Nicht-invasive PET/MR-Bildgebung in einem orthotopen Mausmodell des hepatozellulären Karzinoms

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Erstellung orthotoper hepatozellulärer Karzinom-Xenotransplantate mit und ohne Leberarterienligatur vor und führen eine nicht-invasive Positronen-Emissions-Tomographie (PET)-Bildgebung der Tumorhypoxie unter Verwendung von [18 F]Fluoromisonidazol ([18 F]FMISO) und [18 F]Fluordesoxyglucose ([¹⁸F]FDG) durch.

Zusammenfassung

Präklinische experimentelle Modelle des hepatozellulären Karzinoms (HCC), die menschliche Erkrankungen rekapitulieren, stellen ein wichtiges Werkzeug dar, um die Tumorgenese zu untersuchen und neue Therapieansätze zu evaluieren. Die nicht-invasive Ganzkörperbildgebung mittels Positronen-Emissions-Tomographie (PET) liefert in Echtzeit entscheidende Einblicke in die In-vivo-Eigenschaften von Geweben auf molekularer Ebene. Wir präsentieren hier ein Protokoll für die orthotope HCC-Xenotransplantat-Erstellung mit und ohne hepatische Arterienligatur (HAL) zur Induktion von Tumorhypoxie und die Beurteilung ihres Tumorstoffwechsels in vivo unter Verwendung von [18 F]Fluoromisonidazol ([18 F]FMISO) und [18 F]Fluordesoxyglucose ([¹⁸F]FDG) PET/Magnetresonanz (MR) Bildgebung. Die Tumorhypoxie konnte mit dem Hypoxiemarker [18 F]FMISO leicht sichtbar gemacht werden, und es wurde festgestellt, dass die [18 F]FMISO-Aufnahme bei HCC-Mäusen, die HAL unterzogen wurden, höher war als in der Nicht-HAL-Gruppe, während [¹⁸F]FDG die Tumorhypoxie zwischen den beiden Gruppen nicht unterscheiden konnte. HAL-Tumoren zeigten auch eine höhere Expression des Hypoxie-induzierbaren Faktors (HIF)-1α als Reaktion auf Hypoxie. Die Quantifizierung von HAL-Tumoren zeigte einen 2,3-fachen Anstieg der [¹⁸F]FMISO-Aufnahme basierend auf dem Ansatz der standardisierten Wertaufnahme (SUV).

Einleitung

Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist mit mehr als 900.000 neuen Fällen und 800.000 Todesfällen im Jahr 2020 die sechsthäufigste Krebserkrankung und die dritthäufigste Todesursache durch Krebs weltweit¹. Der Hauptrisikofaktor ist die Leberzirrhose, die als Folge von Virusinfektionen (Hepatitis B- und C-Viren), Alkoholmissbrauch, Diabetes und nichtalkoholischer Steatohepatitis² auftritt. Die Behandlung von HCC ist ziemlich komplex, und es stehen verschiedene Behandlungsoptionen zur Verfügung, darunter chirurgische Resektion, thermische oder chemische Ablation, Transplantation, transarterielle Chemoembolisation, Bestrahlung und Chemotherapie, abhängig vom Krankheitsstadium ^2,3. HCC ist ein Chemotherapie-refraktärer Tumor mit einem Wiederauftreten der Erkrankung bei bis zu 70% der Patienten nach kurativer Therapie².

Trotz des hohen Grades an Tumorheterogenität ist HCC mit zwei gemeinsamen Endpunkten assoziiert: (i) HCC ist sehr hypoxisch und (ii) Tumorhypoxie ist mit größerer Tumoraggressivität und Behandlungsversagen verbunden. Die unkontrollierte Proliferation von HCC-Zellen führt zu einer hohen Sauerstoffverbrauchsrate, die der Vaskularisierung vorausgeht, wodurch eine hypoxische Mikroumgebung entsteht. Niedrige intratumorale Sauerstoffwerte lösen dann eine Reihe von biologischen Reaktionen aus, die die Aggressivität des Tumors und das Ansprechen auf die Behandlung beeinflussen. Hypoxie-induzierbare Faktoren (HIFs) werden oft als die wesentlichen Transkriptionsregulatoren bei der Reaktion auf Hypoxie^{anerkannt 2,3}. Daher ist die Fähigkeit, Hypoxie zu erkennen, von entscheidender Bedeutung, um neoplastisches Gewebe sichtbar zu machen und die unzugänglichen Stellen zu identifizieren, die invasive Verfahren erfordern. Es hilft auch, die molekularen Veränderungen, die zur Aggressivität des Tumors führen, besser zu verstehen und die Behandlungsergebnisse der Patienten zu verbessern.

Die molekulare Bildgebung mittels Positronen-Emissions-Tomographie (PET) wird häufig bei der Diagnose und Stadieneinteilung vieler Krebsarten, einschließlich HCC, eingesetzt. Insbesondere die kombinierte Verwendung von Dual-Tracer-PET-Bildgebung mit [18 F]Fluordesoxyglucose ([¹⁸F]FDG) und [¹¹C]Acetat kann die Gesamtsensitivität bei der HCC-Diagnose signifikant erhöhen ^4,5. Die Bildgebung der Hypoxie kann hingegen durch die Verwendung des häufig verwendeten hypoxischen Markers [18 F]Fluoromisonidazol ([¹⁸F]FMISO) erreicht werden. In der klinischen Praxis ist die nicht-invasive Beurteilung der Hypoxie wichtig, um zwischen verschiedenen Tumorarten und Regionen für die Strahlentherapieplanung zu unterscheiden⁶.

Die präklinische Bildgebung ist zu einem unverzichtbaren Werkzeug für die nicht-invasive und longitudinale Evaluierung von Mausmodellen für verschiedene Krankheiten geworden. Ein robustes und hochreproduzierbares HCC-Modell stellt eine wichtige Plattform für die präklinische und translationale Forschung zur Pathophysiologie des humanen HCC und zur Bewertung neuartiger Therapien dar. Zusammen mit der PET-Bildgebung können In-vivo-Verhaltensweisen aufgeklärt werden, um wichtige Erkenntnisse auf molekularer Ebene für einen bestimmten Zeitpunkt zu gewinnen. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Erzeugung von orthotopen HCC-Xenotransplantaten der Leberarterienligatur (HAL) und die Analyse ihres in vivo Tumormetabolismus unter Verwendung von [18 F]FMISO und [¹⁸F]FDG PET/MR. Der Einbau von HAL ist ein geeignetes Modell für transgene oder chemisch induzierte HCC-Mäuse-Xenotransplantate, um Tumorhypoxie in vivo zu untersuchen, da HAL die arterielle Blutversorgung effektiv blockieren kann, um intratumorale Hypoxie zu induzieren ^7,8. Darüber hinaus können Veränderungen des Tumorstoffwechsels infolge von Hypoxie im Gegensatz zur immunhistochemischen Ex-vivo-Färbung mit Pimonidazol nicht-invasiv mittels PET-Bildgebung leicht visualisiert und genau quantifiziert werden, was eine longitudinale Beurteilung des Therapieansprechens oder eine Messung des Auftretens von Resistenzen ermöglicht ^3,7,8 . Unsere hier gezeigte Methode ermöglicht die Erstellung eines robusten hypoxischen HCC-Modells zusammen mit der nicht-invasiven Überwachung der Tumorhypoxie mittels PET/MR-Bildgebung, um die HCC-Biologie in vivo zu untersuchen.

Protokoll

Alle Tierstudien wurden in Übereinstimmung mit dem Ausschuss für die Verwendung lebender Tiere in Lehre und Forschung (CULATR) im Zentrum für vergleichende medizinische Forschung (CCMR) an der Universität von Hongkong durchgeführt, einem Programm, das von der Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC) akkreditiert ist. Bei den in der Studie verwendeten Tieren handelte es sich um weibliche BALB/cAnN-nu (Nacktmäuse) im Alter von 6-8 Wochen mit einem Gewicht von 20 g ± 2 g. Nahrung und Wasser wurden ad libitum zur Verfügung gestellt.

1. Subkutane Injektion von humanen hepatozellulären Karzinomzelllinien

HINWEIS: MHCC97 ist eine humane HCC-Zelllinie, die zur Erzeugung des subkutanen HCC-Xenotransplantatmodells verwendet wird. MHCC97L-Zellen werden vom Liver Cancer Institute, Zhongshan Hospital der Fudan University, Shanghai, Volksrepublik China⁹ gewonnen und durch Short Tandem Repeat (STR) Profiling authentifiziert.

1. MHCC97L-Zellen kultivieren und in Nährmedien mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin und Streptomycin in einem T-75-Zellkulturkolben bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂ (siehe Materialtabelle) aufbewahren. Wechseln Sie das Nährmedium alle 2 Tage und ernten Sie die Zellen bei 80%-90% Konfluenz.
   HINWEIS: Die Startzellennummer beträgt 1,5 x 10 6 Zellen, und die Zellen werden innerhalb von^6-8 Passagen verwendet.
2. Lagern Sie die Nährmedien und die Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (Trypsin-EDTA) bis zur Verwendung bei 4 °C im Dunkeln. Das Nährmedium wird vor Gebrauch auf 37 °C und das Trypsin-EDTA auf Raumtemperatur vorgewärmt. In der Materialtabelle finden Sie alle in diesem Abschnitt verwendeten Reagenzien und Verbrauchsmaterialien.
3. Entfernen Sie die Nährmedien. Spülen Sie die Zellschicht mit 10 ml steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS, siehe Materialtabelle).
4. 5 ml Trypsin-EDTA werden in den Kulturkolben gegeben und die Zellen bei 37 °C inkubiert. Überprüfen Sie die Zellen unter einem inversen Mikroskop bei 20-facher Vergrößerung (siehe Materialtabelle), bis die Zellschicht dispergiert und vollständig vom Kolben gelöst ist. Stellen Sie sicher, dass die Zellen nicht länger als 15 Minuten in Trypsin-EDTA verbleiben.
5. 5 ml Nährmedien in den Kulturkolben geben. Aspirieren Sie die Zellen durch vorsichtiges Pipettieren. Die Zellsuspension wird in ein Zentrifugenröhrchen überführt und 5 min lang bei 1.107 x g geschleudert (siehe Materialtabelle).
6. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig mit 1 ml PBS. Pipettieren Sie gründlich, um eine einzellige Suspension zu erhalten. Bestimmen Sie die Zellzahl mit dem automatischen Zellzähler (siehe Materialtabelle) und bereiten Sie die Zellsuspension auf eine Konzentration von 5 x 10⁶ Zellen/ml in PBS vor.
7. Ziehen Sie 200 μl Zellsuspension mit einer 25-G-Nadel in eine 1-ml-Spritze. Jede Spritze enthält 1 x 10⁶ MHCC97L-Zellen (in 200 μL). Bewahren Sie die Spritze auf nassem Eis auf.
8. Anästhesieren Sie die Maus mit einer intraperitonealen (i.p.) Injektion einer Mischung aus Ketamin (87,5 mg/kg) und Xylazin (12,5 mg/kg). Sorgen Sie für eine ordnungsgemäße Anästhesie mit dem Zehen-Pinch-Reflex. Stellen Sie sicher, dass Sie Augengleitmittel auf die Maus auftragen, um ein Austrocknen und die mögliche Bildung von Hornhautgeschwüren zu verhindern. Legen Sie die Maus in Rückenlage auf eine sterile Einlage (siehe Materialtabelle).
9. Sterilisieren Sie die dorsale Region in der Nähe der unteren Flanke (entweder links oder rechts) der Maus mit 70% Ethanol (siehe Materialtabelle). Heben Sie die Haut mit einer Pinzette an und führen Sie die Nadelfase vorsichtig unter die Haut ein.
10. Schieben Sie die Nadel 4-5 mm entlang der subkutanen Ebene von der Einstichstelle vor, um ein versehentliches Austreten der Zellsuspension von der Injektionsstelle beim Herausziehen der Nadel zu vermeiden. Achten Sie darauf, dass sich der Nadeleinstich nicht zu tief unter der Haut befindet, was zu versehentlichen Organschäden führen kann.
11. Lassen Sie die Pinzette los und entleeren Sie den Inhalt der Spritze vorsichtig und langsam, wobei Sie darauf achten müssen, nicht in die gegenüberliegende Seite einzudringen. Ziehen Sie die Nadel heraus, um zu prüfen, ob die Injektion anschwillt. Legen Sie die Maus wieder in den Käfig und setzen Sie sich auf ein vorgewärmtes Heizkissen, um die Genesung von der Narkose zu unterstützen und die Mobilität wiederzuerlangen. Überwachen Sie die Maus weiter, bis die Maus vollständig wach ist und das Brustbein beibehält.
12. Überwachen Sie wöchentlich das Tumorwachstum und das Wohlbefinden der Maus. Messen Sie das Tumorvolumen (V) mit einem Messschieber (siehe Materialtabelle). Berechnen und erfassen Sie das Tumorvolumen mit der folgenden Formel¹⁰:
    V = (B 2× L)/²
    wobei W die Breite und L die Länge des Tumors ist.
13. Überprüfen Sie zwischen 4 und 6 Wochen nach der Injektion, ob eine signifikante Größe des subkutanen Tumors zwischen 800 und 1000 mm³ erreicht wird. Stellen Sie sicher, dass die gesamte Tumorlast 10% des Körpergewichts nicht überschreitet.

2. Orthotope Leberimplantation und Leberarterienligatur

1. Bereiten Sie die folgenden chirurgischen Reagenzien und Werkzeuge in einer desinfizierten biologischen Sicherheitswerkbank vor: 10 ml Nährmedien in einer Schale, 10% Povidon-Jod-Lösung, 70% Ethanol, autoklavierte chirurgische Instrumente, d.h. scharfe Schere, Federschere, Pinzette (gebogen fein und gerade stumpf), Nadelhalter, Skalpellklinge, 6-0 und 5-0 Nylonnaht, ein Heizkissen.
2. Autoklavieren Sie alle chirurgischen Instrumente und handhaben Sie sie nur auf einer sterilen Bank. Sorgen Sie für die angemessene und notwendige prä-, intra- und postoperative Versorgung der Mäuse während der chirurgischen Eingriffe (siehe Schritte unten).
   1. Zur präoperativen Schmerzlinderung injizieren Sie der Maus mindestens 30 Minuten vor Beginn des chirurgischen Eingriffs eine subkutane Injektion von Buprenorphin (0,1 mg/kg). Injizieren Sie der Maus zur postoperativen Pflege und Behandlung 3 Tage lang ununterbrochen alle 8-12 Stunden eine subkutane Injektion von Buprenorphin (0,1 mg/kg). In der Materialtabelle finden Sie alle in diesem Abschnitt verwendeten Reagenzien und Verbrauchsmaterialien.
3. Euthanasieren Sie die subkutane tumortragende Maus mit einer i.p. Injektion von Pentobarbital (330 mg/kg). Machen Sie mit einer Skalpellklinge einen Einschnitt in die Haut der Tumorstelle. Entfernen Sie den subkutanen Tumorblock und übertragen Sie ihn sofort in das Nährmedium. Führen Sie diesen Schritt so schnell wie möglich durch.
4. Schneiden Sie den Tumorblock mit einer scharfen chirurgischen Schere in 1 mm³ kleine Tumorwürfel. Bewahren Sie alle Tumorwürfel im Nährmedium auf. Vermeiden Sie die Verwendung der Kernregion des subkutanen Tumorblocks.
5. Anästhesieren Sie die Maus, die sich der anschließenden orthotopen Tumorimplantationsoperation unterziehen wird, mit einer i.p. Injektion einer Mischung aus Ketamin (87,5 mg/kg) und Xylazin (12,5 mg/kg). Stellen Sie sicher, dass nach der Verabreichung des Buprenorphins vor der Betäubung der Maus mindestens 30 Minuten vergangen sind. Achten Sie darauf, Augengleitmittel auf die Maus aufzutragen, um ein Austrocknen und die mögliche Bildung von Hornhautgeschwüren zu vermeiden.
6. Legen Sie die Maus in Rückenlage auf ein steriles Pad, das sich auf einem vorgewärmten Heizkissen befindet. Überwachen und zeichnen Sie den physiologischen Zustand der Maus alle 15 Minuten bis zum Ende des chirurgischen Eingriffs auf.
7. Strecken Sie die Gliedmaßen der Maus aus. Befestigen Sie sie mit Klebeband, um die Freilegung des ventralen Abdomens und des Brustkorbs zu maximieren. Sterilisieren Sie die gesamte Bauchhaut der Maus mit einer 10% igen Povidon-Jod-Lösung, gefolgt von 70% Ethanol. Beurteilen Sie die Anästhesietiefe der Maus, indem Sie darauf achten, dass Sie nicht auf das Einklemmen der Zehen reagieren - den Pedalzugreflex.
8. Führen Sie eine Laparotomie durch, indem Sie mit einer scharfen Schere einen ca. 10 mm großen Mittellinienschnitt machen, um Zugang zum Peritoneum zu erhalten. Klemmen und ziehen Sie den Xiphoid-Prozess mit einer Pinzette in Richtung Kopf und wenden Sie die subkostalen Retraktoren an, um das Operationsfeld zu öffnen. Stellen Sie sicher, dass ein richtiger Schnitt gemacht wird, um eine gute chirurgische Sicht auf die Operationsstelle zu ermöglichen.
9. Ziehen Sie den Mittelstreifen und die linken Lappen mit einem feuchten Mulltupfer nach oben zurück. Bewegen Sie den Darm außerhalb des Bauches auf die linke Seite der Maus und bedecken Sie ihn mit einem feuchten Mulltupfer. Führen Sie eine Leberarterienligatur (HAL) an der Arteria hepatica communis (CHA) durch, die vom Pankreaskopf bis zu ihrer Wurzel im Leberstiel ausgeht, unter einer Lupe zur optimierten Visualisierung.
10. Ziehen Sie den Mittellappen und den linken Lappen mit einem feuchten Mulltupfer nach hinten/unten zurück, um den linken Lappen freizulegen. Machen Sie mit einer sterilen Skalpellklinge einen Schnitt von etwa 2 mm Länge und Tiefe auf der Oberfläche des linken Lappens.
    HINWEIS: Es ist auch möglich, den Medianlappen der Leber für die Tumorimplantation zu verwenden, um versehentliche Risse oder Schnittwunden durch ein Trauma benachbarter Bauchorgane zu minimieren.
11. Führen Sie sofort ein Tumorfragment mit einer sterilen Pinzette in den Leberschnitt ein. Begraben Sie den Tumor so, dass er sicher in der Leber sitzt. Legen Sie eine Achternaht mit einer 6-0-Nylonnaht über die Inzisionsstelle an, um eine ordnungsgemäße Implantation des Tumorfragments in die Leber und die Hämostase sicherzustellen. Führen Sie diesen Vorgang so schnell wie möglich durch, um übermäßige Blutungen zu vermeiden. Schließen Sie nach Abschluss den Bauchschnitt mit unterbrochenen 5-0-Nähten.
12. Legen Sie die Maus wieder in den Käfig und sitzen Sie auf einem vorgewärmten Heizkissen, um die Genesung von der Anästhesie zu unterstützen und den Aufrichtungsreflex wiederzuerlangen. Überwachen und zeichnen Sie den physiologischen Zustand der Maus alle 15 Minuten auf, bis die Maus vollständig wach ist und das Brustbein beibehält.
13. Wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Mäuse eine orthotope Tumorimplantation durchlaufen haben. Bieten Sie allen Mäusen eine postoperative Versorgung an, indem Sie ihren physiologischen Zustand in den nächsten 3 Tagen nach dem chirurgischen Eingriff täglich kontinuierlich überwachen. Geben Sie Buprenorphin (0,1 mg/kg) alle 8-12 h.

3. Einrichten von PET/MR-Kalibrierungen und Workflow

HINWEIS: Die Bildgebung wird mit einem präklinischen PET/MR 3T-System durchgeführt (siehe Materialtabelle).

1. Verwenden Sie 5% Isofluran (1 l/min medizinisches O₂), um die Maus in einer Induktionskammer zu betäuben. Legen Sie die anästhesierte Maus für jeden Scan vorsichtig auf ein Bildgebungsbett mit kontinuierlicher Erwärmung. Scannen Sie zunächst mit MR (Scout-Ansicht) als anatomische Referenz für statische [18 F]FMISO- oder [¹⁸F]FDG PET-Scans, gefolgt von einer anatomischen Referenz-MR-Bildgebung.
2. Erstellen Sie in der Software einen sequenziellen PET/MR-Bildgebungs-Workflow (siehe Materialtabelle), der einen statischen PET-Scan, eine T1-gewichtete (Abschwächungskorrektur) und T2-gewichtete (anatomische Referenz) MR-Bildgebung sowie eine PET-Rekonstruktion 1 Tag vor der geplanten Bildgebungssitzung umfasst.
3. Um PET zu erfassen, wählen Sie 400-600 keV-Niveau-Unterscheidung, F-18-Studienisotop, 1-5-Koinzidenzmodus und 20-Minuten-Scans.
4. Um eine Ganzkörper-T1-gewichtete MR zu erhalten, verwenden Sie Gradientenecho-3D mit TE = 4,3 ms, TR = 16 ms, Sichtfeld (FOV) = 90 mm x 60 mm, Anzahl der Anregungen (NEX) = 3, 28 Schichten mit 0,9 mm Dicke und Voxelgröße = 0,375 mm 3 x 0,375 mm 3 x 0,9 mm ³.
5. Um eine Ganzkörper-T2-gewichtete MR zu erhalten, verwenden Sie Fast-Spin-Echo 2D mit TE = 71,8 ms, TR = 3000 ms, FOV = 90 mm x 60 mm, NEX = 5, 28 Scheiben mit 0,9 mm Dicke, Voxelgröße = 0,265 mm 3 x 0,268 mm 3 x 0,9 mm³.
6. Um PET zu rekonstruieren, wählen Sie den Tera-Tomo-Algorithmus (TT3D), Iterationen = 8, Teilmengen = 6, 1-3 Koinzidenzmodus und mit Zerfalls-, Totzeit-, Zufalls-, Dämpfungs- und Streukorrekturen, um Bilder mit einer Gesamtvoxelgröße von 0,3 mm³ zu erstellen.
7. Führen Sie vor Beginn des Experiments einen PET-Aktivitätstest durch, um die Genauigkeit der PET-Quantifizierung zu überprüfen¹¹.
   1. Füllen Sie eine 5-ml-Spritze mit 5-8 MBq [¹⁸F]FMISO, verdünnt in Wasser oder Kochsalzlösung gemäß der Empfehlung des Herstellers. Verwenden Sie einen Dosiskalibrator, um die Aktivität der Spritze aufzuzeichnen (siehe Materialtabelle). Notieren Sie sich den Zeitpunkt der Messung.
   2. Zeichnen Sie ein interessantes Volumen (VOI) auf das rekonstruierte Bild, um die gesamte Spritze abzudecken. Vergleichen Sie die wiederhergestellte Aktivität aus dem Bild mit dem Wert, der vom Dosiskalibrator erhalten wurde. Fahren Sie mit bildgebenden Untersuchungen fort, wenn die wiederhergestellte Aktivität innerhalb von ±5 % genau ist.

4. [18 F]FMISO- und [¹⁸F]FDG-Injektion

1. Besorgen Sie sich 30 Minuten vor Beginn der bildgebenden Untersuchungen eine klinische Dosis von [¹⁸F]FMISO vom Lieferanten. Tragen Sie beim Umgang mit radioaktiven Stoffen die entsprechende persönliche Schutzausrüstung (PSA), wie z. B. einen Laborkittel, Handschuhe, eine Brille, einen Filmausweis und Ringdosimeter. Wechseln Sie häufig die Handschuhe, um eine Kreuzkontamination der radioaktiven Substanzen zu vermeiden.
2. Legen Sie die radioaktiven Stammlösungen in den Bleilagerbehälter hinter einem L-Block-Tischschild. Geben Sie ein Aliquot von [¹⁸F]FMISO ab und verdünnen Sie es mit sterilisierter Kochsalzlösung. Stellen Sie sicher, dass die Gesamtaktivitätskonzentration 18-20 MBq in 100 μl beträgt.
3. Erstellen Sie die [¹⁸F]FMISO mit einer 1-ml-Spritze mit Nadel (siehe Materialtabelle). Notieren Sie die Radioaktivität und die Zeit, die auf dem Dosiskalibrator angezeigt werden.
4. Notieren Sie das Mausgewicht vor der Injektion des Radiotracers. Verwenden Sie 5% Isofluran (1 l/min medizinisches O₂), um die Maus zu betäuben, und injizieren Sie dann vorsichtig das vorbereitete [¹⁸F]FMISO über die Schwanzvene. Notieren Sie die Injektionszeit und die Rückstandsaktivität der Spritze, um die Karieskorrektur zu berücksichtigen. Legen Sie die Maus für 180 Minuten wieder in den Käfig, um die Aufnahme von [¹⁸F]FMISO vor dem PET-Scan zu ermöglichen. Lassen Sie die Maus nach [¹⁸F]FMISO PET 1 Tag lang erholen.
   HINWEIS: Trotz der sehr unterschiedlichen pharmakokinetischen In-vivo-Profile für [18 F]FMISO und [18 F]FDG sind beide Radiotracer mit F-18 radioaktiv markiert, einem PET-Radionuklid mit einer Halbwertszeit von ^109,77min (< 2 h). Da das PET-Signal von F-18 stammt, geht alle 2 Stunden die Hälfte der ursprünglich injizierten Radioaktivität verloren. In diesem Fall kann das Restsignal 24 h nach der Injektion vom PET-Scanner nicht mehr erkannt werden. Darüber hinaus ermöglicht der Abstand von 1 Tag zwischen den Injektionen von [18 F]FMISO (Tag 1) und [18 F]FDG (Tag 3) einen vollständigen Zerfall von [18 F]FMISO, wenn [18 F]FDG PET durchgeführt wird, so dass sich das [18 F]FMISO-Signal im [¹⁸F]FDG PET-Scan nicht überlappt.
5. Wiederholen Sie die Schritte 4.1.-4.4. für die [¹⁸F]FDG-Injektion an Tag 3, mit der Ausnahme, dass eine Gesamtaktivitätskonzentration von 6-8 MBq in 100 μl mit einer 60-minütigen Aufnahme vor Beginn des PET-Scans injiziert wird.
6. Berechnen Sie die injizierte [18 F]FMISO- oder [¹⁸F]FDG-Aktivität mit der folgenden Formel¹¹:
   Injizierte Aktivität (MBq) = Aktivität in der Spritze vor der Injektion - Aktivität in der Spritze nach der Injektion

5. PET/MR-Akquisition

1. Schalten Sie den Lufterhitzer ein, um das Bildgebungsbett der Maus vor dem geplanten PET-Scan zu erwärmen. Verwenden Sie 5% Isofluran (1 l/min medizinisches O₂), um die Maus in einer Induktionskammer zu betäuben.
2. Nach richtiger Anästhesie und Überprüfung mit der Zehen-Pinch-Reaktion legen Sie die Maus vorsichtig und sofort auf das Heizbett und halten Sie die Anästhesie bei 2% -2,5% Isofluran aufrecht. Legen Sie die Maus mit dem Kopf auf die Beißstange und tragen Sie Augengleitmittel auf beide Augen auf, um ein Austrocknen und die mögliche Bildung von Hornhautgeschwüren zu vermeiden. Decken Sie das Bildgebungsbett mit einer Plastikfolie ab, um die Umgebungstemperatur des Bettes aufrechtzuerhalten.
3. Überwachen und zeichnen Sie die Atemfrequenz und die Körpertemperatur der Maus mit dem hauseigenen Beatmungskissen bzw. der Thermosonde auf. Stellen Sie sicher, dass die Körpertemperatur der Maus bei 37 °C gehalten wird, während die Atemfrequenz im Bereich von 40-50 Atemzügen pro Minute (bpm) gehalten wird, indem Sie den Isofluranspiegel anpassen.
4. Führen Sie eine Scout-Ansicht durch, um die Mausposition im Scanner zu ermitteln. Passen Sie die Position des Mausbetts so an, dass der gesamte Mauskörper bedeckt ist, wobei sich die Rumpfregion in der Mitte des Sichtfelds des MR befindet.
5. Um einen PET-Scan zu starten, wählen Sie im Listenfenster "Studie" die Option " PET-Erfassung " und dann " Scanbereich bei vorheriger Erfassung " aus, um die vorgegebene Mausbettposition in der Scout-Ansicht zu verwenden. Klicken Sie auf Vorbereiten > OK , um das Mausbett automatisch von MR nach PET zu verschieben und die Erfassung zu starten.
6. Wählen Sie im Radiopharma-Editor das entsprechende Radionuklid aus und geben Sie dann die Details der Injektionsdosis und die Zeit vor und nach der Injektion von [18 F]FMISO oder [¹⁸F]FDG ein, wie in Schritt 4.3 gemessen. und Schritt 4.4. Geben Sie das Gewicht der Maus im Menü "Betreffinformationen" ein.
7. Fahren Sie nach Abschluss des PET-Scans mit den MR-Erfassungen fort. Wählen Sie dazu Vorbereiten , um die Maus von PET in MR zu verschieben. Klicken Sie auf OK , um fortzufahren.
8. Sobald alle Scans abgeschlossen sind, wählen Sie Startseite , um das Bildgebungsbett wieder in die Standardposition zu verschieben.
9. Schalten Sie die Anästhesie aus und spülen Sie das Bildgebungsbett mit medizinischem O₂. Überprüfen Sie den Rückzugsreflex des Mauspedals. Übertragen Sie die Maus aus dem Bildgebungsbett zurück in einen sauberen Gehäusekäfig, der auf einem Heizkissen platziert ist, um die Genesung von der Narkose zu unterstützen und den Aufrichtungsreflex wiederzuerlangen.
10. Wählen Sie unter "Rohscan" die Option "PET-Erfassung" aus, um die erfassten PET-Rohdaten für die PET-Rekonstruktion zu laden. Wählen Sie MM aus, um es als Materialkarte zu verwenden. Fahren Sie mit der PET-Rekonstruktion fort, indem Sie den in Schritt 3.6 beschriebenen Parameter verwenden.
11. Halten Sie sich strikt an die lokalen und institutionellen Richtlinien beim Umgang mit Mäusen nach PET-Bildgebungsstudien. Behandeln Sie alle gebrauchten Verbrauchsmaterialien, z. B. Spritzen, Nadeln, Handschuhe, Tücher und biologische Abfälle, z. B. Käfigeinstreu und Fäkalien, die in direktem Kontakt mit der Maus standen, als radioaktive Abfälle und behandeln Sie sie sorgfältig gemäß den örtlichen Vorschriften.

6. PET-Bildanalyse

1. Öffnen Sie die Bildanalysesoftware (siehe Materialtabelle) und wählen Sie DICOM-Daten laden , um die PET- und MR-Bilder zu öffnen.
2. Ziehen Sie die entsprechenden PET- und MR-Bilder in das Software-Anzeigefenster und wählen Sie Automatische Registrierung, um die automatische Co-Registrierung der resultierenden PET- und MR-Bilder durchzuführen.
   1. Wählen Sie im Menü "Registrierung einrichten" die Option "Starre Transformation" aus. Verwenden Sie "Umschalt und Drehung" im Menü "Starre/Affin".
   2. Klicken Sie im Menü "Globale Rollenauswahl " auf MM als Referenz und "Statischer PET-Scan als Reslice".
   3. Überprüfen Sie die mitregistrierten PET/MR-Bilder, um eine korrekte Ausrichtung sicherzustellen. Verwenden Sie bei Bedarf die manuelle Registrierung , um die Bilder manuell anzupassen.
   4. Lokalisieren Sie den orthotopen Tumor in der Leber anhand des MRT-Bildes. Verwenden Sie den ROI der interpolierten Ellipse , um einen VOI auf dem Tumor zu zeichnen, wobei Sie das MR-Bild als Referenz verwenden. Übertragen Sie den erzeugten Tumor-VOI vom MR auf das PET-Bild. Wählen Sie das Pinselwerkzeug und das Radiergummiwerkzeug aus, um den VOI-Rand Folie für Folie sorgfältig zu definieren. Achten Sie darauf, ein Übergreifen der Radioaktivität aus der Leber auf dem PET-Bild zu vermeiden.
   5. Verwenden Sie Ellipsoid VOI, um ein 3 mm³ VOI auf der Leber als Referenzorgan zu erzeugen. Achten Sie darauf, Bereiche mit sichtbaren Leber-, Gefäß- und Gallenstrukturen zu vermeiden, indem Sie das MRT-Bild als Leitfaden verwenden.
   6. Wählen Sie ROI-Tabelle anzeigen aus, um alle gezeichneten VOIs umzubenennen. Halten Sie alle notwendigen Daten, z. B. Radioaktivität (kBq/ml) und Tumorvolumen (mm³), in einer Tabelle fest. Speichern Sie eine Kopie der VOI-Zeichnungen und archivieren Sie sowohl die Rohdaten als auch die rekonstruierten Bilddaten auf einer externen Festplatte, wenn Sie fertig sind.
   7. Berechnen Sie den standardisierten Aufnahmewert (SUV) für alle VOIs mit der folgenden Gleichung¹¹:
      SUV = C_PET(t)/(ID/BW)
      wobei C_PET(t) die gemessene Aktivität im VOI, ID die injizierte Dosis in kBq und BW das Körpergewicht der Maus in kg ist, wobei eine Gewebedichte von 1 g/ml angenommen wird.

Ergebnisse

Um einen geeigneten Tumorblock für die sukzessive orthotope Implantation zu erhalten, wurden zunächst stabile Klone durch subkutane Injektion von 200 μl Zellsuspension in DPBS (mit MHCC97L-Zellen) in die untere Flanke von Nacktmäusen erzeugt (Abbildung 1A). Das Tumorwachstum wurde überwacht, und als die Tumorgröße 800-1000 mm 3 erreichte (etwa 4 Wochen nach der Injektion), wurden die Mäuse eingeschläfert, und der resultierende Tumorblock wurde in etwa 1 mm³ Fra...

Diskussion

In dieser Studie beschrieben wir die Verfahren zur Durchführung von HAL an orthotopen HCC-Xenotransplantaten in der Leber unter Verwendung subkutaner Tumoren sowie Methoden zur nicht-invasiven Überwachung der Tumorhypoxie bei orthotopen Xenotransplantaten unter Verwendung von [18 F]FMISO und [¹⁸F]FDG PET/MR. Unser Interesse gilt der metabolischen Bildgebung verschiedener Krebs- und Krankheitsmodelle zur Früherkennung und Bewertung des Therapieansprechens^11,13,14,15

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% sterile saline	BBraun	N/A	0.9% sodium chloride intravenous infusion, 500 mL
10# Scalpel blade	RWD Life Science Co.,ltd	S31010-01	Animal surgery tool
10% povidone-iodine solution	Banitore	6.425.678	For disinfection
25G needle with a 1 mL syringe	BD PrecisionGlide	N/A	1 mL syringe with 25G needle for cell suspensions injections
5 mL syringe	Terumo	SS05L	5 mL syringe Luer Lock
70% Ethanol	Merck	1.07017	For disinfection
Automated Cell Counter	Invitrogen	AMQAF2000	For automated cell counting
Buprenorphine	HealthDirect	N/A	Subcutaneous injection (0.05-0.2 mg/kg/12 hours) for analgesic after surgery
Cell Culture Dish (60 mm diameter)	Thermo Scientific	150462	For tumor tissue processing
Centrifuge	Sigma	3-16KL, fixed-angle rotor 12311	For cell suspensions collection
Centrifuge Conical Tube	Eppendorf	EP0030122151	For cell suspensions collection
Culture media (Dulbecco’s modified Eagle’s medium)	Gibco	10566024	high glucose, GlutaMAX™ Supplement
Digital Caliper	RS PRO	841-2518	For subcutaneous tumor size measurement
Direct heat CO2 incubator	Techcomp Limited	NU5841	For cell culture
Dose calibrator	Biodex	N/A	Atomlab 500
DPBS (Dulbecco’s phosphate-buffered saline)	Gibco	14287072	For cell wash and injection
Eye lubricant	Alcon Duratears	N/A	Sterile ocular lubricant ointment, 3.5 g
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	A4766801	Used for a broad range of cell types, especially sensitive cell lines
Forceps (curved fine and straight blunt)	RWD Life Science Co.,ltd	F12012-10 & F12011-13	Animal surgery tool
Heating pad	ALA Scientific Instruments	N/A	Heat pad for mice during surgery
Insulin syringe	Terumo	10ME2913	1 mL insulin syringe with needle for radiotracer injections
InterView fusion software	Mediso	Version 3.03	Post-processing and image analysis software
Inverted microscope	Yu Lung Scientific Co., Ltd	BM-209G	For cells morphology visualization
Isoflurane	Chanelle Pharma	N/A	Iso-Vet, inhalation anesthetic, 250 mL
Ketamine	Alfasan International B.V.	HK-37715	Ketamine 10% injection solution, 10 mL
Medical oxygen	Linde HKO	101-HR	compressed gas, 99.5% purity
nanoScan PET/MR Scanner	Mediso	N/A	3 Tesla MR
Needle holder	RWD Life Science Co.,ltd	F31026-12	Animal surgery tool
Nucline nanoScan software	Mediso	Version 3.0	Scanner operating software
Nylon Suture (6/0 and 5/0)	Healthy Medical Company Ltd	000524 & 000526	Animal surgery tool
Penicillin- Streptomycin	Gibco	15140122	Culture media for a final concentration of 50 to 100 I.U./mL penicillin and 50 to 100 µg/mL streptomycin.
Pentabarbital	AlfaMedic	13003	Intraperitoneal injection (330 mg/kg) to induce cessation of breathing of mice
Sharp scissors	RWD Life Science Co.,ltd	S14014-10	Animal surgery tool
Spring Scissors	RWD Life Science Co.,ltd	S11005-09	Animal surgery tool
Trypan Blue Solution, 0,4%	Gibco	15250061	For cell counting
Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, 0.25%), phenol red.	Gibco	25200072	For cell digestion
Xylazine	Alfasan International B.V.	HK-56179	Xylazine 2% injection solution, 30 mL