit dem In-silico-Vorhersagemodell ²² ermittelt wurden.

Dieses Protokoll behandelt Techniken zur Hepatozytenreifung, HBV-Infektion und zum Screening auf HBV-Eintrittshemmer. Kurz gesagt, ein Hepatozytenmodell wurde basierend auf imHC- und HepaRG-Zelllinien entwickelt. Die kultivierten Zellen wurden innerhalb von 2 Wochen zu reifen Hepatozyten differenziert. Die Hochregulierung der NTCP-Spiegel wurde mittels real-time PCR, Western Blot und Durchflusszytometrie^{nachgewiesen 11}. Hepatitis-B-Virion (HBVcc) wurde produziert und aus HepG2.2.15 gesammelt. Das differenzierte imHC bzw. HepaRG (d-imHC, d-HepaRG) wurde 2 h vor der Inokulation mit HBV-Virion prophylaktisch mit den Anti-HBV-Kandidaten behandelt. Das erwartete Ergebnis des Experiments war die Identifizierung der Wirkstoffe, die zelluläres HBV und Infektiosität verringern. Die Anti-NTCP-Aktivität wurde mit dem TCA-Aufnahmetest bewertet. Die NTCP-Aktivität konnte von den Agenten unterdrückt werden, die NTCP spezifisch gebunden haben. Die ITC-Technik wurde verwendet, um die Machbarkeit einer interaktiven Bindung zu untersuchen, die Inhibitoren und ihre Zielproteine vorhersagen kann, indem die Bindungsaffinität (K_D) des Liganden für den Rezeptor über nicht-kovalente Wechselwirkungen des biomolekularen Komplexes^{bestimmt wird 23,24}. Zum Beispiel steht K D ≥ 1 × 10³ mM für schwache Bindung, K D ≥ 1 × 10⁶ μM für moderate Bindung und K _D ≤ 1 × 10⁹ nM für starke Bindung. Das ΔG korreliert direkt mit Bindungswechselwirkungen. Insbesondere ist eine Reaktion mit negativem ΔG eine exergonische Reaktion, was darauf hinweist, dass die Bindung ein spontaner Prozess ist. Eine Reaktion mit einem negativen ΔH deutet darauf hin, dass die Bindungsprozesse von Wasserstoffbrückenbindungen und Van-der-Waals-Kräften abhängen. Sowohl TCA-Aufnahme als auch ITC-Daten könnten verwendet werden, um nach Anti-HBV-Eintragsagenten zu suchen. Die Ergebnisse dieser Protokolle können eine Grundlage nicht nur für das Anti-HBV-Screening bilden, sondern auch für die Interaktion mit NTCP, die durch Bindungsaffinität und Transportfunktion bewertet wird. Dieser Artikel beschreibt die Vorbereitung und Charakterisierung von Wirtszellen, das experimentelle Design und die Bewertung des Anti-HBV-Eintritts zusammen mit der NTCP-Bindungsaffinität.

Protokoll

HINWEIS: Die folgenden Verfahren müssen in einer Haube für biologische Gefahrenströme der Klasse II oder einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden. Der Umgang mit HBV wurde vom IRB ethisch genehmigt (MURA2020/1545). Weitere Informationen zu allen Lösungen, Reagenzien, Geräten und Zelllinien, die in diesem Protokoll verwendet werden, finden Sie in der Materialtabelle .

1. Vorbereitung von Wirtszellen (reife Hepatozyten)

1. Hepatozyten (3,75 × 10⁵ Zellen HepaRG oder imHC) kultivieren und in einem 75 cm² Kulturkolben mit 10 ml DMEM/F12-Medium aufbewahren, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), 1% L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin. Warten Sie, bis die Zellen 80% -90% Konfluenz erreicht haben (innerhalb von 1 Woche).
2. Entsorgen Sie das alte Medium aus dem Kolben und waschen Sie die Zellen mit 4 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
3. Das PBS absaugen und 4 ml 0,05% Trypsin-EDTA hinzufügen.
4. Inkubieren Sie den Kolben im 37 °C Inkubator für 2-3 min und überprüfen Sie die anhaftenden Zellen mit einem inversen Mikroskop mit einer 10-fachen Objektivlinse. Stellen Sie sicher, dass sich die Monoschicht von der Kulturoberfläche gelöst hat.
5. Hemmen Sie das Trypsin, indem Sie 4 ml des Kulturmediums, ergänzt mit 10% FBS, in den Kolben geben und die entnommenen Zellen vorsichtig resuspendieren. Die Zellsuspension in ein 15-ml-konisches Röhrchen geben und 3 min bei 300 × g, 25 °C zentrifugieren.
6. Saugen Sie den Überstand aus dem Zellpellet ab und resuspendieren Sie mit 1-2 ml des vorgewärmten Kulturmediums, ergänzt mit 10% FBS und Antibiotika.
7. Mischen Sie jeweils 10 μL der Zellsuspension und Trypanblau und zählen Sie die Zellen mit einem Hämazytometer. Stellen Sie sicher, dass die Zelllebensfähigkeit höher als 90% ist, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
8. Samen Sie 1 × 10 6 Zellen pro 2 ml in jeder Vertiefung einer 6-Well-Platte und halten Sie das vollständige DME/F12-Medium aufrecht, bis die Zellen 100% Konfluenz erreichen.
9. Für die hepatische Reifung bereiten Sie das hepatische Reifungsmedium vor (Williams-E-Medium, ergänzt mit 10% FBS, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 5 μg/ml Insulin, 50 μM Hydrocortison, 2 mM L-Glutamin und 2% DMSO).
10. Ersetzen Sie das Kulturmedium 2x pro Woche.
11. Halten Sie die Hepatozyten 2 Wochen lang im Reifungsmedium, um reife Hepatozyten zu erhalten, die für eine HBV-Infektion bereit sind.

2. Quantifizierung des zellulären NTCP

1. Messung der NTCP-Expression mittels real-time PCR
   1. Sammeln Sie das Pellet reifer Hepatozyten durch Trypsinisierung (siehe Schritte 1.2-1.5).
   2. Extrahieren Sie die gesamte RNA aus dem Zellpellet mit einem RNA-Extraktionskit mit DNase-I-Behandlung.
   3. Synthetisieren Sie cDNA aus 200 ng Gesamt-RNA unter Verwendung eines Oligo-dT-Primers und eines Reverse-Transkriptionssystems gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   4. Verdünnen Sie die cDNA auf 50 ng/μL und verwenden Sie sie als Vorlage für die PCR-Reaktion. Mischen Sie 2 μL der verdünnten cDNA mit den PCR-Master-Mix-Reagenzien, die SYBR grüne qRT-PCR-Kit-Lösung enthalten, mit 5 μM NTCP-spezifischen Primern (5'-GGACATGAACCTCAGCATTGTG-3' und 5'-ATCATAGATCCCCCTGGAGTAGAT-3').
   5. Zur Normalisierung verwenden Sie GAPDH als Housekeeping-Gen mit spezifischen Primern (5'-GAAATCCCATCACCATCTTCC-3' und 5'-AAATGAGCCCCAGCCTTCTC-3').
   6. Amplifizieren Sie die cDNA-Proben mit einem Thermocycler unter folgenden Temperaturbedingungen: 1 Zyklus von 3 min bei 95 °C (anfängliche Denaturierung); 40 Zyklen von 30 s bei 95 °C (Denaturierung), 30 s bei 60 °C bis 65 °C (Glühen), 30 s bei 72 °C (Verlängerung); 1 Zyklus von 5 min bei 72 °C (Endverlängerung).
   7. Berechnen Sie die NTCP-Faltenänderung in reifen Hepatozyten über undifferenzierten Zellen unter Verwendung von GAPDH als Kalibrorgen basierend auf der ^{2-ΔΔCT-Methode} .
2. Quantifizierung von NTCP mithilfe der Western-Blot-Analyse
   1. Hepatozyten mit einem Zellschaber ernten und bei 300 x g, 25 °C für 5 min zentrifugieren, um das Zellpellet zu sammeln.
   2. Befolgen Sie die Anweisungen des RIPA-Pufferherstellers, um das zelluläre Protein mit 100 μL RIPA-Puffer zu extrahieren, der 1x Proteaseinhibitor enthält.
   3. Messen Sie die Gesamtproteinkonzentration mit der Bicinchoninsäure (BCA) -Methode.
   4. Mischen Sie 12,5 μL Protein mit 2x Ladenfarbstoff im Verhältnis 1:1.
   5. Die Proteinmischung und die Standardleiter bei 95 °C 5 min kochen.
   6. Fügen Sie 1x Laufpuffer in die Elektrophoresekammer ein.
   7. Laden Sie 5 μL der Proteinstandardleiter oder 20 μL der gekochten Proteinmischung in ein 10% (w/v) Polyacrylamidgel.
   8. Durchführung der Gelelektrophorese: 50 V für 30 min, gefolgt von 90 V für 1 h bei Raumtemperatur.
   9. Bereiten Sie eine PVDF-Membran vor, indem Sie sie 30 s lang in Methanol einweichen, mit doppelt destilliertem Wasser für 1-2 min waschen und zusammen mit zwei Stücken Filterpapier im Transferpuffer für 10 min oder bis zum Gebrauch einweichen.
   10. Legen Sie das Filterpapier auf die Anodenplatte einer halbtrockenen Transferzelle; Legen Sie dann die PVDF-Membran, das Gel und das Filterpapier in dieser Reihenfolge darauf.
   11. Übertragen Sie die Proteine aus dem Gel auf die PVDF-Membran bei 10 V für 25 min bei Raumtemperatur.
   12. Blockieren Sie die Membran mit WB-Blocklösung für 1 h bei Raumtemperatur.
   13. Die Membran mit Anti-Natrium-Taurocholat-Cotransport-Polypeptid (Anti-NTCP) (1:100 Verdünnung) bei 4 °C über Nacht inkubieren.
   14. Waschen Sie die Membran 3 x 10 min mit TBST.
   15. Die Membran mit Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugiertem Ziegen-Antikaninchen-Antikörper (1:10.000 Verdünnung) für 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
   16. Waschen Sie die Membran 3 x 10 min mit TBST und dann 1 x 5 min mit TBS.
   17. Erkennen Sie NTCP mithilfe eines HRP-Substrats (siehe Materialtabelle).
   18. Fügen Sie mindestens 0,1 ml HRP-Substratlösung/cm² der Membran hinzu und inkubieren Sie die Membran für 3-5 min im Dunkeln.
   19. Visualisieren Sie NTCP mit einem Gel-Dokumentationssystem im Chemilumineszenzmodus, wählen Sie die Markeroption für die Membran, passen Sie die Belichtungszeit im Akkumulationsmodus alle 1 Minute an und nehmen Sie das Foto mit verschiedenen Belichtungszeiten für 5 Minuten auf.
   20. Streifen und sondieren Sie den Blot mit Maus-Anti-GAPDH-Antikörper (1:200.000 Verdünnung) und HRP-konjugiertem Ziegen-Anti-Maus-Sekundärantikörper (1:10.000 Verdünnung).
3. Messung des NTCP-Spiegels mittels Durchflusszytometrie
   1. Sammeln Sie die Zellpellets reifer Hepatozyten, indem Sie die Zellen mit 8 mM EDTA für 15 min inkubieren.
      HINWEIS: Vermeiden Sie die Verwendung von Trypsin oder anderen Proteasen, die Zelloberflächenrezeptoren stören können. Da NTCP ein Zelloberflächenrezeptorprotein ist, können Schäden durch Trypsinisierung zu negativen Ergebnissen führen.
   2. Fixieren Sie die Hepatozyten mit 300 μL 3,7% Paraformaldehyd in 1x PBS für 15 min. Die Zellsuspension wird in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt und 10 min bei 300 × g, 25 °C zentrifugiert.
   3. Die Zellen 2x mit 700 μL oder 1x PBS mit 1% FBS (v/v) waschen, 10 min bei 300 × g, 25 °C zentrifugieren, 300 μL 0,05% Triton X-100 in PBS zum Zellpellet geben und die Zellen bei Raumtemperatur für 20 min inkubieren, um sie zu permeabilisieren.
   4. 10 min bei 300 × g, 25 °C zentrifugieren, Zellpellet 3 x 1 min mit 700 μL PBS mit 1% FBS (v/v) waschen. Inkubieren Sie die Zellen mit dem primären Antikörper gegen NTCP (1:100 Verdünnung) bei 4 °C für 30 min. Die Zellen 3 x 1 min mit Perm/Wash-Puffer waschen und 10 min bei 300 × g, 25 °C zentrifugieren.
   5. Färben Sie die Zellen mit sekundären Antikörpern, die an Alexa Fluor 488 konjugiert sind, bei 4 °C für 30 min. Die Zellen 3 x 1 min mit Perm/Wash-Puffer waschen und 10 min bei 300 × g, 25 °C zentrifugieren. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit 200 μL PBS mit 1% FBS (v/v).
   6. Schalten Sie das Durchflusszytometer ein, erwärmen Sie den Laser für 15 Minuten und führen Sie eine routinemäßige Reinigung durch.
   7. Wählen Sie die Messparameter aus, einschließlich Vorwärtsstreuung (FSC), Seitenstreuung (SSC) und Fluoresceinisothiocyanat (FITC) oder Phycoerythrin (PE), und stellen Sie die automatische Kompensationsanpassung über die Software ein. Fügen Sie die Kompensationskontrollproben hinzu: ungefärbte Kontrolle, FITC-gefärbte Kontrolle und PE-gefärbte Kontrolle.
      HINWEIS: FSC- und SSC-Parameter werden verwendet, um die Größe und Granularität einzelner Zellen zu bestimmen, um die Zellpopulation für die Gating-Analyse auszuwählen. Der Fluoreszenzkanaldetektor verfügt über FITC- und PE-Kanäle. Wählen Sie für dieses Protokoll den FITC-Kanal aus, um Alexa Fluor 488 zu erkennen.
   8. Führen Sie die ungefärbte Probe mit mittlerer fluidischer Flussrate (60 μL/min) durch, passen Sie den Schwellenwert von FSC und SSC an, bis sie die interessierende Zellpopulation abdecken, markieren Sie den Gate-Bereich in diesem Bereich und wenden Sie ihn auf alle Kompensationskontrollen an.
   9. Stellen Sie die Fluoreszenz-Photomultiplierröhre (PMT) mit der ungefärbten Steuerung ein und passen Sie die PMT-Spannung von FITC oder PE im negativen Quadranten an. Führen Sie die positiv gefärbte Probe aus und passen Sie FITC oder PE in der positiven Quadrantenskala an. Führen Sie die Steuerelemente ohne Färbung, FITC-gefärbt oder PE-gefärbt aus, berechnen Sie die Kompensation, und wenden Sie sie auf die Probeneinstellungen an. Führen Sie das Hepatozytenbeispiel aus, um den NTCP-Pegel zu messen.
   10. Analysieren Sie die gefärbten Hepatozyten mit der Durchflusszytometer-Software (siehe Materialtabelle).
       1. Klicken Sie unter BD FACSuite-Fenster auf das Steuerrohr auf der Registerkarte Datenquellen und warten Sie, bis die Rohdaten angezeigt werden.
       2. Klicken Sie auf der Registerkarte Arbeitsblatt auf der rechten Seite auf die Schaltfläche Ellipsentor , wählen Sie mit dem Mauszeiger die Zellpopulation in SSC und das FSC-Punktdiagramm aus und warten Sie, bis der Kreis P1 angezeigt wird.
       3. Klicken Sie auf die Schaltfläche Intervallgatter und markieren Sie den Bereich im FITC-Histogramm, beginnend mit dem höchsten Fluoreszenzintensitätswert auf der rechten Seite. Beachten Sie die angezeigte Zeile P2.
       4. Klicken Sie auf das Experimentröhrchen und beobachten Sie, dass sich die Daten auf der Registerkarte Arbeitsblatt ändern. Klicken Sie auf die Schaltfläche Statistik und dann auf die leere Stelle im Arbeitsblatt. Beobachten Sie die angezeigten statistischen Werte der NTCP-Grundgesamtheit.

3. Herstellung der aus Zellkultur gewonnenen HBV-Partikel (HBVcc)

1. Kultur HepG2.2.15 in vollständigem Medium (DMEM ergänzt mit 10% FBS, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin) in einer 10 cm Petrischale für 24 h.
2. Ersetzen Sie das komplette Medium, das mit 380 μg / ml Geneticin (G418) ergänzt wurde, wenn die HepG2.2.15 60% -70% Konfluenz erreichen. Ernte das konditionierte Medium alle 2 Tage; lagern Sie das HBV-haltige Medium bei 4 °C.
3. Zellreste werden durch Zentrifugieren des Überstands bei 5.000 × g, 4 °C für 20 min entfernt. Sammeln Sie das konditionierte Medium mit einer 20-ml-Spritze und filtern Sie es durch einen 0,45 μm proteinarmen Filter, um Zelltrümmer zu entfernen.
4. Um HBV zu konzentrieren, verdünnen Sie 1 Volumen Konzentrator mit 3 Volumen des gefilterten Überstands aus Schritt 3.3 in einem konischen Zentrifugenröhrchen und mischen Sie die Lösung vorsichtig durch Rohrinversion. Die Mischung 1 h bei 4 °C eintragen. Zentrifugieren Sie die Lösung für 1 h bei 1.500 × g, 4 °C und stellen Sie sicher, dass ein cremefarbenes Pellet sichtbar ist.
   HINWEIS: Fügen Sie für jeweils 30 ml gefilterten Überstand aus Schritt 3.3 10 ml des Konzentrators hinzu, um 40 ml Gesamtvolumen zu erreichen.
5. Bewerten Sie den HBV-Titer (Genomäquivalent) mit HBV 1,3-mer-WT-Replikon als Standardkurve im Bereich von 1 × 10² bis 1 × 10¹⁰ unter Verwendung der absoluten real-time PCR, wie zuvor^{beschrieben 11}.
6. Das Pellet vorsichtig in FBS rekonstituieren und bis zu 1 Jahr bei −80 °C in Einwegaliquoten lagern.

4. Anti-HBV-Eintrittstest

1. Halten Sie 100% konfluentes imHC oder HepaRG in 6-Well-Platten im Reifungsmedium (2% DMSO in Williams' E-Medium, 10% FBS, 100 U / ml Penicillin, 100 μg / ml Streptomycin, 5 μg / ml Insulin, 50 μM Hydrocortison und 2 mM L-Glutamin) für 2 Wochen und wechseln Sie das Medium 2x pro Woche.
2. Das Medium absaugen, dann das Curcumin (10-30 μM) oder 4 μM Cyclosporin A (CsA) verdünnt mit William's E-Medium für 2 h hinzufügen. Saugen Sie den Kandidaten HBV-Eintrittshemmer ab und ersetzen Sie ihn durch 1 ml William's E-Medium, das 4% Polyethylenglykol enthält.
3. HBV-Partikel in das Kulturmedium bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 100 pro Vertiefung geben und bei 37 °C für 18 h inkubieren. Verwerfen Sie den Überstand, fügen Sie 2 ml kaltes PBS hinzu und schwenken Sie vorsichtig, um das alte Medium mit ungebundenem HBV abzuspülen.
4. Fügen Sie 2 ml komplettes William's E-Medium hinzu und kultivieren Sie es für 7 Tage. Das Medium absaugen, die Zellen mit 1x PBS waschen und die Zellen mit 3,7% Paraformaldehyd in PBS für 15 min bei Raumtemperatur fixieren. Permeabilisieren und blockieren Sie die infizierten Zellen mit IF-Blockierungslösung (0,2% Triton X-100 und 3% Rinderserumalbumin in PBS) und inkubieren Sie sie für 60 min bei Raumtemperatur.
5. Den primären Antikörper (Anti-HBV-Kernantigen) in einer Verdünnung von 1:200 in die Blockierlösung geben und über Nacht bei 4 °C inkubieren. Waschen Sie die Zellen 3 x 1 min mit einer Waschlösung (0,5% Tween 20 in PBS).
6. Sekundäre Antikörper (1:500 Verdünnung) in die IF-Blockierlösung geben, 1 h bei Raumtemperatur inkubieren und die Zellen 3 x 1 min mit Waschlösung waschen.
7. Montieren Sie die Probe mit einem Antifade-Montagemedium mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) und decken Sie sie mit einem Glasdeckglas ab. Erfassen Sie das Fluoreszenzsignal mit einem Fluoreszenzmikroskop, das mit einem DAPI-Filter (Ex 352-402 nM und Em 417-477) und einem PE-Filter (Ex 542-582 und Em 604-644) sowie einer 20-fachen Objektivlinse ausgestattet ist, und bestimmen Sie die Anti-HBV-Eintrittsaktivität der Kandidatenverbindungen.

5. HBV-Zellbindungsassay

1. Halten Sie 100% konfluentes imHC oder HepaRG in 6-Well-Platten im Reifungsmedium (2% DMSO in Williams' E-Medium, 10% FBS, 100 U / ml Penicillin, 100 μg / ml Streptomycin, 5 μg / ml Insulin, 50 μM Hydrocortison und 2 mM L-Glutamin) für 2 Wochen und wechseln Sie das Medium 2x pro Woche.
2. Das Medium absaugen, dann Curcumin (10-30 μM) oder Cyclosporin A (4 μM) in Williams E-Medium für 2 h verdünnt hinzufügen. Saugen Sie den HBV-Eintrittshemmer ab und ersetzen Sie ihn durch 1 ml William's E-Medium, das 4% Polyethylenglykol enthält.
3. HBV-Partikel in das Kulturmedium bei einem MOI von 100 pro Vertiefung geben und bei 4 °C für 2 h inkubieren, um eine HBV-Bindung an die Hepatozyten zu ermöglichen. Verwerfen Sie das Medium, das ungebundenes HBV enthält, fügen Sie 2 ml kaltes PBS hinzu und schwenken Sie vorsichtig, um Spuren des verbrauchten Mediums zu entfernen.
4. Ernten Sie die infizierten Zellen mit einem Zellschaber und stören Sie die Zellen mit Lysepuffer. Das Lysat wird in ein Sammelröhrchen überführt und die Gesamt-DNA extrahiert, um die HBV-DNA mittels real-time PCR mit spezifischen Primern für HBV (Forward Primer: 5'- GTT GCC CGT TTG TCC TCT AATTC-3' und Reverse Primer: 5'- GGA GGG ATA CAT AGA GGT TCC TTG A-3') unter Verwendung von PRNP (Forward Primer: 5'- GACCAATTTATGCCTACAGC-3', Reverse Primer: 5'- TTTATGCCTACAGCCTCCTA-3') als interne Kontrolle zu bewerten.
5. Amplifizieren Sie die PCR-Produkte in einem Thermocycler unter Verwendung der in Schritt 2.1 beschriebenen Temperaturbedingungen.
6. Berechnung der relativen HBV-DNA-Spiegel/1 × 10⁶ Zellen in Behandlung versus Kontrolle unter Verwendung von PRNP als Kalibrorgen basierend auf der 2-ΔΔCT-Methode.

6. Aufnahmetest für Taurocholsäure (TCA)

1. Halten Sie 100% konfluente imHC- und HepaRG-Zellen 14 Tage lang im Reifungsmedium.
2. Das Medium absaugen und die Hepatozyten mit 1x PBS waschen. Curcumin oder Ciclosporin A (10-50 μM) in William's E-Medium für 2 h verdünnt hinzufügen. Das Medium durch die Natriumtaurocholsäurelösung (0,5 M Natriumtaurocholsäurehydrat in 1x HEPES) ersetzen und 15 min bei Raumtemperatur inkubieren.
3. Die Natriumtaurocholsäurelösung absaugen und 3x mit kaltem 1x HEPES waschen. Fügen Sie 300-500 μL kaltes 1x HEPES hinzu und ernten Sie die Zellen mit Zellschaber auf Eis.
4. Die Zellen werden durch Ultraschall bei einer Frequenz von 20 kHz für 20 s homogenisiert und 5 min auf Eis inkubiert. Zentrifugieren Sie die Lysate bei 10.000 × g für 20 Minuten, um Zelltrümmer auszufällen. Sammeln Sie den Überstand und bewerten Sie die intrazelluläre Taurocholsäurekonzentration mit einem TCA-ELISA-Assay-Kit (siehe Materialtabelle).

7. Bestimmung von Protein-Liganden-Wechselwirkungen mittels isothermer Titrationskalorimetrie

HINWEIS: Dieses Assay-System wurde auf Basis der MicroCal PEAQ-ITC (ITC-Software) entwickelt.

1. Bereiten Sie den Puffer vor (50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,0).
2. Bereiten Sie 15 μM NTCP im Puffer vor.
3. Bereiten Sie 150 μM-Kandidaten HBV-Eintrittsinhibitorlösungen im Puffer vor.
4. Waschen Sie die Probenzelle, die Referenzzelle und die Spritze im ITC-Gerät mit dem Puffer (Schritt 7.1.).
   1. Starten Sie die ITC-Software durch Doppelklick auf das Software-Symbol in Windows-Systemen. Wählen Sie auf der Registerkarte Highlight Run experiment die Option microCal Method for 19 Injection.itcm aus und klicken Sie auf Öffnen. Wenn ein neues Fenster geöffnet wird, klicken Sie auf die Registerkarte Reinigen, und wählen Sie im Fenster Reinigungsmethode die Schaltfläche Waschen für Zellenreinigungsmethode und die Schaltfläche Spülen für Spritzenreinigungsmethode aus. Klicken Sie auf Weiter und folgen Sie den Anweisungen auf dem Bildschirm.
      HINWEIS: Der Waschvorgang kann 1,4 Stunden dauern.
5. Laden Sie die Probe in die ITC; Klicken Sie auf der Registerkarte Experiment ausführen auf die Schaltfläche Laden und lesen Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm. Klicken Sie auf Weiter und folgen Sie den Videoanweisungen, bis dieser Ladeschritt abgeschlossen ist.
   1. Füllen Sie die Referenzzelle mit einer Spritze mit Lösungspuffer. Füllen Sie die Probenzelle mit 15 μM NTCP im Puffer mit einer Spritze und entfernen Sie die überschüssige NTCP-Lösung über der Probenzelle. Füllen Sie die Spritze mit 150 μM Lösung des Curcumins (Liganden) und vermeiden Sie Luftblasen in der Spritze.
6. Führen Sie das Beispiel aus, und klicken Sie auf der Registerkarte Experiment ausführen auf die Schaltfläche Ausführen . Beobachten Sie die Fenster auf der linken Seite, die experimentelle Informationen und experimentelle Einstellungen anzeigen. Geben Sie die Liganden- und Proteinkonzentrationen als 150 μM in [ Syr], 15 μM in [Zelle] und 25 °C in der Temperatur ein.
7. Klicken Sie in der Software auf Start , um den Injektionsprozess durchzuführen, und warten Sie 1,4 h, bis die Protein-Liganden-Interaktion abgeschlossen ist.
   HINWEIS: Die verblasste Schaltfläche Analysieren wird unter den Softwarefenstern angezeigt.
8. Beachten Sie, dass die Analysetaste nach Abschluss der Injektion heller wird. Klicken Sie auf die Analyseschaltfläche in der Steuerungssoftware, um die Rohdaten mit der Analysesoftware zu analysieren. Klicken Sie auf Übersicht , um die Rohdaten anzuzeigen und wählen Sie das Anpassungsmodell als One Set of Binding Site aus.
9. Stellen Sie sicher, dass im Bindungsstatus die experimentellen Daten (Bindungs-, keine Bindungs-, Steuer- oder Prüfdaten) und die Experimentwerte (K_D, ΔG, ΔH, TΔS und N) im Softwarefenster angezeigt werden.
10. Exportieren Sie die thermodynamischen Parameter, die die Wechselwirkungsbindung vorhersagen, einschließlich Wasserstoffbrückenbindung, Van-der-Waals-Bindung und hydrophober Wechselwirkung, in das TIF- oder JPEG-Format.
11. Nach Abschluss des Experiments waschen Sie die Probenzelle nach Schritt 7.4.

8. Statistische Auswertung

1. Führen Sie alle Experimente in drei unabhängigen Replikaten durch (n = 3).
2. Präsentieren Sie experimentelle Daten als Mittel ± SD und führen Sie statistische Analysen mit der gewünschten statistischen Analysesoftware durch.
3. Verwenden Sie einen zweiseitigen, ungepaarten Studenten-t-Test, um zwischen zwei Mittelwerten zu vergleichen, oder wenden Sie die Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) mit Dunnett an, um mehrere Werte mit einem Kontrollwert zu vergleichen. Legen Sie das Signifikanzniveau auf p ≤ 0,05 fest.

Ergebnisse

Es wurden hepatische Reifungsmerkmale beobachtet, einschließlich zweikerniger Zellen und polygonaler Morphologie (Abbildung 1), insbesondere im differenzierten Stadium von imHC (Abbildung 1A). Ein starker Anstieg der NTCP-Expression wurde in d-HepaRG und d-imHC um das 7-fache bzw. 40-fache gemessen (Abbildung 1B). Die stark glykosylierte Form von NTCP, die postuliert wurde, um die Anfälligkeit für den HBV-Eintritt zu verleihen, w...

Diskussion

Die HBV-Infektion wird über eine niedrigaffine Bindung an Heparansulfat-Proteoglykane (HSPGs) an Hepatozyten²⁵ initiiert, gefolgt von der Bindung an NTCP mit anschließender Internalisierung durch Endozytose²⁶. Da NTCP ein entscheidender Rezeptor für den HBV-Eintritt ist, kann der gezielte HBV-Eintritt klinisch übersetzt werden, um die De-novo-Infektion, die Mutter-Kind-Übertragung (MTCT) und das Rezidiv nach Lebertransplantation zu verringern. Die Unterbrechun...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell lines
HepaRG Cells, Cryopreserved	Thermo Fisher Scientific	HPRGC10
Hep-G2/2.2.15 Human Hepatoblastoma Cell Line	Merck	SCC249
Reagents
4% Paraformadehyde Phosphate Buffer Solution	FUJIFLIM Wako chemical	163-20145
BD Perm/Wash buffer	BD Biosciences	554723	Perm/Wash buffer
Cyclosporin A	abcam	59865-13-3
EDTA	Invitrogen	15575-038	8 mM
G 418 disulfate salt	Merck	108321-42-2
Halt Protease Inhibitor Cocktail  EDTA-free (100x)	Thermo Scientific	78425
HEPES	Merck	7365-45-9
illustraTM RNAspin Mini RNA isolation kits	GE Healthcare	25-0500-71
illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit	GE Healthcare	25-0500-71
ImProm-II Reverse Transcription System	Promega	A3800
KAPA SYBR FAST qPCR Kit	Kapa Biosystems	KK4600
Lenti-X Concentrator	Takara bio	PT4421-2	concentrator
Luminata crescendo Western HRP substrate	Merck	WBLUR0100
Master Mix (2x) Universal	Kapa Biosystems	KK4600
Nucleospin DNA extraction kit	macherey-nagel	1806/003
Phosphate buffered saline	Merck	P3813
Polyethylene glycol 8000	Merck	25322-68-3
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo scientific	P36930
Recombinant NTCP	Cloud-Clone	RPE421Hu02
RIPA Lysis Buffer (10x)	Merck	20-188
TCA	Sigma	345909-26-4
TCA Elisa kit	Mybiosource	MB2033685
Triton X-100	Merck	9036-19-5
Trypsin-EDTA	Gibco	25200072	Dilute to 0.125%
Antibodies
Anti-NTCP1 antibody	Abcam	ab131084	1:100 dilution
Anti-GAPDH antibody	Thermo Fisher Scientific	AM4300	1:200,000 dilution
HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody	Abcam	ab205718	1:10,000 dilution
HRP goat anti-mouse secondary antibody	Abcam	ab97023	1:10,000 dilution
Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11008	1:500 dilution
Reagent composition
1° Antibody dilution buffer
1x TBST
3% BSA	Sigma	A7906-100G	Working concentration: 3%
Sodium azide	Sigma	199931	Working concentration: 0.05%
Hepatocyte Growth Medium
DME/F12	Gibco	12400-024
10% FBS	Sigma Aldrich	F7524
1% Pen/Strep	HyClon	SV30010
1% GlutaMAX	Gibco	35050-061
Hepatic maturation medium
Williams’ E medium	Sigma Aldrich	W4125-1L
10% FBS	Sigma Aldrich	F7524
1% Pen/Strep	HyClon	SV30010
1% GlutaMAX	Gibco	35050-061
5 µg/mL  Insulin	Sigma Aldrich	91077C-100MG
50 µM hydrocotisone	Sigma Aldrich	H0888-1g
2% DMSO	PanReac AppliChem	A3672-250ml
IF Blocking solution
1x PBS	Gibco	21300-058
3% BSA	Sigma	A7906-100G	Working concentration: 3%
0.2% Triton X-100	Sigma	T8787	Working concentration: 0.2%
RIPA Lysis Buffer Solution	Merck	20-188	Final concentration: 1X
Protease Inhibitor Cocktail	Thermo Scientific	78425	Final concentration: 1X
Na3VO4			Final concentration: 1 mM
PMSF			Final concentration: 1 mM
NaF			Final concentration: 10 mM
Western blot reagent
10x Tris-buffered saline (TBS)	Bio-Rad	170-6435	Final concentration: 1X
Tween 20	Merck	9005-64-5
1x TBST			0.1% Tween 20
1x PBS	Gibco	21300-058
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	A53225
Polyacrylamide gel	Bio-Rad	161-0183
Ammonium Persulfate (APS)	Bio-Rad	161-0700	Final concentration: 0.05%
TEMED	Bio-Rad	161-0800	Stacker gel: 0.1%, Resolver gel: 0.05%
2x Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	161-0737	Final concentration: 1X
Precision Plus Protein Dual Color Standards	Bio-Rad	161-0374
WB Blocking solution/ 2° Antibody dilution buffer
1x TBST
5% Skim milk (nonfat dry milk)	Bio-Rad	170-6404	Working concentration: 5%
1x Running buffer 1 L
10x Tris-buffered saline (TBS)	Bio-Rad	170-6435	Final concentration: 1X
Glycine	Sigma	G8898	14.4 g
SDS	Merck	7910	Working concentration: 0.1%
Blot transfer buffer 500 mL
10x Tris-buffered saline (TBS)	Bio-Rad	170-6435	Final concentration: 1X
Glycine	Sigma	G8898	7.2 g
Methanol	Merck	106009	100 mL
Mild stripping solution 1 L			Adjust pH to 2.2
Glycine	Sigma	G8898	15 g
SDS	Merck	7910	1 g
Tween 20	Merck	9005-64-5	10 mL
Equipments
15 mL centrifuge tube	Corning	430052
50 mL centrifuge tube	Corning	430291
Airstream Class II	Esco	2010621	Biological safety cabinet
CelCulture CO2 Incubator	Esco	2170002	Humidified tissue culture incubator
CFX96 Touch Real-Time PCR Detector	Bio-Rad	1855196
FACSVerse Flow Cytometer	BD Biosciences	651154
Graduated pipettes (10 mL)	Jet Biofil	GSP010010
Graduated pipettes (5 mL)	Jet Biofil	GSP010005
MicroCal PEAQ-ITC	Malvern		Isothermal titration calorimeters
Mini PROTEAN Tetra Cell	Bio-Rad	1658004	Electrophoresis chamber
Mini Trans-blot absorbent filter paper	Bio-Rad	1703932
Omega Lum G Imaging System	Aplegen	8418-10-0005
Pipette controller	Eppendorf	4430000.018	Easypet 3
PowerPac HC	Bio-Rad	1645052	Power supply
PVDF membrane	Merck	IPVH00010
T-75 cell culture flask	Corning	431464U
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell	Bio-Rad	1703940	Semi-dry transfer cell
Ultrasonic processor (Vibra-Cell VCX 130)	Sonics & Materials
Versati Tabletop Refrigerated Centrifuge	Esco	T1000R	Centrifuge with swinging bucket rotar