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  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Reibungsprüfvorrichtung, die gleichzeitig reziprokes Gleiten und normale Belastung auf zwei sich berührende biologische Gegenflächen anwendet.

Zusammenfassung

Bei der primären Osteoarthritis (OA) hemmt normaler "Verschleiß" im Zusammenhang mit dem Altern die Fähigkeit des Knorpels, seine Trag- und Schmierfunktionen aufrechtzuerhalten, und fördert eine schädliche physikalische Umgebung. Die Reibungswechselwirkungen von Gelenkknorpel und Synovia können die Gelenkhomöostase durch Verschleiß auf Gewebeebene und zelluläre Mechanotransduktion beeinflussen. Um diese mechanischen und mechanobiologischen Prozesse zu untersuchen, wird ein Gerät beschrieben, das in der Lage ist, die Bewegung des Gelenks zu replizieren. Das Reibungsprüfgerät steuert die Abgabe von reziproken Übersetzungsbewegungen und normaler Belastung an zwei sich berührende biologische Gegenflächen. Diese Studie verwendet eine Synovium-auf-Knorpel-Konfiguration, und Reibungskoeffizientenmessungen werden für Tests vorgestellt, die in einem phosphatgepufferten Kochsalzlösung (PBS) oder Synovialflüssigkeitsbad (SF) durchgeführt werden. Die Tests wurden für eine Reihe von Kontaktspannungen durchgeführt, wobei die Schmiereigenschaften von SF unter hohen Belastungen hervorgehoben wurden. Dieses Reibungsprüfgerät kann als biomimetischer Bioreaktor zur Untersuchung der physikalischen Regulation von lebendem Gelenkgewebe als Reaktion auf angewandte physiologische Belastung im Zusammenhang mit der diarthrodialen Gelenkartikulation verwendet werden.

Einleitung

Osteoarthritis (OA) ist eine schwächende, degenerative Gelenkerkrankung, von der mehr als 32 Millionen amerikanische Erwachsene betroffen sind, mit Gesundheits- und sozioökonomischen Kosten von über 16,5 Milliarden US-Dollar1. Die Krankheit ist klassischerweise durch den Abbau von Gelenkknorpel und subchondralem Knochen gekennzeichnet; Veränderungen an der Synovia haben jedoch kürzlich Anerkennung gefunden, da Synovitis mit OA-Symptomen und Progression in Verbindung gebracht wurde 2,3,4. Bei primärer (idiopathischer) OA hemmt normaler "Verschleiß", der mit dem Altern verbunden ist, die Fähigkeit des Knorpels, seine Trag- und Schmierfunktionen aufrechtzuerhalten. Es hat sich gezeigt, dass die Spannungen, die durch längeren Gleitkontakt von Gelenkknorpelschichten oder Gleitkontakt von Knorpel gegen Implantatmaterialien erzeugt werden, den Delaminationsverschleiß durch Ermüdungsversagen unter der Oberfläche erleichtern 5,6. Da innerhalb des Gelenks eine dynamisch-mechanische Umgebung existiert7,8, können die Reibungswechselwirkungen von Gelenkknorpel und Synovia die Gelenkhomöostase durch Verschleiß auf Gewebeebene und zelluläre Mechanotransduktion beeinflussen. Um diese mechanischen und mechanobiologischen Prozesse zu untersuchen, wurde ein Gerät entwickelt, das die Bewegung des Gelenks mit strenger Kontrolle über die Druck- und Reibungsbelastung 5,6,9,10,11,12,13 repliziert.

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Reibungsprüfgerät, das reziproke, übersetzende Bewegung und Druckbelastung an Kontaktflächen lebender Gewebeexplantate liefert. Das computergesteuerte Gerät ermöglicht dem Benutzer die Kontrolle über die Dauer jedes Tests, die aufgebrachte Last, den Bewegungsumfang der Übersetzungsstufe und die Übersetzungsgeschwindigkeit. Das Gerät ist modular aufgebaut und ermöglicht das Testen verschiedener Gegenflächen, wie z. B. Gewebe auf Gewebe (Knorpel auf Knorpel und Synovium auf Knorpel) und Gewebe auf Glas. Zusätzlich zu den funktionellen Messungen, die der Tester erhält, können Gewebe- und Schmierbadkomponenten vor und nach der Prüfung bewertet werden, um die biologischen Veränderungen zu bewerten, die durch ein bestimmtes experimentelles Regime vermittelt werden.

Studien zur Knorpeltribologie werden seit Jahrzehnten durchgeführt, und es wurden mehrere Techniken entwickelt, um Reibungskoeffizienten zwischen Knorpel und Glas und Knorpel auf Knorpel14,15 zu messen. Die verschiedenen Ansätze werden durch das Gelenk und/oder den interessierenden Schmiermechanismus motiviert. Es gibt oft einen Kompromiss zwischen der Kontrolle experimenteller Variablen und der Rekapitulation physiologischer Parameter. Pendelartige Geräte verwenden intakte Gelenke als Dreh- und Angelpunkt eines einfachen Pendels, bei dem eine Gelenkoberfläche frei über die zweite Oberfläche14,16,17,18 übersetzt wird. Anstatt intakte Fugen zu verwenden, können Reibungsmessungen durch gleitende Knorpelexplantationen über gewünschte Oberflächen 14,19,20,21,22,23,24,25 erhalten werden. Die berichteten Reibungskoeffizienten des Gelenkknorpels schwankten je nach Betriebsbedingungen über einen weiten Bereich (von 0,002 bis 0,5) 14,26. Geräte wurden entwickelt, um die Drehbewegung23,27,28 zu replizieren. Gleghorn et al.26 entwickelten ein kundenspezifisches Multi-Well-Tribometer, um Knorpelschmierprofile mithilfe der Strieck-Kurvenanalyse zu beobachten, und eine lineare oszillierende Gleitbewegung wurde zwischen Knorpel gegen eine flache Glasgegenfläche angewendet.

Dieses Gerät zielt darauf ab, Reibungsreaktionen zu isolieren und die Mechanobiologie lebender Gewebe unter verschiedenen Belastungsbedingungen zu erforschen. Das Gerät verwendet einen vereinfachten Testaufbau, der die Gelenkartikulation durch Druckgleiten simuliert, der sowohl die Roll- als auch die Gleitbewegung annähern kann, mit dem Verständnis, dass der Widerstand in reiner Rollbewegung relativ zum gemessenen Reibungskoeffizienten von Gelenkknorpel29 vernachlässigbar ist. Ursprünglich entwickelt, um die Auswirkungen der interstitiellen Flüssigkeitsdruckbeaufschlagung auf die Reibungsreaktion von Gelenkknorpel9 zu untersuchen, wurde der Tester seitdem verwendet, um Themen wie Reibungseffekte der Entfernung der oberflächlichen Zone von Knorpel 10, schmierende Effekte von Synovialflüssigkeit11, Knorpelverschleißhypothesen 5,6,30 und Synovium-auf-Gewebe-Reibungsmessungen13 zu untersuchen . Der Reibungstest-Bioreaktor kann Reibungsexperimente unter sterilen Bedingungen durchführen und bietet einen neuartigen Mechanismus, um zu untersuchen, wie Reibungskräfte die mechanobiologischen Reaktionen von lebendem Knorpel und Synovium beeinflussen. Dieses Design kann als biomimetischer Bioreaktor verwendet werden, um die physikalische Regulation von lebendem Gelenkgewebe als Reaktion auf angewandte physiologische Belastung im Zusammenhang mit der diarthrodialen Gelenkartikulation zu untersuchen.

Diese Studie stellt eine Konfiguration für die Synovium-auf-Knorpel-Reibungsprüfung über eine Reihe von Kontaktspannungen und in verschiedenen Schmierbädern vor. Die bewegliche Oberfläche der meisten Gelenke ist zu einem großen TeilSynovialgewebe 31. Während Synovium-auf-Knorpel-Gleiten an primären tragenden Oberflächen nicht auftritt, können die Reibungswechselwirkungen zwischen den beiden Geweben immer noch wichtige Auswirkungen auf die Reparatur auf Gewebeebene und die Zellmechanotransduktion haben. Es wurde bereits gezeigt, dass fibroblastenähnliche Synoviozyten (FLS), die sich auf der intimen Schicht der Synovia befinden, mechanosensitiv sind und auf flüssigkeitsinduzierte Scherspannungreagieren 32. Es wurde auch gezeigt, dass Dehnung 33,34 und flüssigkeitsinduzierte Schubspannung35 die FLS-Schmierstoffproduktion modulieren. Daher kann der direkte Gleitkontakt zwischen Synovium und Knorpel den ansässigen Zellen in der Synovia einen weiteren mechanischen Reiz verleihen.

Nur wenige Berichte über Synoviumreibungskoeffizienten wurden veröffentlicht31,36. Estell et al.13 versuchten, die vorherige Charakterisierung durch die Verwendung biologisch relevanter Gegenflächen zu erweitern. Mit der Fähigkeit des Reibungsprüfgeräts, lebendes Gewebe zu testen, ist es möglich, physiologische Gewebeinteraktionen während der Gelenkartikulation nachzuahmen, um die Rolle der Kontaktscherspannung auf die Synoviozytenfunktion und ihren Beitrag zum Übersprechen zwischen Synovia und Knorpel aufzuklären. Letzteres wurde mit der Vermittlung von Synovialgelenksentzündungen bei Arthritis und Post-Verletzungen in Verbindung gebracht. Aufgrund der physikalischen Nähe von Knorpel zu Synovium und Synovialflüssigkeit, die Synoviozyten enthalten, die eine multipotente Kapazität aufweisen, einschließlich Chondrogenese, wird postuliert, dass Synoviozyten eine Rolle bei der Knorpelhomöostase und -reparatur spielen, indem sie auf die Gelenkoberfläche gepfropft werden. In diesem Zusammenhang kann der physische Kontakt und die gegenseitige Scherung von Knorpel-Synovium und Synovium-Synovium die Zugänglichkeit von Synoviozyten zu Regionen mit Knorpelschädenerhöhen 37,38,39,40. Studien, die Synovium-auf-Knorpel-Konfigurationen verwenden, werden nicht nur Einblicke in die Mechanik und Tribologie des groben Gewebes der Gelenke liefern, sondern auch zu neuen Strategien zur Erhaltung der Gelenkgesundheit führen.

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Protokoll

Für die vorliegende Studie wurden juvenile Kniegelenke von Rindern verwendet, die aus einem lokalen Schlachthof gewonnen wurden. Studien mit solchen Rinderproben sind vom Columbia Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ausgenommen.

1. Auslegung der Reibungsprüfeinrichtung

HINWEIS: Eine schematische Darstellung des Reibungsprüfgeräts ist in Abbildung 1 dargestellt. Das Gerät ist auf einer starren Grundplatte (nicht abgebildet) aufgebaut, die als Plattform für die strukturelle Unterstützung dient.

  1. Befestigen Sie einen Schrittmotor an der horizontalen Übersetzungsstufe (siehe Materialtabelle), wodurch eine zweiachsige Reibungsprüfvorrichtung entsteht, die eine reziproke Übersetzungsbewegung an berührende Oberflächen liefert.
  2. Montieren Sie eine mehrachsige Wägezelle auf der Translationsstufe (siehe Materialtabelle). Die montierte Wägezelle wird verwendet, um die normale Last in z-Richtung (F n) und die tangentiale Last in x-Richtung (Ft) zu messen.
  3. Statten Sie die Übersetzungsstufe mit einem linearen Encoder aus (siehe Materialtabelle), um die horizontale Verschiebung (ux) der Stufe aufzuzeichnen. Statten Sie außerdem die Ladestufe mit einem Linearencoder aus (siehe Materialtabelle), um die vertikale Verschiebung (uz) der Platte aufzuzeichnen.
    HINWEIS: Der Translationsstufen-Encoder zeichnet die relative tangentiale Verschiebung der Kontaktflächen auf, und diese Informationen werden verwendet, um den Beginn jedes neuen Zyklus des hin- und hergehenden Gleitens zu erkennen.
  4. Konfigurieren Sie die Ladeplatte (obere Kontaktfläche) als Glas-, Knorpel- oder Synovium-Gegenfläche. Verbinden Sie die Platte über eine Gewindestange mit der Ladestufe.
  5. Befestigen Sie eine zweiteilige magnetische Basis an der Oberseite der Wägezelle (siehe Materialtabelle): (1) eine feste Basis, die dauerhaft an der Wägezelle befestigt ist, und (2) eine abnehmbare Basis, die magnetisch mit der festen Basis verbunden ist. Stellen Sie sicher, dass die beiden Teile eine enge Verbindung bilden.
    HINWEIS: Die abnehmbare Basis hält die übersetzende Gegenfläche (untere Kontaktfläche).
  6. Verschreiben Sie eine normale Belastung. Verwenden Sie Eigengewicht, das auf Linearlagern über der Ladeplatte und der Stützstange montiert ist. Alternativ können Sie eine Last mit dem Schwingspulenaktor angeben (siehe Materialtabelle), der die untere Kontaktfläche41 dynamisch belasten kann.
  7. Unterbringen Sie das Gerät in einem Aluminiumgehäuse aus Acryl (siehe Materialtabelle), um seine Umgebung vor Kontamination zu schützen.
    HINWEIS: Ein benutzerdefiniertes LabVIEW-Programm steuert das Gerät (siehe Ergänzende Codierungsdateien) mit Benutzersteuerung der Dauer jedes Tests sowie des Etappenwegs, der Beschleunigung (Richtungsänderung) und der Geschwindigkeit. Die Normalkraft, Tangentialkraft, Bühnenverschiebung und Kriechverschiebung werden während des gesamten Tests mit Datenerfassungshardware und -software überwacht (siehe Materialtabelle).

2. Probenvorbereitung und Montage

  1. Bereiten Sie sich auf eine sterile Gewebeernte vor, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
    HINWEIS: Wenn eine sterile Ernte nicht gewünscht ist, fahren Sie mit Schritt 2.2 fort.
    1. Sterilisieren Sie Metallwerkzeuge in einem Autoklaven. Besprühen Sie Fugenhalter mit 70% Ethanol und legen Sie sie in die biologische Sicherheitswerkbank (BSC). Schließen Sie das Gehäuse für einen UV-Zyklus (UV).
    2. Rufen Sie die Werkzeuge aus dem Autoklaven ab. Legen Sie die Werkzeuge, Betadin, sterile Skalpellklingen und Bechergläser mit 70% Ethanol in das BSC.
    3. Öffnen Sie die Werkzeuge im Inneren des BSC und legen Sie sie in 70% Ethanolbecher. Befestigen Sie die Skalpellklingen an Skalpellgriffen.
    4. Bereiten Sie den Joint für die Ernte vor. Besprühen Sie die Außenseite der Verbindung mit 70% Ethanol und wickeln Sie sie 30 min in Aluminiumfolie ein. Achten Sie darauf, die Gelenkkapsel nicht zu brechen.
      HINWEIS: Die juvenilen Rinderkniegelenke wurden mit dem Femur und der Tibia aufgenommen, die etwa 15 cm höher und niedriger als das Gelenk geschnitten wurden, um eine intakte Kapsel zu gewährleisten.
    5. Nach 30 min die umwickelte Fuge in den BSC legen. Öffnen Sie die Folie und befestigen Sie die Fuge an ihrem Halter. Bedecken Sie das Gelenk mit Betadin, indem Sie das Betadin vorsichtig über die Gelenkoberfläche wischen.
      HINWEIS: In den Schritten 2.2 und 2.3 finden Sie synoviumspezifische Anweisungen bzw. knorpelspezifische Anweisungen.
  2. Ernten Sie die juvenile Rindersynovia mit den folgenden Schritten.
    1. Befestigen Sie die tibiofemorale Gelenkkapsel mit einem Ringständer (siehe Materialtabelle) mit der Vorderseite, die dem Dissektor zugewandt ist. Durchtrennen Sie die Patellasehne mit einer Pinzette und einer Skalpellklinge mit einem horizontalen Schnitt von 5-10 cm (abhängig von der Gelenkgröße), der der Tibia überlegen ist (Abbildung 2A).
    2. Halten Sie die abgelöste Patellasehne mit einer Pinzette. Nehmen Sie zwei vordere bis hintere Schnitte in Form eines V vor (Abbildung 2B,C). Diese Schnitte sollten die Patella befreien.
      HINWEIS: Wenn sich das Gelenk zu öffnen beginnt, achten Sie darauf, das vordere Kreuzband (ACL), das hintere Kreuzband (PCL), das mediale Kollateralband (MCL), das laterale Kollateralband (LCL) und den Meniskus nicht zu durchtrennen.
    3. Drehen Sie die Patella hinter dem Gelenk oder entfernen Sie sie vollständig aus dem Gelenk. Entfernen Sie vorsichtig das Gewebe, das oberflächlich zur Synovialmembran auf der medialen und lateralen Seite des Gelenks ist, um die Synovia freizulegen.
    4. Zeichnen Sie mit einer Skalpellklinge die Umrisse der interessierenden Synoviumregion nach. Greifen Sie mit einer Pinzette ein Ende der Synovia und heben Sie sie vorsichtig an, um die Synovia distal bis zum darunter liegenden Knochen zu dehnen. Verwenden Sie eine Skalpellklinge, um die Synovia aus dem Knochen zu entfernen (Abbildung 2D, E).
    5. Legen Sie das Gewebe in geeignete Nährmedien oder Testbadlösung. Das Synoviumexplantat kann für ein gewünschtes Experiment kultiviert oder montiert und für Tests verwendet werden.
      HINWEIS: Lösungen für Kulturmedien / Testbäder können je nach Präferenz einer Forschungsgruppe variieren. Für die für die vorliegende Studie verwendeten Sonderanfertigungen siehe Materialtabelle.
  3. Ernten Sie den juvenilen Rinderknorpel (Oberschenkelpfropfen und Tibiastreifen).
    1. Trennen Sie den Femur von der Tibia, indem Sie ACL, PCL, MCL und LCL durchtrennen. Achten Sie darauf, den Oberschenkelkondylulknorpel nicht zu schneiden oder durch den Meniskus zum Tibiaplateau zu schneiden. Legen Sie die getrennten Gewebe zur Dissektion in ihre jeweiligen Halter (Schritt 2.3.2 für Femur und Schritt 2.3.3 für Tibia).
    2. Sichern Sie den Oberschenkelknochen mit einem Ringständer. Fahren Sie das Instrument mit einem Biopsiestempel der gewünschten Form und Größe senkrecht zur Gelenkknorpeloberfläche des Oberschenkels, bis Sie den Knochen erreichen (Abbildung 3A).
      1. Lösen Sie die Verbindung des Steckers mit dem Knochen, indem Sie den Schlag von links nach rechts und von vorne nach hinten bewegen. Tun Sie dies, ohne den Stempel zu entfernen.
        HINWEIS: Knisternde Geräusche können zu hören sein, wenn sich der Knochen vom Knorpel trennt.
      2. Entfernen Sie den Stempel und damit den Stecker aus dem darunter liegenden Knochen (Abbildung 3B). Wiederholen Sie bei Bedarf die Schritte 2.3.2, 2.3.2.1 und 2.3.2.2 für die verbleibenden unberührten Stellen auf dem Kondylus.
        HINWEIS: In Vorbereitung auf die Montage des Oberschenkelstopfens auf einer Testbasis muss die tiefe Seite des Steckers möglicherweise flach rasiert werden. Dies kann mit einem Kistenschneider oder Skalpell erfolgen.
      3. Legen Sie das Gewebe in geeignete Nährmedien oder Testbadlösung. Der Femurpfropfen kann für ein gewünschtes Experiment kultiviert oder montiert und zum Testen verwendet werden.
    3. Befestigen Sie die Tibia in einer verstellbaren Halterung (siehe Materialtabelle). Entfernen Sie den Meniskus vorsichtig und vermeiden Sie dabei den Kontakt mit der Knorpeloberfläche (Abbildung 4A).
      1. An den äußeren Rändern des Tibiaplateaus schneiden Sie mit einem Kistenschneider senkrecht zum Knorpel in Richtung Knochen. Schneiden Sie den Knorpel vollständig durch, um gerade Kanten/Seiten zu erzielen (Abbildung 4B). Beginnen Sie den Schnitt etwa 2 mm von jeder Tibiaplateaukante entfernt und entfernen Sie überschüssiges Gewebe. Bewerten Sie die Innenkanten des Knorpels (Abbildung 4C).
        HINWEIS: An dieser Stelle muss der Knochen unter dem Knorpel an den äußeren Rändern des Tibiaplateaus sichtbar sein.
      2. Verwenden Sie an den Außenkanten den Kistenschneider, um an der Grenzfläche zwischen Knochen und Knorpel einen sauberen Schnitt zu machen (Abbildung 4D).
        HINWEIS: Der Schnitt muss parallel zur Knorpeloberfläche und ca. 5 mm nach innen erfolgen, tief genug, um Knorpel und Knochen zu trennen.
      3. Um den Tibiastreifen von der Plateaufläche zu entfernen, setzen Sie vorsichtig einen Flachkopfschraubendreher unter den Schnitt in Schritt 2.3.3.2 ein. Drehen Sie den Schraubendreher vorsichtig, um den Gelenkknorpel aus dem subchondralen Knochen zu lösen (Abbildung 4E).
        HINWEIS: Knisternde Geräusche können zu hören sein, wenn sich der Knochen vom Knorpel trennt.
      4. Wenn sich die Probe löst, drücken Sie den Schraubendreher langsam nach vorne, bis sich der Knorpelstreifen vom Knochen löst. Drücken Sie den Schraubenzieher in Richtung Knochen, nicht in Richtung Knorpel. Wiederholen Sie diesen Vorgang an mehreren Stellen, bis der Tibiaplateau-Gelenkknorpel vollständig aus dem darunter liegenden Knochen entfernt ist (Abbildung 4F).
      5. Schneiden Sie mit einem Kistenschneider die Tibiaplateauoberfläche, um rechteckige Proben der gewünschten Größe und Dicke herzustellen.
        HINWEIS: Für die vorliegende Studie wurden 10 mm x 30 mm große Streifen geschnitten, aber diese Abmessungen können je nach gewünschtem Experiment und Testaufbau variiert werden.
      6. Legen Sie das Gewebe in geeignete Nährmedien oder Testbadlösung. Der Tibiastreifen kann für ein gewünschtes Experiment kultiviert oder montiert und zum Testen verwendet werden.
      7. Falls erforderlich, wiederholen Sie die Schritte 2.3.3.1-2.3.3.6 für das zweite Tibiaplateau.
  4. Montieren Sie die Synovia und den Knorpel mit den folgenden Schritten.
    1. Wählen Sie bei Bedarf eine Tibiastreifenprobe zum Testen aus.
      HINWEIS: Der Streifen kann als untere Gegenfläche getestet werden.
      1. Entfernen Sie die abnehmbare Magnetbasis (siehe Materialtabelle) und kleben Sie eine Petrischale mit einem Durchmesser von 60 mm auf die obere Oberfläche der abnehmbaren Basis.
      2. Wenn die Petrischale eingeklebt ist, befestigen Sie die abnehmbare Basis an der festen Basis und markieren Sie die Petrischale, um eine Gleitrichtung anzuzeigen.
      3. Tragen Sie eine kleine Menge Cyanacrylat (siehe Materialtabelle) auf die Mitte der Schale auf. Richten Sie den Tibiastreifen an der Gleitrichtung der Stufe aus (wie durch die Markierung auf der Petrischale von 2.4.1.2 angezeigt). Drücken Sie den Knorpelstreifen vorsichtig auf die Schale. Achten Sie darauf, die Knorpeloberfläche nicht zu zerkratzen.
        HINWEIS: Ein Saugwerkzeug (siehe Materialtabelle) kann sanften Druck auf den Knorpel ausüben, ohne die zu prüfende Oberfläche zu beschädigen.
      4. Stellen Sie die abnehmbare magnetische Basis (mit angebrachtem Knorpelstreifen) auf ihrer gepaarten magnetischen festen Basis im Reibungstester wieder her. Füllen Sie die Petrischale mit der gewünschten Testbadlösung. Die Testbadlösung muss den Knorpel vollständig abdecken.
    2. Wählen Sie auf Wunsch einen Femurknorpelstopfen zum Testen aus.
      HINWEIS: Der Stecker kann als untere oder obere Gegenseite getestet werden.
      1. Wenn der Femurkondylus als untere Gegenfläche verwendet wird, entfernen Sie die abnehmbare Magnetbasis und kleben Sie eine Petrischale mit einem Durchmesser von 60 mm auf die obere Oberfläche der abnehmbaren Basis.
        1. Tragen Sie eine kleine Menge Cyanacrylat auf die Mitte des Gerichts auf. Drücken Sie den Knorpelstopfen vorsichtig auf die Schale.
          HINWEIS: Ein Saugwerkzeug kann sanften Druck auf den Knorpel ausüben, ohne die zu prüfende Oberfläche zu beschädigen.
        2. Stellen Sie die abnehmbare Magnetbasis (mit angebrachtem Knorpelstecker) auf ihrer gepaarten magnetischen festen Basis im Reibungsprüfgerät wieder her. Füllen Sie die Petrischale mit der gewünschten Testbadlösung. Die Testbadlösung muss den Knorpel vollständig abdecken.
      2. Wenn der Oberschenkelknorpel als obere Gegenfläche verwendet wird, entfernen Sie die Ladeplatte und die Stützstange aus dem Reibprüfgerät. Entfernen Sie ggf. die vorhandene Platte und wählen Sie eine neue Platte, die für die Knorpelmontage geeignet ist.
        1. Tragen Sie eine kleine Menge Cyanacrylat auf die Plattenoberfläche auf. Drücken Sie den Knorpelstopfen vorsichtig auf die Platte.
          HINWEIS: Ein Saugwerkzeug kann sanften Druck auf den Knorpel ausüben, ohne die zu prüfende Oberfläche zu beschädigen.
        2. Stellen Sie die Ladeplatte (mit aufgesetztem Knorpelstopfen) und die Stützstange wieder zum Reibprüfgerät wieder her. Stellen Sie die vertikale Höhe der Ladeplatte so ein, dass der Knorpelstopfen über der unteren Gegenfläche schwebt und in das Testbad eingetaucht wird. Fügen Sie bei Bedarf weitere Testbadlösungen hinzu.
    3. Wählen Sie bei Bedarf die zu testende Synoviumprobe aus.
      HINWEIS: Die Synovia kann als untere oder obere Gegenfläche getestet werden.
      1. Wenn die Synovia als untere Gegenfläche verwendet wird, entfernen Sie die abnehmbare Magnetbasis und kleben Sie eine Petrischale mit einem Durchmesser von 60 mm auf die obere Oberfläche der abnehmbaren Basis.
        1. Kleben Sie einen speziell bearbeiteten kreisförmigen Acryl-Silikon-Pfahl des gewünschten Durchmessers in die Mitte der Schale.
        2. Legen Sie die Synovia mit einer Pinzette auf den Pfosten. Um die Synovia zu sichern, verteilen Sie einen O-Ring (siehe Materialtabelle) über ihren Umfang.
        3. Ziehen Sie mit einer Pinzette vorsichtig an der Synovia, um das gelehrte und flache Gewebe unter dem O-Ring zu dehnen. Schneiden Sie überschüssiges Gewebe mit einer chirurgischen Schere ab.
        4. Stellen Sie die abnehmbare magnetische Basis (mit Synovium befestigt) auf ihrer gepaarten magnetischen festen Basis im Reibungstester wieder her. Füllen Sie die Petrischale mit der gewünschten Testbadlösung. Die Testbadlösung muss das Synovium vollständig abdecken.
      2. Wenn die Synovia als obere Gegenfläche verwendet wird, entfernen Sie die Ladeplatte und die Stützstange aus dem Reibprüfgerät. Entfernen Sie bei Bedarf die vorhandene Platte und wählen Sie eine neue kreisförmige Platte, die für die Synoviummontage geeignet ist.
        1. Legen Sie die Synovia mit einer Pinzette auf die kreisförmige Platte. Um die Synovia zu sichern, breiten Sie einen O-Ring über ihren Umfang aus.
        2. Ziehen Sie mit einer Pinzette vorsichtig an der Synovia, um das gelehrte und flache Gewebe unter dem O-Ring zu dehnen. Schneiden Sie überschüssiges Gewebe mit einer chirurgischen Schere ab.
        3. Stellen Sie die Ladeplatte (mit aufgesetztem Synovium) und die Stützstange wieder auf den Reibprüfer auf. Stellen Sie die vertikale Höhe der Ladeplatte so ein, dass die Synovia über der unteren Gegenfläche schwebt und in das Testbad eingetaucht wird. Fügen Sie bei Bedarf weitere Testbadlösungen hinzu.

3. Reibungsprüfung

HINWEIS: Für diese Tests werden ein benutzerdefiniertes LabVIEW-Programm und zugehörige Hardware (siehe Ergänzende Codierungsdateien) verwendet. Bitte beachten Sie, dass der benutzerdefinierte Code auf LabVIEW 2010 basiert und auf derselben Legacy-Version beibehalten wurde. Infolgedessen ist der Code möglicherweise nicht mit der neuesten Version der Software kompatibel. Die folgenden Schaltflächenausschläge und Verweise auf die Benutzeroberfläche sind nur für den benutzerdefinierten Code relevant. Wenn Sie mit einer anderen Softwareversion arbeiten, kann ein ähnliches benutzerdefiniertes Programm geschrieben werden, indem der Code geändert wird.

  1. Die montierten Proben (Schritt 2.4) werden in die Reibprüfvorrichtung eingesetzt.
    HINWEIS: Die Proben müssen in die Prüfbadlösung eingetaucht werden, dürfen jedoch nicht miteinander in Berührung kommen.
  2. Öffnen Sie das Softwareprogramm, und legen Sie Testparameter fest: Stufengeschwindigkeit, Stufenbeschleunigung, Verfahrweg (Strecke) und Testdauer (Abbildung 5).
    1. Öffnen Sie die drei Fenster im Programm: Analog Data Build MFDAQ, Initialize Load PID und Trigger Dynamic Caller.
    2. Führen Sie das MFDAQ-Fenster Analog Data Build aus, indem Sie auf die Schaltfläche Ausführen (weißer Pfeil) klicken.
    3. Führen Sie das Fenster Initialize Load PID aus, indem Sie auf die Schaltfläche Ausführen (weißer Pfeil) klicken.
    4. Navigieren Sie im Fenster Dynamischer Anrufer auslösen zur Registerkarte Stepper. Geben Sie die Beschleunigung, Geschwindigkeit und Entfernung der Übersetzungsphase in den Benutzereingabefeldern an.
      HINWEIS: Der Entfernungswert legt die halbe Länge der Verschleißspur fest. Mit anderen Worten, die Bühne bewegt sich von der angegebenen Nullposition (Schritt 3.5) zum eingestellten Entfernungswert sowohl in positiver als auch in negativer x-Richtung.
    5. Geben Sie auf der Registerkarte Stepper die Testdauer an, indem Sie den Dateipfad Stepper Time Index auswählen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ordner öffnen unten rechts in der Zeitzustandstabelle und wählen Sie die Datei aus.
    6. Geben Sie die Testdauer auch auf der Registerkarte Sprachspule an. Navigieren Sie im Fenster Dynamischer Anrufer auslösen zur Registerkarte Sprachspule. Ähnlich wie in Schritt 3.2.5 wählen Sie den Dateipfad des Voice Coil Index aus, indem Sie unten rechts in der Tabelle Zeitstatus auf die Schaltfläche Ordner öffnen klicken und die Datei auswählen. Die Dauer muss mit der der Registerkarte Stepper übereinstimmen.
  3. Verschreiben Sie die normale Belastung. Wenn Sie Eigengewichte verwenden, platzieren Sie die gewünschten Gewichte auf den Linearlagern über der Ladeplatte. Stellen Sie sicher, dass die aufgebrachte Last plus das Gewicht der Ladeplatte und der Stützstange die Wägezellen-Nennkapazität nicht überschreiten.
  4. Wählen Sie den Pfad und den Dateinamen für die Datenspeicherung mithilfe der Schaltfläche Ordner öffnen rechts neben dem Feld In Datei schreiben? aus. Speichern Sie die Datei mit der Erweiterung ".txt".
  5. Zentrieren Sie die untere Gegenfläche unter der oberen Gegenfläche. Legen Sie dies als Null-x-Position fest.
    1. Führen Sie das Fenster Dynamischer Anrufer auslösen aus, indem Sie auf die Schaltfläche Ausführen (weißer Pfeil) klicken. Klicken Sie auf der Registerkarte Stepper auf die Schaltfläche Home , um die Bühne in die zuletzt gespeicherte Null-x-Position zu verschieben.
    2. Wenn die Gegenflächen nicht ausgerichtet sind, verschieben Sie die Bühne, indem Sie auf die grünen Pfeiltasten links und rechts klicken. Wenn die gewünschte Position erreicht ist, klicken Sie auf die Schaltfläche Null, um die aktuelle Bühnenposition als neue Null-x-Position zu speichern. Stoppen Sie das Fenster Dynamischer Anrufer auslösen, indem Sie auf die Schaltfläche Stopp klicken.
      HINWEIS: Die Position der Bühne kann nur gespeichert werden, während das Fenster Dynamischer Aufrufer auslösen ausgeführt wird, aber die Bühne bewegt sich noch nicht wie vom Programm angegeben. Durch Drücken der Schaltfläche Ausführen (weißer Pfeil) in Schritt 3.5.1 wird ein Zeitrahmen von 15 s ausgelöst, bevor sich die Bühne zu bewegen beginnt. Verwenden Sie diesen Zeitrahmen von 15 s, um die Bühne zu verschieben und die gewünschte Nullposition zu speichern.
    3. Wenn die gewünschte Null-x-Position beim ersten Versuch nicht erreicht wird, wiederholen Sie Schritt 3.5.1.
      HINWEIS: Es kann hilfreich sein, die Nulltaste zeitweise zu drücken, um die Bühnenposition zu speichern, während der Benutzer die untere Gegenfläche unter die obere Gegenfläche bewegt. Denken Sie daran, dass durch Klicken auf die Home-Taste die Bühne an die letzte Position verschoben wird, die von der Schaltfläche Null gespeichert wurde.
  6. Sobald die oberen und unteren Gegenflächen zentriert sind, leiten Sie die Reibungsprüfung der Proben ein, indem Sie die zyklische Bewegung der Stufe starten. Führen Sie dazu das Fenster Dynamischer Anrufer auslösen aus, indem Sie auf die Schaltfläche Ausführen (weißer Pfeil) klicken.
  7. Sobald sich die Bühne bewegt, bringen Sie die obere Gegenfläche langsam in Kontakt mit der unteren.
    HINWEIS: Der angewendete Lastwert kann durch Anzeigen des F z-Echtzeitplots im Softwarefenster bestätigt werden (Abbildung 5A).
  8. Lassen Sie den Test laufen, indem Sie die Daten zum Reibungstest sammeln.
    HINWEIS: Alle Daten, die während Schritt 3.5 aufgezeichnet wurden, werden überschrieben. Die Echtzeithysterese kann im Fenster Dynamischer Anrufer auslösen angezeigt werden (Abbildung 5C).
  9. Nach der gewünschten Testdauer stoppen Sie den Test, indem Sie die Stopp-Taste drücken und die Proben entladen, indem Sie die obere Gegenfläche anheben und aus dem Kontakt mit der unteren Gegenfläche bewegen.

4. Datenverarbeitung

HINWEIS: Für die Datenverarbeitung wird ein benutzerdefiniertes MATLAB-Programm verwendet (siehe Ergänzende Codierungsdateien). Der Code ruft die Ausgabedateien auf, die durch den benutzerdefinierten LabVIEW-Code angegeben werden.

  1. Verwenden Sie den benutzerdefinierten Code, um den Reibungskoeffizienten und die Kriechverschiebung (zeitabhängige Gewebeverformung) pro Zyklus zu berechnen.
    1. Stellen Sie sicher, dass alle relevanten Codes im selben Ordner gespeichert sind: "frictioncycle_fun.m", "frictioncycle_Hysteresis_plot.m", "frictioncycle_MU_plot.m" und "frictioncycle_run.m".
      HINWEIS: Diese MATLAB-Codes wurden für die Verwendung mit den spezifischen Ausgaben des oben genannten LabVIEW-Codes geschrieben. Wenn der Benutzer seinen eigenen Code erstellt oder Änderungen an dem hier beschriebenen Code vorgenommen hat, müssen die MATLAB-Skripts möglicherweise bearbeitet werden, um diese Änderungen zu berücksichtigen.
    2. Öffnen Sie die Datei frictioncycle_run.m. Klicken Sie im Skript auf die Schaltfläche Ausführen (grüner Pfeil). Wählen Sie die zu analysierende Rohdatendatei und den gewünschten Speicherort für die MATLAB-Ausgabe aus.
      HINWEIS: Die Software kann je nach Testdauer einige Minuten benötigen, um Daten zu verarbeiten.
  2. Führen Sie auf Wunsch Standardgewebeuntersuchungen und Medienanalysen an den getesteten Explantaten und Aliquots der Testbadlösung durch.

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Ergebnisse

Eine Synovium-auf-Knorpel-Konfiguration wurde verwendet, um juvenile Rinderexplantationen zu reiben. Die Synovia wurde auf einer Acryl-Ladeplatte mit einem Durchmesser von 10 mm montiert, so dass die Innenschicht mit dem darunter liegenden Knorpel in Kontakt kam. Als Knorpel-Gegenfläche wurde ein Tibiastreifen verwendet (Abbildung 6A). Tibialstreifen wurden mit einer Tiefe von ca. 1,4 mm und einer Größe von 10 mm x 30 mm geschnitten. Die Proben wurden 1 h bei 37 °C in einem phosphatgepuf...

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Diskussion

Innerhalb des Gelenks besteht eine dynamisch-mechanische Umgebung, da Knorpel Druck-, Zug- und Scherkräften sowie hydrostatischen und osmotischen Drücken ausgesetzt ist44,45. Obwohl Knorpel das wichtigste tragende Gewebe des Gelenks ist, erfährt die Synovia auch Reibungswechselwirkungen mit der Knorpeloberfläche und mit sich selbst in Regionen, in denen sich das Gewebe faltet. Die physikalischen Wechselwirkungen zwischen Knorpel und Synovium sind wahrscheinli...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der Orthopaedic Scientific Research Foundation, NIH 5R01 AR068133, NIH TERC 5P41EB027062 und NIGMS R01 692 GM083925 (Funder ID: 10.13039/100000057) unterstützt.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Aluminum foilReynolds Group HoldingsReynolds WrapSterile tissue harvest
Aluminum-framed acrylic enclosureCustom madeFriction tester component
Autoclavable instant sealing sterilization pouchesFisherbrand01-812-54Sterilization of tools
AutoclaveBuxtonSterilization of tools
Beaker (250 mL)Pyrex Vista70000Tissue harvest
Betadine (Povidone Iodine Prep Solution)Medline Industries, LPMDS093906Sterile tissue harvest
Biological safety cabinetLabconcoPurifier Logic+ Class II, Type A2 BSCSterile tissue harvest
Biospy punchSteritool Inc.50162Tissue harvest
Box cutterAmerican Safety Razor Company94-120-71Tissue harvest
Circular acrylic-sillicone post (synovium)Custom madeTissue mounting
Culture mediaCustom madeDMEM (Cat No. 11-965-118; Gibco) supplemented with 50 μg/mL L-proline (Cat. No. P5607; Sigma), 100 μg/mL sodium pyruvate (Cat. No. S8636; Sigma), 1% ITS (Cat. No. 354350; Corning), and 1% antibiotic–antimycotic (Cat. No. 15-240-062, Gibco)
Cyanoacrylate (Loctite 420 Clear)Henkel135455Tissue mounting
Dead weightsOHAUSNormal load
Ethanol 200 proofDecon Labs, Inc.2701Dilute to 70 %
Fixed baseThorLabs, Inc.SB1TFriction tester component
Forceps (synovium harvest)Fine Science Tools11019-12Tissue harvest
Forceps (synovium mounting)Excelta3C-S-PITissue mounting
Horizontal linear encoder (for translating stage)RSF Electronics, Inc.MSA 670.63Friction tester component; system resolution of 1 µm
Hot glue gun and glueFPC CorporationSurebonder Pro 4000ATissue mounting
LabVIEWNational Instruments CorporationLabVIEW  2010Friction testing program
Load cellJR3 Inc.20E12A-M25BFriction tester component; 0.0019 lbs resolution in x&y, 0.0038 lbs resolution in z
Loading platenCustom madeTissue mounting
O-ringParkerS1138AS568-009Tissue mounting
Petri dish (60 mm)Falcon351007Tissue mounting
PivotLok Work Positioner (tibia holder)Industry Depot, Pivot LokPL325Tissue harvest
Removable baseThorLabs, Inc.SB1BFriction tester component
Ring standTissue harvest
Scalpel bladesHavel's Inc.FSC22Tissue harvest
Scalpel handleFEATHER Safety Razor Co., Ltd.No. 4Tissue harvest
ScrewdriverWera3334Tissue harvest
StageJMARFriction tester component
Stepper motorOriental Motor Co., Ltd.PK266-03BFriction tester component
Suction toolVirtual Industries, Inc.PEN-VAC Vacuum PenTissue mounting
Support rodCustom madeTissue mounting
Surgical scissorsFine Science Tools14061-09Tissue mounting
Synovial fluid (bovine)Animal Technologies, Inc.Friction testing bath
Testing bathCustom madePhosphate-Buffered Saline (PBS) with protease inhibitors: 0.04% isothiazolone-base biocide (Proclin 950 Cat. No. 46878-U; Sigma) and 0.1% protease inhibitor - 0.05 M ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA (Cat. No. 0369; Sigma)
Tissue culture incubatorFisher ScientificIsotempSterile culture
Vertical linear encoder (for loading stage)RenishawT1031-30AFriction tester component; 20 nm resolution
Voice coil actuatorH2W TechnologiesNCC20-15-027-1RCFriction tester component

Referenzen

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