Demonstration der haarigen und kahlen Hautinnervation in einem 3D-Muster unter Verwendung mehrerer fluoreszierender Färbe- und Gewebereinigungsansätze

Zusammenfassung

Die Dicke der Gewebeschnitte schränkte die morphologische Untersuchung der Hautinnervation ein. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine einzigartige Gewebereinigungstechnik zur Visualisierung von kutanen Nervenfasern in dicken 300 μm Gewebeschnitten unter konfokaler Mikroskopie.

Zusammenfassung

Hautinnervation ist ein wichtiger Teil des peripheren Nervensystems. Obwohl das Studium der kutanen Nervenfasern schnell vorangekommen ist, stammt der größte Teil des Verständnisses ihrer verteilungsbedingten und chemischen Eigenschaften aus der konventionellen histochemischen und immunhistochemischen Färbung auf dünnen Gewebeschnitten. Mit der Entwicklung der Gewebereinigungstechnik ist es möglich geworden, die Hautnervenfasern auf dickeren Gewebeschnitten zu betrachten. Das vorliegende Protokoll beschreibt die mehrfache fluoreszierende Färbung auf Gewebeschnitten mit einer Dicke von 300 μm aus der Plantar- und Rückenhaut von Rattenhinterfuß, den beiden typischen behaarten und kahlen Hautstellen. Hier markiert das Calcitonin-Gen-verwandte Peptid die sensorischen Nervenfasern, während Phalloidin und der endotheliale Hyaluronrezeptor 1 des Lymphgefäßes die Blut- bzw. Lymphgefäße markieren. Unter einem konfokalen Mikroskop wurden die markierten sensorischen Nervenfasern vollständig auf längere Distanz verfolgt, in Bündeln in der tiefen Hautschicht und Freestyle in der oberflächlichen Schicht. Diese Nervenfasern verliefen parallel zu den Blutgefäßen oder umgaben sie, und Lymphgefäße bildeten ein dreidimensionales (3D) Netzwerk in der behaarten und kahlen Haut. Das aktuelle Protokoll bietet einen effektiveren Ansatz zur Untersuchung der Hautinnervation als die bestehenden konventionellen Methoden aus methodischer Sicht.

Einleitung

Die Haut, das größte Organ im Körper, das als Schlüsselschnittstelle zur Umwelt dient, wird von vielen Nervenfasern dicht innerviert ^1,2,3. Obwohl die Hautinnervation zuvor mit verschiedenen histologischen Methoden, wie der Färbung auf ganzer Haut und Gewebeabschnitten ^4,5,6, umfassend untersucht wurde, ist der detaillierte effektive Nachweis von Hautnervenfasern immer noch eine Herausforderung ^7,8. Vor diesem Hintergrund entwickelte das vorliegende Protokoll eine einzigartige Technik, um kutane Nervenfasern im dicken Gewebeabschnitt deutlicher darzustellen.

Aufgrund der Grenze durch die Dicke der Abschnitte ist die Beobachtung von innervierten Hautnervenfasern nicht präzise genug, um die Beziehung zwischen Calcitonin-Gen-related Peptide (CGRP) Nervenfasern und lokalen Geweben und Organen aus den aufgenommenen Bildinformationen genau darzustellen. Das Aufkommen der 3D-Gewebereinigungstechnologie bietet eine praktikable Methode, um dieses Problem zu lösen ^9,10. Die schnelle Entwicklung von Gewebe-Clearing-Ansätzen hat in jüngster Zeit viele Werkzeuge zur Untersuchung von Gewebestrukturen, ganzen Organen, neuronalen Projektionen und ganzen Tieren angeboten¹¹. Das transparente Hautgewebe könnte in einem viel dickeren Abschnitt durch konfokale Mikroskopie abgebildet werden, um die Daten zur Visualisierung von kutanen Nervenfasern zu erhalten.

In der aktuellen Studie wurde die Plantar- und Rückenhaut eines Rattenhinterfußes als die beiden Zielstellen von behaarter und kahler Haut^ausgewählt 3,4,7. Um die Hautnervenfasern in größerer Entfernung zu verfolgen, wurde das Hautgewebe in einer Dicke von 300 μm für die immunhistochemische und histochemische Färbung geschnitten, gefolgt von einer Gewebereinigungsbehandlung. CGRP wurde verwendet, um die sensorischen Nervenfasern^12,13 zu kennzeichnen. Um die kutanen Nervenfasern auf dem Gewebehintergrund hervorzuheben, wurden außerdem Phalloidin und der endotheliale Hyaluronrezeptor 1 (LYVE1) verwendet, um die Blutgefäße bzw. Lymphgefäße^14,15 zu markieren.

Diese Ansätze lieferten eine einfache Methode, die angewendet werden kann, um eine hochauflösende Ansicht der kutanen Nervenfasern zu demonstrieren und auch die räumliche Korrelation zwischen den Nervenfasern, Blutgefäßen und Lymphgefäßen in der Haut zu visualisieren, was viel mehr Informationen liefern kann, um die Homöostase der normalen Haut und die Hautveränderung unter den pathologischen Bedingungen zu verstehen.

Protokoll

Die vorliegende Studie wurde von der Ethikkommission des Instituts für Akupunktur und Moxibustion der China Academy of Chinese Medical Sciences genehmigt (Referenznummer D2018-04-13-1). Alle Verfahren wurden nach dem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington, D.C., 1996) durchgeführt. Drei erwachsene männliche Ratten (Sprague-Dawley, Gewicht 230 ± 15 g) wurden in dieser Studie verwendet. Alle Tiere wurden in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus mit kontrollierter Temperatur und Luftfeuchtigkeit untergebracht und erlaubten freien Zugang zu Nahrung und Wasser.

1. Perfusion und Probenvorbereitung

1. Injizieren Sie 250 mg/kg Tribromethanollösung (siehe Materialtabelle) intraperitoneal in die Ratte, um Euthanasie zu induzieren.
2. Sobald die Atmung aufhört, verwenden Sie eine chirurgische Schere aus Edelstahl, um die Brusthöhle der Ratte zu öffnen. Verwenden Sie 20-G-Nadeln, um über den linken Herzventrikel 13 mit einer Rate von 3 ml / min mit 100 ml 0,9% normaler Kochsalzlösung zu perfundieren, gefolgt von 250-300 ml 4% Paraformaldehyd in 0,1 m Phosphatpuffer (PB, pH 7,4) (Abbildung 1A, B).
3. Verwenden Sie nach der Perfusion ein Skalpell, um die Haut des Rückens und der Sohle von der Hinterpfote zu entfernen.
   1. Für die Proben, die einen gefrorenen Abschnitt benötigen, fixieren Sie das Gewebe in 4% Paraformaldehyd in 0,1 M PB für 2 h; dann kryoschützen Sie das Gewebe in 25% Saccharose in 0,1 M PB für mehr als 24 h bei 4 °C
   2. Für die Proben mit dem dicken Abschnitt, der eine Gewebereinigung erfordert, fixieren Sie das Gewebe in 4% Paraformaldehyd in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1x PBS) für 2 h; dann kryoschützen Sie das Gewebe in 1x PBS bei 4 °C (Abbildung 1C–E).

2. Dreifach fluoreszierende Färbung mit CGRP, Phalloidin und LYVE1, gefolgt von einer Gewebereinigungsbehandlung

HINWEIS: Die dreifach fluoreszierende Färbung mit CGRP, Phalloidin und LYVE1 wurde angewendet, um die Nervenfasern, Blutgefäße und Lymphgefäße in behaarter und kahler Haut auf Gewebeabschnitten mit einer Dicke von 300 μm nach der Gewebereinigungsbehandlung freizulegen.

1. Bereiten Sie 2% Agarose in 1x PBS zu, indem Sie es in einem Mikroofen für 2 Minuten erhitzen, bis sich die Agarose auflöst (siehe Materialtabelle).
2. Nach dem Waschen betten Sie die Hauttücher bei 37 °C in 2% Agarose ein und legen sie zum Abkühlen in den Eiskasten (Abbildung 1F,G).
3. Befestigen Sie das montierte Gewebe auf dem Vibrationsmikrotom mit dem Eiswasser und schneiden Sie es in einer Dicke von 500 μm in Querrichtung. Verwenden Sie die folgenden Parameter, um den Vibrationsschnitt einzustellen und das Schneiden abzuschließen: Geschwindigkeit 0,50 mm/s und Amplitude 1,5 mm (Abbildung 1H-K).
4. Entfernen Sie nach dem Schneiden die Agarose aus den Abschnitten und lagern Sie sie in einer Platte mit sechs Vertiefungen mit 1x PBS (pH 7,4) (Abbildung 1L).
5. Inkubieren Sie die Gewebeabschnitte in einer Lösung von 2% Triton X-100 in 1x PBS (TriX-PB) über Nacht bei 4 °C. Siehe Abbildung 2 für das folgende Verfahren.
6. Legen Sie die Gewebeabschnitte in den Sperrpuffer und drehen Sie sie mit 72 U / min auf dem Shaker über Nacht bei 4 ° C.
   HINWEIS: Die Blockierpufferzusammensetzung besteht zu 10% aus normalem Eselserum, 1% Triton-X 100 und 0,2% Natriumazid in 1x PBS (siehe Materialtabelle).
7. Die Gewebeabschnitte werden in die Lösung mit den primären Antikörpern des monoklonalen Anti-CGRP-Antikörpers (1:500) der Maus und des polyklonalen Anti-LYVE1-Antikörpers (1:500) im Verdünnungspuffer im Mikrozentrifugenröhrchen (siehe Materialtabelle) überführt und 2 Tage lang bei 4 °C auf dem Shaker gedreht.
   HINWEIS: Die Zusammensetzung des Verdünnungspuffers beträgt 1% normales Eselserum, 0,2% Triton-X 100 und 0,2% Natriumazid in 1x PBS.
8. Waschen Sie die Gewebepartien zweimal mit Waschpuffer bei Raumtemperatur und halten Sie sie dann über Nacht bei 4 °C im Waschpuffer auf dem Shaker.
   HINWEIS: Die Zusammensetzung des Waschpuffers beträgt 0,2% Triton-X 100 in 0,1 M PB (pH 7,4).
9. Am nächsten Tag die Gewebeabschnitte in die Mischlösung mit den sekundären Antikörpern von Esel-Anti-Maus-IgG H&L Alexa-Flour488 (1:500) und Esels-Antischaf-IgG H&L Alexa-Flour405 (1:500) sowie Alexa-Flour594 Phalloidin (1:1000) (siehe Materialtabelle) in einem Mikrozentrifugenröhrchen überführen und bei 72 U/min auf dem Shaker 5 h bei 4 °C drehen.
10. Waschen Sie die Gewebeabschnitte in einer Sechs-Well-Platte mit Waschpuffer für 1 h, zweimal, bei Raumtemperatur. Halten Sie die Gewebeabschnitte im Waschpuffer auf dem Shaker über Nacht bei 4 °C.
11. Übertragen Sie die Gewebeabschnitte in das Gewebereinigungsreagenz (siehe Materialtabelle, ihr Volumen war fünfmal höher als das Probenvolumen) und drehen Sie sie mit 60 U / min auf dem Shaker sanft für 1 h bei Raumtemperatur.
    HINWEIS: Nach dieser Behandlung werden die Gewebeabschnitte deutlich (Abbildung 2B).
12. Montieren Sie das gereinigte Gewebe auf dem Objektträger, umkreisen Sie das Gewebe mit einem Abstandshalter und kleben Sie den Spalt mit frischem Gewebereinigungsreagenz und Deckglas.

3. Dreifachfluoreszierende Färbung mit CGRP, Phalloidin und LYVE1 nach dem konventionellen Ansatz

HINWEIS: Zum Vergleich: Die gleiche Färbung wurde an Gewebeschnitten mit einer Dicke von 30 μm nach herkömmlichen Techniken durchgeführt.

1. Schneiden Sie die Gewebeschnitte bei 30 μm auf einem Mikrotom in Querrichtung und montieren Sie sie auf dem Objektträger.
2. Fügen Sie eine Blocklösung mit 3% normalem Eselserum und 0,3% Triton X-100 in 0,1 M PB hinzu und inkubieren Sie die Abschnitte für 30 min bei Raumtemperatur.
3. Entfernen Sie die blockierende Lösung und inkubieren Sie die Abschnitte mit der Lösung, die die primären Antikörper des monoklonalen Anti-CGRP-Antikörpers der Maus (1:500) und des polyklonalen Anti-LYVE1-Antikörpers (1:500) enthält, in Verdünnungspuffer über Nacht bei 4 °C.
4. Am nächsten Tag die Gewebeschnitte dreimal mit 0,1 M PB (pH 7,4) waschen, die Mischlösung mit den sekundären Antikörpern von Esel Anti-Maus IgG H&L Alexa-Flour488 (1:500) und Esel Anti-Schaf IgG H&L Alexa-Flour405 (1:500) sowie Alexa-Flour594 Phalloidin (1:1000) auf die Abschnitte geben und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
5. Vor der mikroskopischen Beobachtung die Abschnitte dreimal in 0,1 M PB (pH 7,4) waschen und dann mit Deckgläsern aus 50% Glycerin abdecken.

4. Bildgebung und Analysen

1. Beobachten Sie die gefärbten Proben unter einem fluoreszierenden Mikroskop und nehmen Sie dann die Bilder mit einem konfokalen Mikroskop auf.
2. Erfassen Sie 30 Bilder (Z-Stacks) in jeweils 10-μm-Frames aus jedem 300 μm dicken Schnitt und integrieren Sie ein einzelnes In-Fokus-Bild mit einem Bildprozessor des konfokalen Mikroskopiesystems (siehe Materialtabelle).
   1. Führen Sie die folgenden Schritte in der Bildverarbeitungssoftware des konfokalen Aufbaus für die dreidimensionale (3D) Analyse durch: Legen Sie die | der Startfokalebene fest Endfokalebene | einstellen Festlegen der Schrittgröße | Tiefenmuster | auswählen | zur Bilderfassung Z-Serie.
      HINWEIS: Die Anregungs- und Emissionswellenlängen der blauen Fluoreszenzsignale betrugen 401 nm bzw. 421 nm. Die Anregungs- und Emissionswellenlängen grüner Fluoreszenzsignale betrugen 499 nm bzw. 519 nm. Die Anregungs- und Emissionswellenlängen roter Fluoreszenzsignale betrugen 591 nm bzw. 618 nm. 152 μm ist der Durchmesser des konfokalen Lochs (10x Objektivlinse, NA: 0,4). Die Bildaufnahmeauflösung betrug 1024 × 1024 Pixel.
3. Für die herkömmlichen Proben (Schritt 3) werden 30 Bilder (Z-Stacks) in 1 μm Frames aus jedem 30 μm dicken Abschnitt aufgenommen und diese Bilder wie oben erwähnt weiter behandelt (Schritte 4.1-4.2).
4. Demonstrieren Sie die Bilder im Muster der 3D-Rekonstruktion mit dem Bildverarbeitungssystem.
5. Führen Sie 3D-Rekonstruktionen durch, indem Sie konfokale Z-Stack-Bilder in Imaris 9.0 importieren (Zellbildgebungssoftware, siehe Materialtabelle) und Oberflächenrenderings basierend auf Fleckenintensitäten erstellen: Neue Oberflächen | hinzufügen Quellkanal | auswählen Bestimmen Sie die Parameter in der Option "Glatt" der | "Oberflächendetails" Bestimmen Sie die Parameter in der Schwellenwertoption der absoluten Intensität | Oberflächen | klassifizieren Fertigstellen.
6. Erfassen Sie Daten im Bereich positiver Nervenfasern mit der Zellbildgebungssoftware. Wählen Sie das gerenderte Bild | aus Statistiken | Detaillierte | Spezifische Werte | Volumen.

Ergebnisse

Nach der dreifach fluoreszierenden Färbung wurden die Nervenfasern, Blutgefäße und Lymphgefäße in der behaarten und kahlen Haut deutlich mit CGRP, Phalloidin bzw. LYVE1 markiert (Abbildung 3,4). Mit der Clearing-Behandlung können die CGRP-positiven Nervenfasern, Phalloidin-positiven Blutgefäße und LYVE1-positiven Lymphgefäße in größerer Tiefe abgebildet werden, um die vollständige Strukturinformation der Haut zu erfassen (Abbildung 3

Diskussion

Die vorliegende Studie liefert eine detaillierte Demonstration der kutanen Nervenfasern in der behaarten und kahlen Haut durch die Verwendung von Immunfluoreszenz auf dickeren Gewebeabschnitten mit Clearing-Behandlung und einer 3D-Ansicht, um die Hautinnervation besser zu verstehen. Die Antikörper-Inkubationszeit von bis zu 1-2 Tagen und ein Reinigungsprozess über Nacht sind wichtig. Diese beiden Schlüsselschritte wirken sich direkt auf die Immunfluoreszenzfärbungswirkung von dicken Abschnitten aus. Ein weiteres Prob...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x phosphate-buffered saline	Solarbio Life Sciences	P1020	pH 7.2-7.4, 0.01 Mol
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma Life Science	T48402-5G
Confocal fluorescence microscopy	Olympus Corporation	Fluoview FV1200
Donkey anti-mouse IgG H&L Alexa-Flour488	Abcam plc.	ab150105
Donkey anti-sheep IgG H&L Alexa-Flour405	Abcam plc.	ab175676
EP tube	Wuxi NEST Biotechnology Co.	615001	1.5 mL
Freezing stage sliding microtome system	Leica Biosystems	CM1860
Imaris Software	Oxford Instruments	v.9.0.1
IRIS standard scissor	WPI (World Precision Instruments Inc.)	503242
iSpacer	SunJin Lab co.	IS005
Micro forceps-Str	RWD	F11020-11
Mouse monoclonal anti-CGRP antibody	Santa cruz biotechnology, Inc.	sc-57053
Neutral buffered Formalin	Solarbio Life Sciences	G2161	10%
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch Laboratories	017-000-12	10 mL
Peristaltic pump	Longer Precision Pump Co., Ltd	BT300-2J
Phalloidin Alexa-Fluor 594	Thermo Fisher Scientific	A12381
RapiClear 1.52 solution	SunJin Lab co.	RC152001	10 mL
Regular agarose	Gene Company Limited	G-10
SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-Str	RWD	F13038-12
Sheep polyclonal anti-LYVE1 antibody	R&D Systems, Inc.	AF7939
Six-well plate	Corning Incorporated	3335
Sodium azide	Sigma Life Science	S2002	25 g
Sucrose	Sigma Life Science	V900116	500 g
Super Glue	Henkel AG & Co.	Pattex 502
Surgical Handles	RWD	S32003-12
Triton X-100	Solarbio Life Sciences	9002-93-1	100 mL
Urethane	Sigma Life Science	U2500	500 g
VANNAS spring scissors	RWD	S1014-12
Vibratory microtome	Leica Biosystems	VT1200S