Das Zusammenspiel zwischen natürlichen Killerzellen und Nozizeptorneuronen herauskitzeln

Zusammenfassung

Nozizeptorneuronen und NK-Zellen interagieren aktiv in einem entzündlichen Kontext. Ein Kokulturansatz ermöglicht es, dieses Zusammenspiel zu untersuchen.

Zusammenfassung

Somatosensorische Neuronen haben sich entwickelt, um schädliche Reize zu erkennen und Abwehrreflexe zu aktivieren. Durch den Austausch von Kommunikationsmitteln stimmen Nozizeptorneuronen auch die Abwehrkräfte des Wirts ab, indem sie die Aktivität des Immunsystems steuern. Die Kommunikation zwischen diesen Systemen ist meist adaptiv und hilft, die Homöostase zu schützen, sie kann auch zum Ausbruch chronischer Krankheiten führen oder diese fördern. Beide Systeme haben sich gemeinsam entwickelt, um eine solche lokale Interaktion zu ermöglichen, wie sie in primären und sekundären lymphatischen Geweben und Schleimhäuten zu finden ist. Neuere Studien haben gezeigt, dass Nozizeptoren Fremdantigene, Immunzell-abgeleitete Zytokine und Mikroben direkt erkennen und darauf reagieren.

Die Aktivierung von Nozizeptoren führt nicht nur zu Schmerzüberempfindlichkeit und Juckreiz, sondern senkt auch die Nozizeptor-Feuerschwelle, was zur lokalen Freisetzung von Neuropeptiden führt. Die Peptide, die von den peripheren Terminals von Nozizeptoren produziert und freigesetzt werden, können die Chemotaxis und Polarisation von Lymphozyten blockieren und die Lokalisation, Dauer und Art der Entzündung kontrollieren. Jüngste Erkenntnisse zeigen, dass sensorische Neuronen mit angeborenen Immunzellen über Zell-Zell-Kontakt interagieren, zum Beispiel Gruppen-2D-Rezeptoren (NKG2D) auf natürlichen Killerzellen (NK).

Da NK-Zellen die verwandten Rezeptoren für verschiedene Nozizeptor-produzierte Mediatoren exprimieren, ist es denkbar, dass Nozizeptoren Neuropeptide verwenden, um die Aktivität von NK-Zellen zu steuern. Hier entwickeln wir eine Co-Kulturmethode, um Nozizeptor-Neuron-NK-Zell-Interaktionen in einer Schale zu untersuchen. Mit diesem Ansatz fanden wir heraus, dass lumbale Nozizeptorneuronen die NK-Zellzytokinexpression verringern. Insgesamt könnte eine solche reduktionistische Methode nützlich sein, um zu untersuchen, wie tumorinnervierende Neuronen die Antikrebsfunktion von NK-Zellen steuern und wie NK-Zellen die Eliminierung verletzter Neuronen steuern.

Einleitung

Die Zellkörper sensorischer Neuronen stammen aus den dorsalen Wurzelganglien (DRG). Die DRG befinden sich im peripheren Nervensystem (PNS), zwischen dem Rückenhorn des Rückenmarks und den peripheren Nervenendigungen. Die pseudo-unipolare Natur von DRG-Neuronen ermöglicht die Übertragung von Informationen vom peripheren Ast, der das Zielgewebe innerviert, zum zentralen Ast, der die somatosensorische Information zum Rückenmark transportiert¹. Unter Verwendung spezialisierter Ionenkanalrezeptoren spüren Neuronen erster Ordnung Bedrohungen durch Krankheitserreger, Allergene und Schadstoffe², was zum Einstrom von Kationen (Na+, Ca²⁺) und zur Erzeugung eines Aktionspotentials 3,4,5 führt.

Diese Neuronen senden auch ein antidromisches Aktionspotential in Richtung Peripherie, wo die anfängliche Gefahrenwahrnehmung aufgetreten war, was zur lokalen Freisetzung von Neuropeptiden^{führt 1,4}. Daher dienen die Nozizeptorneuronen als Schutzmechanismus, der den Wirt vor Umweltgefahren 4,5,6,7 warnt.

Um mit Neuronen zweiter Ordnung zu kommunizieren, setzen die Nozizeptoren verschiedene Neurotransmitter (z. B. Glutamat) und Neuropeptide (z. B. Calcitonin-Gen-verwandtes Peptid (CGRP), Substanz P (SP) und vasoaktives intestinales Peptid (VIP)) frei)^6,7. Diese Peptide wirken auf Kapillaren und fördern Plasmaextravasation, Ödeme und den lokalen Einstrom und die Modulation von Immunzellen ^2,4,7.

Das somatosensorische und das Immunsystem nutzen ein gemeinsames Kommunikationssystem, das aus Zytokinen und Neuropeptiden und ihren jeweiligen verwandten Rezeptoren besteht⁴. Während diese bidirektionale Kommunikation hilft, vor Gefahren zu schützen und die Homöostase zu erhalten, kann sie auch zur Krankheitspathophysiologie beitragen⁴.

NK-Zellen werden als angeborene lymphatische Zellen klassifiziert und sind darauf spezialisiert, viral infizierte Zellen zu eliminieren. Die NK-Zellfunktion wird durch ein Gleichgewicht von stimulierenden und inhibitorischen Rezeptoren gesteuert, einschließlich des aktivierenden Rezeptors NKG2D⁸. Der endogene Ligand von NKG2D, Retinsäure früh induzierbar1 (RAE1), wird von Zellen exprimiert, die Stress ausgesetzt sind, wie Tumorgenese und Infektion ^8,9.

Neuere Untersuchungen haben gezeigt, dass periphere Nervenverletzungen sensorische Neuronen dazu bringen, maladaptive Moleküle wie Stathmin 2 (STMN2) und RAE1 zu exprimieren. So wurden über Zell-Zell-Kontakt NKG2D-exprimierende NK-Zellen durch Interaktion mit RAE1-exprimierenden Neuronen aktiviert. Im Gegenzug waren NK-Zellen in der Lage, verletzte Nozizeptorneuronen und stumpfe Schmerzüberempfindlichkeit zu eliminieren, die normalerweise mit Nervenverletzungen einhergeht¹⁰. Zusätzlich zur NKG2D-RAE1-Achse exprimieren NK-Zellen die verwandten Rezeptoren für verschiedene Nozizeptor-produzierte Mediatoren. Es ist daher möglich, dass diese Mediatoren die NK-Zellaktivität modulieren. Dieser Artikel stellt eine Kokulturmethode vor, um die Biologie der Neuron-NK-Zellinteraktion des Nozizeptors zu untersuchen. Dieser Ansatz wird dazu beitragen, das Verständnis dafür zu verbessern, wie Nozizeptorneuronen angeborene Immunzellreaktionen auf Verletzungen, Infektionen oder Malignität modulieren.

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Protokoll

Die Institutional Animal Care and Use Committees der Université de Montréal (#22053, #22054) genehmigten alle Tierverfahren. Siehe Tabelle 1 für eine Liste der Lösungen und ihrer Zusammensetzung und die Tabelle der Materialien für eine Liste der Materialien , Ausrüstungen und Reagenzien, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. NK-Zellisolierung, -kultur und -stimulation

1. Erzeugen Sie Nozizeptorneuron intakt (Wurfgeschwisterkontrolle; TRPV1^wt::D TA^fl/wt) und ablatierte (TRPV1 cre::D TA fl/wt) Mäuse durch Kreuzung von Lox-Stop-Lox-Diphtherietoxin-Mäusen (DTA fl/^fl) mit TRPV1^{cre/wt-Mäusen}.
2. Mit CO₂ -Inhalation eine naive Wurfgeschwister-Kontrollmaus (TRPV1 wt::D TA^fl/wt) einschläfern.
3. Sammeln Sie die Milz in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, das 500 μL sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) enthält.
4. Homogenisieren Sie die Milz mit einem Stößel.
5. Verdünnen Sie die Zellen mit 1 ml sterilem PBS.
6. Filtern Sie die Mischung durch ein 50-μm-Zellsieb in ein 15-ml-konisches Röhrchen.
7. Füllen Sie das Volumen (10 ml) mit sterilem PBS auf.
8. Sammeln Sie 10 μL und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
9. Zentrifugieren Sie die Zellen (500 × g, 5 min) und entfernen Sie den Überstand.
10. Resuspendieren Sie die Zellen in einer Konzentration von 10⁸ Zellen / ml in ergänztem RPMI 1640-Medium.
11. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, um Milz-NK-Zellen mit einem Maus-NK-Zellisolierungskit magnetisch zu reinigen. Bestätigen Sie die Reinheit der NK-Zellen mittels Durchflusszytometrie¹¹.
12. Sammeln Sie 10 μL und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
13. Zentrifugieren Sie die Zellen (500 × g, 5 min) und entfernen Sie den Überstand.
14. Resuspendieren Sie die NK-Zellen in einem ergänzten RPMI 1640-Kulturmedium (enthält IL-2 und IL-15).
15. Kultur 2 × 10⁶ NK-Zellen/ml in einer 96-Well-U-Bodenplatte für 48 h.

2. DRG-Neuronenisolation und -kultur

1. 24 h vor dem Ende der NK-Zellstimulation (Schritt 1.15) eine 96-Well-Platte mit 100 μL/Well-Laminin (1 ng/ml) beschichten und 45 min (37 °C) inkubieren.
2. Entfernen Sie nach der Inkubation die Lösung und lassen Sie die Vertiefungen in einer Biosicherheitswerkbank an der Luft trocknen.
3. Unter Verwendung von CO₂ -Inhalation das Nozizeptorneuron intakt einschläfern (Wurfgeschwisterbekämpfung; TRPV1^wt::D TA^fl/wt) oder abgetragene (TRPV1^cre::D TA^fl/wt) Mäuse.
   HINWEIS: Die CO₂ -Inhalation wird der zervikalen Dislokation vorgezogen, da sie eine Störung der mit der DRG verbundenen Spinalnerven vermeidet.
4. Befestigen Sie die Maus in Bauchlage auf dem Brett, heben Sie die Haut an und schneiden Sie die Haut entlang der Rückensäule. Siehe Perner et al. für ein detailliertes Video¹².
5. Schneiden Sie das lumbosakrale Gelenk ab und trennen Sie das Kreuzbein mit einer Schere von der Lendenwirbelsäule.
6. Trennen Sie die Wirbelsäule, indem Sie die Muskeln und Rippen auf beiden Seiten der Wirbelsäule in kranialer Richtung schneiden, bis die Schädelbasis erreicht ist.
7. Schneiden Sie mit einer Schere die Wirbelsäule am Atlanto-Okzipitalgelenk ab.
8. Entfernen Sie Muskel- und Fettgewebe aus der Wirbelsäule.
9. Stecken und öffnen Sie die Wirbelsäule, um das Rückenmark zu entfernen und Zugang zum DRG zu erhalten. Suchen Sie nach dem DRG in der Foramina intervertebralis, die durch die Rückenwurzel mit dem Rückenmark verbunden ist, aber von den Hirnhäuten getrennt ist.
10. Ernten Sie die DRGs in ein 15-ml-konisches Röhrchen, das mit 10 mL eiskalt ergänztem DMEM gefüllt ist.
11. Zentrifugieren Sie die Zubereitung (200 × g, 5 min, Raumtemperatur) und entfernen Sie den Überstand.
12. Fügen Sie 250 μL PBS mit Kollagenase IV (1 mg/ml) und Dispase II (2,4 U/ml) hinzu.
13. Inkubieren Sie das DRG mit Collagenase IV/Dispase II (C/D) Lösung (80 min, 37 °C, leichtes Rühren). Wenn Sie Ganglien von mehreren Mäusen poolen, halten Sie ein Verhältnis von 125 μL C / D-Lösung pro Ganglion ein.
14. Um die Enzyme zu inaktivieren, fügen Sie 5 ml ergänztes DMEM-Medium hinzu.
15. Zentrifugieren Sie die Lösung (200 × g, 5 min) und entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette.
16. Um unerwünschten Zellverlust zu vermeiden, lassen Sie ~ 100 μL des Überstandes.
17. Fügen Sie 1 ml des ergänzten DMEM-Mediums hinzu.
18. Mit einer Pipettenpistole und drei Glaspasteurpipetten abnehmender Größe das DRG vorsichtig zu einem einzelligen Präparat trituieren (~ 10 nach oben / unten pro Pasteur-Pipettengröße).
19. In einer Biosicherheitswerkbank Rinderserumalbumin (BSA) in sterilem PBS auf eine Endkonzentration von 15% verdünnen. 1 ml Aliquots bei −20 °C lagern.
20. Erstellen Sie einen BSA-Gradienten in einem konischen 15-ml-Röhrchen, indem Sie 2 ml steriles PBS hinzufügen und langsam 1 ml 15% BSA-Lösung auf den Boden des Röhrchens dosieren. Vermeiden Sie eine Unterbrechung des Farbverlaufs, indem Sie die Pipette vorsichtig entfernen.
21. Mit einer P200-Pipette pipetten Sie die geriebene Gangliensuspension (die die Neuronen enthält) langsam auf die Seite der Röhre in den Farbverlauf.
22. Zentrifugieren Sie den neuronenhaltigen BSA-Gradienten (200 × g, 12 min, Raumtemperatur). Stellen Sie die Beschleunigung und Verzögerung der Zentrifuge auf die Mindestgeschwindigkeit ein.
    HINWEIS: Nach der Zentrifugation befinden sich die Neuronen am Boden der Röhre, während die Zelltrümmer im BSA-Gradienten eingeschlossen werden.
23. Entfernen Sie vorsichtig den gesamten Überstand mit einer Pipette.
24. Resuspendieren Sie die Zellen in 500 μL Neurobasal.
25. Platte 10⁴ Neuronen pro Vertiefung (200 μL neurobasal/Well) in einer Laminin-beschichteten, flachen 96-Well-Platte.
    HINWEIS: Im Durchschnitt wird ein Forscher in der Lage sein, ~ 8 Brunnen pro Maus zu füllen.
26. Kultur der Neuronen (37 °C, über Nacht), um eine Anhaftung zu ermöglichen.

3. Kokultur und Durchflusszytometrie

1. Entfernen Sie langsam das Neurobasal aus der Neuronenkultur.
2. Nach 48-stündiger Stimulation mit IL-2 und IL-15 (siehe Schritte 1.14-1.15) werden die NK-Zellen resuspendiert und 10⁵ NK-Zellen/Vertiefung in die Neuronenkultur gegeben (96-Well-Flachbodenplatte).
   HINWEIS: Im Durchschnitt wird der Ermittler in der Lage sein, ~ 6 Brunnen pro Maus zu füllen.
3. Co-Kultur der Zellen in ergänztem neurobasalem MX (37 °C, 48 h).
4. Die Zellen einsammeln, mit PBS waschen (3x) und zentrifugieren (500 × g, 5 min, 4 °C).
5. Verwerfen Sie den Überstand und färben Sie die Zellen mit Viability Dye eFlour-780 (1:1.000, 15 min, 4 °C).
6. Die Zellen einsammeln, mit PBS waschen (3x) und zentrifugieren (500 × g, 5 min, 4 °C).
7. Blockieren Sie unspezifische Stellen auf den Zellen mit CD16/32 (1:100, 15 min, 4 °C).
8. Die Zellen einsammeln, mit PBS waschen (3x) und zentrifugieren (500 × g, 5 min, 4 °C).
9. Färbung (15 min, 4 °C) der Zellen mit BV421 Anti-NK-1.1 (1:100), Fluorescein-Isothiocyanat (FITC), Anti-NKp46 (1:100) und Phycoerythrin (PE) Anti-GM-CSF (1:100).
10. Die Zellen einsammeln, mit PBS waschen (3x) und zentrifugieren (500 × g, 5 min, 4 °C).
11. Verwerfen Sie den Überstand, resuspendieren Sie die Zellen im FACS-Puffer (500 μL) und immunphänotypisieren Sie die NK-Zellen durch Durchflusszytometrie¹¹. Siehe Abbildung 1A für die Gating-Strategie.

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Ergebnisse

NK-Zellen wurden magnetisch aus Splenozyten der Wurfgeschwisterkontrolle (TRPV1 wt::D TA^fl/wt) Mäuse gereinigt und mit IL-2 und IL-15 stimuliert (48 h). Die NK-Zellen wurden dann allein kultiviert oder mit DRG-Neuronen co-kultiviert, die aus intakten Nozizeptorneuronen gewonnen wurden (Wurfgeschwisterkontrolle; TRPV1^wt::D TA^fl/wt) oder abgetragene (TRPV1^cre::D TA^fl/wt) Mäuse. Die Zellen wurden dann dem TRPV1-Agonisten Capsaicin (1 μM) oder seinem Vehike...

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Diskussion

Davies et ^al.11 fanden heraus, dass verletzte Neuronen RAE1 hochregulieren. Über Zell-Zell-Kontakt konnten NKG2D-exprimierende NK-Zellen dann RAE1⁺ -Neuronen identifizieren und eliminieren, was wiederum chronische Schmerzen begrenzt¹¹. Angesichts der Tatsache, dass NK-Zellen auch verschiedene Neuropeptidrezeptoren exprimieren und dass diese Neuropeptide für ihre immunmodulatorischen Fähigkeiten bekannt sind, erscheint es immer wichtiger, die Interakti...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-mouse CD16/32	Jackson Laboratory	Cat no: 017769
B-27	Jackson Laboratory	Cat no: 009669
Bovine Serum Albumin (BSA) culture grade	World Precision Instruments	Cat no: 504167
BV421 anti-mouse NK-1.1	Fisher Scientific	Cat no: 12430112
Cell strainer (50 μm)	Fisher Scientific	Cat no: A3160702
Collagenase IV	Fisher Scientific	Cat no: 15140148
Diphteria toxinfl/fl	Fisher Scientific	Cat no: SH3057402
Dispase II	Fisher Scientific	Cat no: 13-678-20B
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Fisher Scientific	Cat no: 07-200-95
EasySep Mouse NK Cell Isolation Kit	Sigma	Cat no: CLS2595
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	Cat no: C0130
FACSAria III	Sigma	Cat no: 04942078001
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	Cat no: 806552
FITC anti-mouse NKp46	Sigma	Cat no: L2020
Flat bottom 96-well plate	Sigma	Cat no: 03690
Glass Pasteur pipette	Sigma	Cat no: 470236-274
Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF)	VWR	Cat no: 02-0131
Laminin	Cedarlane	Cat no: 03-50/31
L-Glutamine	Gibco	Cat no: A14867-01
Mouse recombinant IL-15	Gibco	Cat no: 22400-089
Mouse recombinant IL-2	Gibco	Cat no: 21103-049
Nerve Growth Factor (NGF)	Life Technologies	Cat no: 13257-019
Neurobasal media	PeproTech	Cat no: 450-51-10
PE anti-mouse GM-CSF	PeproTech	Cat no: 212-12
Penicillin and Streptomycin	PeproTech	Cat no: 210-15
Pestles	Stem Cell Technology	Cat no: 19855
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Biolegend	Cat no: 108732	Clone PK136
RPMI 1640 media	Biolegend	Cat no: 137606	Clone 29A1.4
TRPV1Cre	Biolegend	Cat no: 505406	Clone MP1-22E9
Tweezers and dissection tools.	Biolegend	Cat no: 65-0865-14
U-Shaped-bottom 96-well plate	Biolegend	Cat no: 101319
Viability Dye eFlour-780	Becton Dickinson