Visualisierung von Hefeorganellen mit fluoreszierenden Proteinmarkern

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir die Verwendung einer Reihe von fluoreszierenden Protein-basierten Organellenmarkern in der Lebendzellbildgebung der knospenden Hefe (Saccharomyces cerevisiae).

Zusammenfassung

Die knospende Hefe, Saccharomyces cerevisiae, ist ein klassisches Modellsystem zur Erforschung der Funktion und Dynamik von Organellen. In unseren früheren Arbeiten haben wir fluoreszierende proteinbasierte Marker für wichtige Organellen und Endomembranstrukturen konstruiert, darunter den Zellkern, das endoplasmatische Retikulum (ER), den Golgi-Apparat, Endosomen, Vakuolen, Mitochondrien, Peroxisomen, Lipidtröpfchen und Autophagosomen. Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt die Verfahren zur Verwendung dieser Marker in Hefe, einschließlich der DNA-Vorbereitung für die Hefetransformation, der Auswahl und Bewertung von Transformanten, der fluoreszierenden mikroskopischen Beobachtung und der erwarteten Ergebnisse. Der Text richtet sich an Forscher, die aus anderen Bereichen in das Gebiet der Hefeorganellenforschung einsteigen. Es werden die wichtigsten Schritte sowie technische Hinweise zu Überlegungen zur Mikroskophardware und einige häufige Fallstricke behandelt. Es bietet einen Ausgangspunkt für Menschen, um subzelluläre Einheiten von Hefen durch Fluoreszenzmikroskopie von lebenden Zellen zu beobachten. Diese Werkzeuge und Methoden können verwendet werden, um die subzelluläre Lokalisierung von Proteinen zu identifizieren und Organellen von Interesse in der Zeitrafferbildgebung zu verfolgen.

Einleitung

Die subzelluläre Kompartimentierung in membrangebundene Organellen ist ein gängiges Prinzip in der Organisation eukaryotischer Zellen. Jedes Organell erfüllt bestimmte Funktionen. Wie in vielen anderen Bereichen der eukaryotischen Biologie war die knospende Hefe, Saccharomyces cerevisiae, ein klassisches Modellsystem zur Aufklärung der Grundprinzipien der Organellenorganisation und -dynamik. Beispiele hierfür sind die bahnbrechenden Entdeckungen des Proteinsekretionswegs, des peroxisomalen Proteinimportwegs und des Autophagiewegs ^1,2,3.

Unter typischen nährstoffreichen Bedingungen enthalten schnell wachsende Hefezellen endoplasmatisches Retikulum (ER), frühes Golgi, spätes Golgi/frühes Endosom, spätes Endosom, Vakuolen und Mitochondrien. Einige Peroxisomen, Lipidtröpfchen und Autophagosomen (sogar weniger als die ersten beiden, hauptsächlich vom Cvt-Vesikel-Typ, die unter nährstoffreichen Bedingungen vorhanden sind⁴) sind ebenfalls vorhanden, aber nicht so prominent, wie es unter bestimmten Kultivierungsbedingungen (lipidreiche Medien, Hungermedien usw.) der Fall wäre. Im Vergleich zu anderen gängigen eukaryotischen Modellen sind Hefezellen recht klein; Der Durchmesser einer typischen Hefezelle beträgt etwa 5 μm, verglichen mit Dutzenden von Mikrometern für die meisten tierischen und pflanzlichen Zellen. Infolgedessen sieht man im selben Bildgebungsfeld, das normalerweise eine einzige adhärente tierische Zelle enthält, normalerweise Dutzende von Hefezellen in verschiedenen Zellzyklusstadien. Neben dem Größenunterschied weist die Morphologie der Hefeorganellen auch einige Besonderheiten auf. Auf der ultrastrukturellen Ebene besteht das Hefe-ER wie bei anderen Systemen aus Blättern und Tubuli. Unter der Fluoreszenzmikroskopie manifestiert sich Hefe-ER als zwei Ringe mit einigen miteinander verbundenen Strukturen dazwischen. Der innere Ring ist das nukleare ER, das mit der Kernhülle durchgehend ist, und der äußere Ring ist das periphere ER, das ein röhrenförmiges Netzwerk ist, das unter der Plasmamembran⁵ liegt. Ähnlich wie bei pflanzlichen Zellen, aber anders als bei tierischen Zellen, befindet sich ein hybrides Organell, das späte Golgi/frühe Endosom, an der Schnittstelle zwischen dem sekretorischen und dem endozytären Signalweg ^6,7. Morphologisch sind Hefe-Golgi-Apparate im Zytoplasma dispergiert. Vakuolen sind funktionell analog zu Lysosomen in tierischen Zellen. Sie nehmen oft große Teile des Zytoplasmas ein und durchlaufen häufige Spaltungen und Fusionen. Neben der Verwendung von fluoreszierenden Kolokalisationsmarkern kann die Vakuolenmembran durch mindestens zwei Kriterien vom nukleären ER unterschieden werden: Die Vakuolenmembran ist im Allgemeinen runder als die nukleäre ER, und das konkave Erscheinungsbild der Vakuole ist bei DIC ebenfalls ausgeprägter als das des Zellkerns.

Routinemäßig verwenden wir eine Reihe von fluoreszierenden Protein-basierten Markern, um die oben genannten Organellen in lebenden Hefezellen sichtbar zu machen (Tabelle 1). Die Genauigkeit und Funktionalität dieser Organellenmarker wurde experimentell verifiziert ^7,8. Diese Markerkonstrukte sollen fluoreszierende Protein-Chimärenkassetten in das Hefegenom einbringen. Wie im Folgenden beschrieben, werden lineare DNA-Fragmente zur Vorbereitung der Hefetransformation entweder durch enzymatischen Verdau oder durch PCR-Amplifikation erzeugt ^7,8. Die linearen DNA-Fragmente werden durch homologe Rekombination in das Genom integriert. Für Plasmide, die in diesem Protokoll beschrieben werden, werden drei Arten von Designs verwendet. Beim ersten Typ, der die Mehrzahl der Plasmide abdeckt, ist es oft möglich, Transformanten zu erhalten, die mehrere Kopien des Konstrukts tragen. Dies ist in der Regel unerwünscht, da es zu expressionellen und möglicherweise funktionalen Variationen zwischen den Transformanten führt. Einzelkopie-Transformanten müssen durch Bildgebung, wie in diesem Protokoll beschrieben, durch Immunblotting oder durch sorgfältig konzipierte PCR-Tests identifiziert werden. Beim zweiten Typ, der GFP-Sed5, GFP-Pep12 und GFP-Atg8 umfasst, wird in haploiden Hefezellen nur eine Einzelkopienintegration hergestellt. Sowohl der erste als auch der zweite Typ halten die endogene Kopie des Markergens im Genom intakt. Eine dritte Art von Plasmiddesign, die Sec7-2GFP und Vph1-2GFP abdeckt, soll C-terminale Knock-Ins einführen, was dazu führt, dass die Chimären die einzige Kopie des entsprechenden Markergens sind.

Hier beschreiben wir das Verfahren zur Verwendung dieser Organellenmarker, liefern beispielhafte Mikroskopiebilder und diskutieren Vorsichtsmaßnahmen, die sich an Forscher richten, die neu in der Bildgebung von Hefeorganellen sind.

Protokoll

1. Aufbau des Hefestamms

1. Besorgen Sie sich Marker-Plasmide und einen geeigneten Hefestamm.
   HINWEIS: Die Plasmide sind bei Addgene erhältlich. Dieses Protokoll verwendet TN124 (MATa ura3 trp1 pho8Δ60 pho13Δ::LEU2), BY4741 (MATa leu2Δ0 ura3Δ his3Δ1 met15Δ0) und DJ03 (BY4741 trp1Δ::MET15) als Beispiele. Ein wichtiger Aspekt bei der Wahl des Stammes, abgesehen von der Art der wissenschaftlichen Frage, ist die Kompatibilität der Selektionsmarker. Die hier beschriebenen Organellenmarker-Plasmide verwenden URA3 und TRP1 als Selektionsmarker. Daher muss der Genotyp des Empfängerstamms ura3 und trp1 sein. Andernfalls muss man die Dehnung oder die Plasmide modifizieren.
2. Bereiten Sie Hefemedien nach den folgenden Rezepten vor.
   HINWEIS: SMD (synthetische minimale Dextrose; 2 % Glukose, 0,67 % Hefestickstoffbase (YNB) ohne Aminosäuren, 30 mg/l Adenin, 30 mg/l Lysin, 30 mg/l Methionin, 20 mg/l Histidin, 20 mg/l Uracil, 50 mg/l Tryptophan, 50 mg/l Leucin). SMD+CA (SMD mit Zusatz von 0,5 % Casaminosäuren). YPD (Hefeextrakt Pepton, Dextrose; 1% Hefeextrakt, 2% Pepton, 2% Glukose). SD-N (synthetische Dextrose ohne Stickstoff; 0,17% YNB ohne Aminosäuren und Ammoniumsulfat, 2% Glukose). Bitte beachten Sie den Abschnitt Diskussion, um über die Wahl des Mediums nachzudenken.
3. Erzeugen Sie vor dem Transformationsschritt linearisierte DNA-Fragmente durch enzymatischen Verdau oder PCR-Amplifikation eines Organellenmarkerplasmids.
   HINWEIS: Tabelle 1 listet die Restriktionsenzymstellen und PCR-Primer auf, um lineare Fragmente aus den Organellenmarker-Plasmiden zu erzeugen.
4. Kultivieren Sie Hefezellen in flüssigem YPD-Medium und transformieren Sie Hefe mit linearem DNA-Fragment.
   HINWEIS: Die Hefetransformation kann mit der herkömmlichen LiAc-basierten Methode⁹ oder anderen Methoden der Wahl durchgeführt werden. Es ist ratsam, geeignete Kontrollen für die Transformation einzuschließen, insbesondere eine Negativkontrolle ohne Plasmid oder Plasmid-abgeleitete DNA.
5. Auf einer geeigneten Selektionsplatte (z.B. für die URA3-Selektion SMD-Ura-Medium verwenden) bei 30 °C für 2-3 Tage inkubieren.
   HINWEIS: Es dauert etwa 2 Tage, bis einzelne Völker auftauchen.
6. Um die Expression und die Anzahl der Kopienkopien der fluoreszierenden Chimäre zu überprüfen, entnehmen Sie acht Kolonien von der Selektionsplatte, streifen Sie sie erneut auf frische Selektionsplatten und inkubieren Sie sie bei 30 °C.

2. Fluoreszenzmikroskopie: Allgemeine Verfahren und Einzelpunkt-Bildgebung

1. Hefezellen über Nacht in SMD-Flüssigmedium bei 30 °C unter Schütteln kultivieren.
2. Messen Sie am nächsten Morgen die optische Dichte der Hefekultur bei 600 nm (im Folgenden als OD₆₀₀ bezeichnet) mit einem Spektralphotometer oder Plattenlesegerät.
   HINWEIS: Mit etwas Übung beim Impfen von Hefe kann man in der Regel sicherstellen, dass OD₆₀₀ aller Proben zu diesem Zeitpunkt kleiner als 2 ist. Fällt sie höher aus, empfiehlt es sich, im nächsten Schritt stärker zu verdünnen und den Hefezellen mehr Zeit zur Erholung zu lassen.
3. Die Hefekultur wird mit einem frischen Medium auf ca. 0,2 OD₆₀₀ verdünnt.
4. Kultivieren Sie weiter, bis OD₆₀₀ etwa 0,8-1,0 erreicht.
   HINWEIS: Die Verdopplungszeit der Hefe beträgt ca. 1,5-2 h.
5. Legen Sie ein Deckglas auf Seidenpapier auf eine ebene Fläche, verteilen Sie 5 μl 1 mg/ml Concanavalin A auf der Oberseite des Deckglases und warten Sie 5 Minuten (Abbildung 1A)¹⁰.
   HINWEIS: Dieser Vorbereitungsschritt kann im Voraus durchgeführt werden.
6. Übertragen Sie 100 μl Hefekultur auf die Oberseite des Deckglases und warten Sie 5 Minuten.
7. Kombinieren Sie das Deckglas mit einem tragenden Objektträger, zwischen dem die Hefezellen liegen. Drücken Sie mit entsprechender Kraft, um den Aufsatz zu sichern.
   HINWEIS: Es braucht etwas Übung, um den richtigen Druck zu finden, so dass die Hefezellen eine unbewegliche Einzelschicht bilden, aber nicht zerkleinert werden (Abbildung 1B). Das flüssige Medium wird während dieses Schritts herausgedrückt und vom darunter liegenden Seidenpapier absorbiert.
8. Montieren Sie den Objektträger auf dem Mikroskoptisch. Lokalisieren und fokussieren Sie ein Pflaster von Hefezellen mit Differenzialinterferenzkontrast (DIC) oder Phasenkontrast (PC).
   HINWEIS: Verwenden Sie keine Fluoreszenz, um Zellen zu lokalisieren. Andernfalls kann das Signal vor der Datenerfassung ausgebleicht werden.
9. Konfigurieren Sie manuell drei Parametersätze zum Erfassen von Bild-Z-Stapeln: Z-Schnitt, Bildkanäle und Belichtungsparameter.
   HINWEIS: In der ergänzenden Abbildung 1 finden Sie GUI-Beispiele für Parametereinstellungen in einer kommerziellen Software. Das genaue Aussehen unterscheidet sich je nach Softwareplattform, aber die Optionen sind mehr oder weniger gleich.
   1. Z-Schnitt: Sammeln Sie Scheiben in 0,5 μm-Schritten für 15 Scheiben (Abdeckung von 7 μm Tiefe, in der Regel ausreichend für normale haploide Hefezellen).
   2. Bildgebungskanäle: Wählen Sie DIC oder PC für die Zellkonturen und die entsprechenden Fluoreszenzkanäle nach Bedarf.
   3. Intensität des Anregungslichts und Belichtungszeit: Stellen Sie die Intensität des Anregungslichts und die Belichtungszeit entsprechend der Probe ein.
      HINWEIS: Verwenden Sie als Ausgangspunkt 100 % für die Intensität des Anregungslichts und 100 ms für die Belichtungszeit. Verringern Sie die Lichtintensität, wenn Photobleaching mit dem Fortschreiten der Z-Stack-Sammlung offensichtlich wird oder wenn das Signal die Aufnahmekapazität der Kamera überschreitet (d. h. Signalsättigung); Erhöhen Sie die Lichtintensität, wenn das Signal-Rausch-Verhältnis niedrig ist.
10. Notieren Sie sich die Bildgebungseinstellungen und verwenden Sie die gleichen Einstellungen für alle zu vergleichenden Proben.
    HINWEIS: Verwenden Sie nicht die Einstellung "Auto" für die Datenerfassung und Bildvisualisierung. Es ist wichtig, die Einstellungen in einer Labornotiz festzuhalten, damit genau die gleichen Parameter bei zukünftigen experimentellen Wiederholungen erneut angewendet werden können. Einige Softwareanwendungen zur Steuerung von Mikroskopen haben die Möglichkeit, Einstellungen zu speichern und erneut anzuwenden. Trotzdem ist es ratsam, die Einstellungen unabhängig voneinander aufzeichnen zu lassen, da Softwareprofile von Kollegen unbeabsichtigt gelöscht oder geändert werden können.
11. Speichern Sie die Daten im 16-Bit-Multichannel-Stack-Format.
    HINWEIS: Speichern Sie nicht als 8-Bit-RGB-Bilder (oder 24-Bit-Bilder, wenn alle drei Farben gezählt werden). Im Abschnitt Bildvisualisierung (Abschnitt 4) finden Sie die Einschränkungen des 8-Bit-Formats.
12. Wechseln Sie zu einem völlig anderen Bereich für die nächste Bildstapelsammlung.
    HINWEIS: In angrenzenden Bereichen kann es zu Photobleiche und Phototoxizität kommen. Daher kann der aus diesen Bereichen gesammelte Bildstapel irreführend sein.

3. Zeitraffer-Bildgebung

HINWEIS: Das Verfahren der Zeitraffer-Bildgebung unterscheidet sich von dem für die Einzelzeitpunkt-Bildgebung in zwei Bereichen: Probenvorbereitung und Bildgebungsparameter.

1. Probenvorbereitung
   1. Eine 35-mm-Glasbodenschale mit 1 mg/ml Concanavalin A bestreichen und 5 Minuten oder länger warten.
   2. Geben Sie 1,5 ml Hefe-Flüssigkultur in die Schale und warten Sie 5 Minuten, damit sich die Hefezellen auf der Glasoberfläche absetzen können.
   3. Saugen Sie das flüssige Medium mit einer Pipette vom Rand der Schale ab und spülen Sie dann das Hefesediment vorsichtig mit etwa 1 ml frischem Medium ab, um unsicher anhaftende Zellen zu entfernen.
   4. Wiederholen Sie das Spülen 2-3 Mal. Mit einer Pipette aspirieren und dann vorsichtig 2 ml frisches Nährmedium hinzufügen.
2. Bildgebende Parameter
   1. Z-Schnitt: Sammeln Sie Schichten in 0,5 μm-Schritten für 15 Schnitte.
   2. Bildkanäle: Wählen Sie nach Bedarf aus.
   3. Intensität des Anregungslichts und Belichtungszeit: Verwenden Sie das Minimum, das erforderlich ist, um die zu untersuchende subzelluläre Struktur zu erkennen.
      HINWEIS: Bei Zeitrafferaufnahmen begrenzen Photobleiche und Phototoxizität durch wiederholte Beleuchtung die Gesamtzahl der Zeitpunkte, die erfasst werden können. Daher werden die Anregungsintensität und die Belichtungszeit in der Regel auf niedrige Werte eingestellt, so dass mehr Zeitpunkte abgebildet werden können.
   4. Bildgebungsintervall: Stellen Sie die Zeitintervalle ein, die für den zu untersuchenden biologischen Prozess geeignet sind.
      HINWEIS: Zum Beispiel dauert die Bildung eines Autophagosoms unter Hungerbedingungen etwa 5-10 Minuten; Ein Intervall von 1 Minute oder weniger wird bevorzugt, um die Dynamik zu verfolgen. Unter nährstoffreichen Bedingungen findet der Hefezellzyklus auf der Stundenskala statt; Ein längeres Intervall, wie z.B. 10-20 min, kann genutzt werden.
3. Wenn geeignete Hardware verfügbar ist, halten Sie die Temperatur der Schüssel bei 30 °C.
   HINWEIS: Die meisten biologischen Prozesse in Hefezellen können auch bei Raumtemperatur (RT) abgebildet werden, außer im Allgemeinen in einem langsameren Tempo.

4. Visualisierung von Bildstapeln und Bewertung der Anzahl der Integrationskopien

1. Installieren Sie die Fiji- oder ImageJ-Software für die Bildvisualisierung und -analyse^11,12.
   HINWEIS: Fiji ist eine auf ImageJ basierende Toolsammlung, die sich für die allgemeine Visualisierung und Verarbeitung biologischer Bilddaten eignet. Für die Bildverarbeitung, die in diesem Protokoll aufgeführt ist, ist ImageJ ohne zusätzliche Plugins ausreichend.
2. Wählen Sie geeignete Parameter für die Bildanzeige und den Vergleich.
   1. Öffnen Sie in Fidschi einige Z-Stack-Images.
   2. Ziehen Sie die Z-Position in jedem Stapel in den mittleren Bereich (oder an andere Positionen, wenn die zu untersuchende Struktur dort besser visualisiert wird).
   3. Gehen Sie zu Bild > > Helligkeit/Kontrast anpassen und klicken Sie auf Zurücksetzen.
   4. Verwenden Sie im Fenster Helligkeit/Kontrast (B&C) die Bildlaufleisten, um zwei Parameter, die Minimal- und Maximalwerte , zu ändern, um die zu untersuchende Struktur deutlich zu erkennen.
      HINWEIS: Im Allgemeinen wird der Minimalwert so eingestellt, dass er in leeren Bereichen nahe dem Durchschnittswert liegt, und der Maximalwert ist so eingestellt, dass er nahe am Maximum im Bild liegt. Diese Werte können aus dem angezeigten Histogramm abgeleitet werden (Abbildung 2A). Wenn die Imaging-Workstation farbkalibriert ist, kann der Minimalwert etwas höher eingestellt werden, um mehr Hintergrundsignale auszublenden.
   5. Klicken Sie im Fenster Helligkeit/Kontrast (B&C) auf Festlegen und wählen Sie im Popup-Fenster das Kontrollkästchen Auf alle anderen geöffneten Bilder übertragen.
      HINWEIS: Dieser Vorgang wendet die gleichen Helligkeits-/Kontrasteinstellungen (einschließlich der Minimal- und Maximalwerte) auf alle geöffneten Bilder an, damit die Bilder verglichen werden können.
   6. Schauen Sie sich verschiedene Bilder an und scrollen Sie durch den Z-Stapel in jedem Bild. Wenn die Bilder mit einem richtigen dunklen Hintergrund und etwas übertriebenen Sättigungen gut aussehen, notieren Sie sich die Einstellungen für Minimum und Maximum .
3. Wählen Sie für Mehrkanalbilder die Bildanzeigeeinstellungen für jeden Kanal aus:
   1. Gehen Sie zum Bild- > Farb- > Kanalwerkzeug und wählen Sie den Graustufenmodus im Popup-Fenster Kanäle aus.
   2. Gehen Sie jeden Kanal durch, wählen Sie die richtige Helligkeit/den richtigen Kontrast für diesen Kanal aus und notieren Sie sich die Einstellungen.
   3. Wenn Helligkeit/Kontrast angepasst ist, kehren Sie zum Fenster Kanäle zurück und wechseln Sie in den Kompositionsmodus , um mehrere Kanäle gleichzeitig zu visualisieren.
      HINWEIS: Die Pseudofarbe für jeden Kanal kann in den Kanälen manuell geändert werden, um sie an Ihre persönlichen Vorlieben anzupassen. Die Kontrollkästchen dienen zum Ein-/Ausblenden bestimmter Kanäle.
4. Verwenden Sie bei Bedarf die Markierungsfelder im Fenster "Kanäle", um bestimmte Kanäle ein- oder auszublenden.
5. Generieren Sie bei Bedarf Stapelprojektionen, indem Sie zu Bild > Stapel > Z-Projekt wechseln.
   HINWEIS: Es stehen mehrere Projektionsmodi zur Verfügung. Die maximale Intensität ist eine gute Wahl für eine schnelle Beurteilung. Die Art der Forschung sollte berücksichtigt werden, um zu bestimmen, ob ein bestimmter Projektionsmodus oder einzelne Scheiben für die Quantifizierung verwendet werden sollten. Die Projektion kann auch auf die Auswahl von Z-Scheiben beschränkt werden, um die Interferenz durch unscharfes Licht zu reduzieren.
6. Screening auf Single-Copy-Integration-Transformanten.
   1. Sobald die gleichen Helligkeits-/Kontrasteinstellungen auf alle geöffneten Bilder angewendet wurden, vergleichen Sie die Bildintensitäten der Proben, um die Plasmidintegrationszahl abzuleiten.
      HINWEIS: Die Bilder sollten nach dem allgemeinen Verfahren für die Bildgebung zu einem bestimmten Zeitpunkt aufgenommen werden, beginnend mit der Kultivierung über Nacht in einem flüssigen Medium. Multi-Copy-Integrationen (siehe Kolonie 2 und 3 in Abbildung 2B für Beispiele) sehen wesentlich heller aus als Single-Copy-Integrationen (Kolonie 1 in Abbildung 2B). Im Gegensatz dazu sehen Einzelkopien ähnlich aus (Abbildung 2B).
   2. Untersuchen Sie Bilder von acht Transformanten für jeden Stamm und stellen Sie sicher, dass Sie die gleichen Helligkeits-/Kontrasteinstellungen verwenden.
   3. Wiederholen Sie das Streifen und speichern Sie drei oder mehr Einzelkopie-Transformanten für nachfolgende Studien.
7. Exportieren Sie Bilder für die Präsentation.
   1. Gehen Sie zu Bild > Duplizieren , um eine Kopie des gewünschten Bildes zu erstellen, und geben Sie ihm einen Namen Ihrer Wahl.
   2. Gehen Sie zu Image > Geben Sie > 8-Bit ein , um die duplizierte Kopie von 16-Bit in 8-Bit zu konvertieren und nach Bedarf zu speichern.
      HINWEIS: Beachten Sie, dass, sobald dies angewendet wurde und die Helligkeits-/Kontrasteinstellungen nicht zuvor notiert wurden, es keine einfache Möglichkeit gibt, diese Informationen abzurufen, und daher keine einfache Möglichkeit, dieselbe Einstellung in nachfolgenden Bildvisualisierungen erneut anzuwenden. Dies ist auch der Grund, warum die vorherige Duplizieroperation empfohlen wird.
   3. Um einen Z-Stapel in eine Sammlung einzelner Bilder aufzuteilen, gehen Sie zu Bild->-Stapel > In Bilder stapeln und speichern Sie nach Bedarf.
      HINWEIS: Bilder können in Fidschi auch auf einen kleineren Bereich zugeschnitten werden.

Ergebnisse

Die Morphologie und Dynamik der Organellen kann sich ändern, da Hefezellen auf externe und interne Signale reagieren. Hier zeigen wir repräsentative Bilder von Hefeorganellen in der Mid-log-Phase (Abbildung 3A,B). Wie bereits erwähnt, haben mehrere Organellen ihre unterschiedlichen morphologischen Merkmale und sind daher ohne umfangreichen Vergleich mit anderen Organellenmarkern leicht zu erkennen. Dazu gehören ER, Mitochondrien und Vaku...

Diskussion

Das hier beschriebene Protokoll bietet einen einfachen Einstieg für Personen, die aus anderen Forschungsbereichen einsteigen, um die Bildgebung von Hefeorganellen zu erforschen. Bevor wir zu spezifischen Themen übergehen, möchten wir noch einmal betonen, dass man auf den übermäßigen Gebrauch von automatischen Funktionen in Imaging-Software verzichten muss. Mikroskopiebilder sind nicht nur hübsche Bilder, sie sind wissenschaftliche Daten, und daher sollte ihre Erfassung und Interpr...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenine	Sangon Biotech	A600013
Casaminoacid	Sangon Biotech	A603060
Concanavalin A from canavalia ensiformis (Jack bean)	Sigma Aldrich	L7647
D-Glucose	Sangon Biotech	A501991
Fiji			https://fiji.sc/
Glass-bottom petri dish	NEST	706001	Φ35 mm
ImajeJ			https://imagej.net/
Inverted florescence microscope	Olympus		IX83 equipped with UPLXAPO 100X oil immersion objective, Lumencor Spectra X light source, and Hamamatsu Orca Flash4.0 LT camera.
L-Histidine	Sangon Biotech	A604351
L-Leucine	Sangon Biotech	A100811
L-Lysine	Sangon Biotech	A602759
L-Methionine	Sangon Biotech	A100801
L-Tryptophan	Sangon Biotech	A601911
Microscope cover glass	CITOTEST	10222222C	22 mm x 22 mm, 0.16–0.19 mm
Microscope slides	CITOTEST	1A5101	25 mm x 75 mm, 1–1.2 mm
Peptone	Sangon Biotech	A505247
Uracil	Sangon Biotech	A610564
Visiview	Visitron System GmbH		https://www.visitron.de/products/visiviewr-software.html
Yeast extract	Sangon Biotech	A100850
Yeast nitrogen base without amino acids	Sangon Biotech	A610507
YNB without amino acids and ammonium sulfate	Sangon Biotech	A600505