Genetischer Screen zur Identifizierung von Multicopy-Suppressoren in Schizosaccharomyces pombe

Zusammenfassung

Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll für einen Multicopy-Suppressor-Gen-Screen in Schizosaccharomyces pombe. Dieser Bildschirm verwendet eine genomweite Plasmidbibliothek, um Suppressorklone eines Funktionsverlust-Phänotyps zu identifizieren, der mit einem Abfragemutantenstamm assoziiert ist. Neuartige genetische Suppressoren der ell1-Nullmutante wurden mit diesem Screen identifiziert.

Zusammenfassung

Die Identifizierung genetischer Interaktionen ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Funktionen von Genen zu entschlüsseln, indem Einblicke in ihre funktionellen Beziehungen zu anderen Genen und die Organisation biologischer Wege und Prozesse gegeben werden. Obwohl die meisten genetischen Screens ursprünglich in Saccharomyces cerevisiae entwickelt wurden, wurde von Schizosaccharomyces pombe eine ergänzende Plattform für die Durchführung dieser genetischen Screens bereitgestellt. Einer der häufigsten Ansätze zur Identifizierung genetischer Interaktionen ist die Überexpression von Klonen aus einer genomweiten Plasmidbibliothek mit hoher Kopienzahl in einer Funktionsverlustmutante, gefolgt von der Auswahl von Klonen, die den mutierten Phänotyp unterdrücken.

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Durchführung dieses auf "Multicopy Suppression" basierenden genetischen Screenings in S. pombe. Dieser Screen hat dazu beigetragen, Multicopy-Suppressoren des genotoxischen stresssensitiven Phänotyps zu identifizieren, die mit dem Fehlen des Ell1-Transkriptionsverlängerungsfaktors in S. pombe assoziiert sind. Das Screening wurde durch Transformation des Abfrage-ell1-Nullmutantenstamms mit einer S. pombe cDNA-Plasmidbibliothek mit hoher Kopienzahl und Auswahl der Suppressoren auf EMM2-Platten initiiert, die 4-Nitrochinolin-1-oxid (4-NQO), eine genotoxische stressinduzierende Verbindung, enthielten. Anschließend wurde Plasmid aus zwei in die engere Wahl gezogenen Suppressorkolonien isoliert und durch Restriktionsenzyme verdaut, um die Insert-DNA freizusetzen. Plasmide, die ein DNA-Fragment freisetzen, wurden in den ell1-Deletionsstamm retransformiert, um die Fähigkeit dieser Suppressorplasmidklone zu bestätigen, das Wachstum der ell1-Deletionsmutante in Gegenwart von 4-NQO und anderen genotoxischen Verbindungen wiederherzustellen. Die Plasmide, die eine Rettung des Deletionsphänotyps zeigten, wurden sequenziert, um die Gene zu identifizieren, die für die Unterdrückung des ell1-deletionsassoziierten genotoxischen stresssensitiven Phänotyps verantwortlich sind.

Einleitung

Netzwerke genetischer Interaktionen liefern funktionelle Informationen über Gene und beschreiben Signalwege und biologische Prozesse, an denen diese Gene in vivo beteiligt sein können. Darüber hinaus können sie auch Einblicke geben, wie verschiedene Gene miteinander interagieren, was zu einem spezifischen Phänotyp ^1,2,3 führt. Im Laufe der Jahre wurden eine Vielzahl von genetischen Screens von Forschern entwickelt, um grundlegende biologische Fragen zu beantworten und menschliche Krankheiten zu untersuchen. Screens zur Identifizierung genetischer Interaktionen können auf verschiedene Arten durchgeführt werden. Genetische Interaktionen, die in verschiedenen genetischen Screens identifiziert wurden, können unterschiedliche mechanistische Beziehungen zwischen Genen darstellen. Darüber hinaus haben Studien gezeigt, dass ein gemeinsamer Satz genetischer Interaktionen von Genen geteilt wird, die Proteine kodieren, die zum gleichen Signalweg oder Komplex gehören ^4,5. So können genetische Interaktionsnetzwerke verwendet werden, um die funktionelle Organisation in einer Zelle zu etablieren, wobei Gene, die die ähnlichsten Profile teilen, zum gleichen Komplex oder Signalweg gehören, diejenigen Gene, die etwas weniger ähnliche Profile teilen, zum gleichen biologischen Prozess gehören und jene Gene, die überlappende, aber vielfältigere Profile aufweisen, Mitglieder widerspiegeln, die zum gleichen zellulären Kompartiment^{gehören 6}.

Genetische Interaktionsscreens auf der Grundlage von Dosisunterdrückung ("High-Copy- oder Multicopy-Suppression") sind einer der am häufigsten verwendeten Ansätze. Diese Screens können durchgeführt werden, indem ein Abfragemutantenstamm mit einer Genom- oder cDNA-Bibliothek mit hoher Kopienzahl transformiert wird, gefolgt von geeigneten Assays/Selektionstechniken zur Identifizierung unterdrückender oder verstärkender genetischer Interaktionen ^7,8,9. Um eine umfassende genomweite Abdeckung zu gewährleisten, wurden diese Screens auch durchgeführt, indem ein spezifisches Gen von Interesse in einer Sammlung genomweiter Funktionsverlust-Mutanten überexprimiert oder eine Plasmid-kodierte Genom- oder cDNA-Bibliothek mit hoher Kopienzahl in einer Funktionsverlust-Abfragemutante 9,10,11,12,13,14,15 überexprimiert wurde. . Die Multicopy-Strategie könnte auch mit einem dominanten/Überexpression-Ansatz unter Verwendung eines regierbaren Promotors funktionieren.

Die Hauptvorteile der Verwendung von suppressorbasierten Screens bestehen darin, dass die Unterdrückung eines bereits bestehenden Phänotyps in einem mutierten Stamm durch ein anderes Gen eine genetische Beziehung zwischen diesen beiden Genprodukten herstellt, die mit anderen Ansätzen möglicherweise nicht nachgewiesen wurde. Zweitens wurde beobachtet, dass das Vorhandensein einer bereits bestehenden Mutation einen bestimmten Signalweg sensibilisiert, so dass zusätzliche Komponenten dieses Signalwegs durch die Isolierung von Suppressoren identifiziert werden können, die möglicherweise nicht durch direktere genetische Selektionen identifiziert wurden. Darüber hinaus kann dieser Bildschirm verwendet werden, um Suppressoren zu identifizieren, die unterschiedliche Unterdrückungsmechanismen aufweisen¹⁶. Suppressor-Interaktionen treten normalerweise zwischen Genen auf, die funktionell verwandt sind und verwendet werden können, um Hierarchien in Signalwegen aufzuklären. Der genaue zugrunde liegende Mechanismus der Unterdrückung kann sich aufgrund mehrerer Faktoren unterscheiden, einschließlich der Art der im Bildschirm verwendeten Abfragemutante, der experimentellen Bedingungen und des Niveaus der Genexpression. Einer der häufigsten Mechanismen zur Unterdrückung der Dosierung betrifft Gene, die Produkte kodieren, die im selben Komplex oder parallel im selben zellulären / biologischen Prozess zusammenarbeiten. Die Ergebnisse solcher Screens in einfacheren Modellorganismen wie Hefe können auf höhere eukaryotische Organismen ausgedehnt werden, da die meisten grundlegenden biologischen Wege und Prozesse im Laufe der Evolution erhalten bleiben.

Diese genetischen Screens können auch auf verschiedene Arten modifiziert werden, um verschiedene biologische Fragen zu beantworten. So können beispielsweise orthologe Gene aus verschiedenen Organismen identifiziert werden, die den Phänotyp des Abfragemutantenstamms unterdrücken können. Es wurde auch verwendet, um potenzielle Resistenzmechanismen abzugrenzen und Proteinziele von neuartigen antibakteriellen^17,18-, antimykotischen^19,20-^, antiparasitären 21- und ^{Krebs-22-Verbindungen} zu bestimmen. Dieser Bildschirm wurde auch genutzt, um Suppressoren der Aktivität von Arzneimitteln zu identifizieren, deren Wirkmechanismus nicht bekannt ist. Somit können diese Multicopy-Suppressor-Screens prinzipiell optimiert und in einer Vielzahl von Anwendungen in unterschiedlichen Organismen eingesetzt werden. Obwohl die meisten genetischen Screens, die von Hefeforschern verwendet werden, ursprünglich in S. cerevisiae entwickelt wurden, hat sich S. pombe als komplementäres Modellsystem für die Durchführung verschiedener genetischer Screens und Assays herauskristallisiert²³. Darüber hinaus zeigen genomische Organisation und biologische Prozesse in S. pombe, wie das Vorkommen von Introns in mehr Genen, die Komplexität der Ursprünge der DNA-Replikation, die Zentromerstruktur, die Organisation des Zellzyklus und das Vorhandensein der RNAi-Maschinerie, eine größere Ähnlichkeit zwischen S. pombe und höheren Eukaryoten^23,24, was die Bedeutung der Entwicklung und Verwendung genetischer Werkzeuge in S. pombe unterstreicht.

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Identifizierung genetischer Interaktoren basierend auf der "Dosisunterdrückung" eines mutierten Phänotyps mit Funktionsverlust in S. pombe. Die Grundlage dieses Protokolls ist, dass es eine schnelle und effiziente Methode ist, eine cDNA-Bibliothek zu screenen, die Wildtyp-Gene entweder auf einem Multicopy-Plasmid und/oder von einem starken Promotor überexprimiert. Dieses Protokoll besteht aus vier Hauptschritten: Transformation der Bibliothek in einen Abfragemutantenstamm, Auswahl von Plasmidklonen, die den gewünschten Phänotyp des Abfragemutantenstamms unterdrücken, Abrufen der Plasmide aus diesen Suppressorklonen und Identifizierung des Gens, das für die Unterdrückung des Phänotyps verantwortlich ist. Wie bei jeder Methode, die auf der Auswahl und Identifizierung von cDNAs aus einer Bibliothek basiert, hängt der Erfolg des Bildschirms von der Verwendung einer qualitativ hochwertigen und hochkomplexen Bibliothek ab, da der Bildschirm nur die cDNA-Klone abrufen kann, die in der Bibliothek vorhanden sind.

Mit diesem Protokoll ist es uns gelungen, zwei neuartige Suppressoren des genotoxischen stresssensitiven Phänotyps der Abfrage-Nullmutante S. pombe ell1 zu identifizieren. Die ELL-Familie (Eleven Nineteen Lysine Rich Leukemia) von Transkriptions-Elongationsfaktoren unterdrückt das vorübergehende Pausieren der RNA-Polymerase II auf DNA-Vorlagen in biochemischen In-vitro-Assays und ist in verschiedenen Organismen konserviert, von der Spalthefe bis zum Menschen²⁵. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass eine S. pombe ell1-Nullmutante genotoxische Stressempfindlichkeit in Gegenwart von 4-Nitrochinolin-1-oxid (4-NQO) und Methylmethansulfonat (MMS) ^zeigt26. Daher transformierten wir eine S. pombe-Plasmid-kodierte Multicopy-cDNA-Bibliothek in die Abfrage S. pombe ell1 Nullmutante und identifizierten zwei mutmaßliche Klone, die die Fähigkeit zeigten, die genotoxische Stressempfindlichkeit der S. pombe ell1-Nullmutante in Gegenwart von 4-NQO, einer Verbindung, die DNA-Läsionen induziert, zu unterdrücken. Die anschließende Sequenzierung des in den Plasmidklonen vorhandenen Inserts ergab, dass die Gene, die für rax2+ und osh6⁺ kodieren, für die Unterdrückung der genotoxischen Stressempfindlichkeit der ell1-Nullmutante verantwortlich waren, wenn sie in der ell1-Nullmutante überexprimiert wurden.

Protokoll

1. Transformation der cDNA-Bibliothek in den Abfrage-S. pombe-Mutantenstamm zum Screening auf Multicopy-Suppressoren

ANMERKUNG: Die Standard-Lithium-Acetat-Methode²⁷ wurde befolgt, um die S. pombe cDNA-Bibliothek mit einigen Modifikationen in den Abfragestamm S. pombe ell1Δ umzuwandeln:

1. Der Stamm S. pombe ell1Δ züchtet bei 32 °C auf einer YE-Mediumplatte (Tabelle 1), ergänzt mit je 225 μg/ml Adenin, Leucin und Uracil. Beimpfen Sie eine Schleife voller Inokulum des ell1Δ-Stamms von der obigen Platte in 15-20 ml YE-Medium, ergänzt mit je 225 μg / ml Adenin, Leucin und Uracil. Über Nacht bei 32 °C unter Schütteln (200-250 U/min) inkubieren.
2. Am nächsten Tag wird die Übernachtkultur in 100 ml frischem YE-Medium mit den gewünschten Zusätzen auf einen OD von 600 nm (optische Dichte bei 600 nm) von 0,3 verdünnt und bei 32 °C mit Schütteln bei 200-250 U/min inkubiert, bis der OD_{600 nm} die Mid-Log-Phase erreicht.
3. Teilen Sie die 100-ml-Kultur in zwei 50-ml-Zentrifugenröhrchen, gefolgt von einer Zentrifugation bei Raumtemperatur für 10 min bei 4.000 × g.
4. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das Zellpellet mit 1 ml sterilem Wasser, d. h. resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml sterilem Wasser und zentrifugieren Sie bei 4.000 × g für 5 min bei Raumtemperatur.
5. Der Überstand ist zu verwerfen und jedes Zellpellet mit 1 ml 1x LiAc-TE (100 mM Lithiumacetat, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) Lösung wie in Schritt 1.4 beschrieben zu waschen.
6. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie jedes Zellpellet in 250 μL 1x LiAc-TE. Verwenden Sie diese S. pombe-kompetenten Zellen (500 μL) für die Transformation mit der interessierenden DNA. 125 μL der kompetenten Zellen in vier verschiedene sterile Mikrozentrifugenröhrchen für nachfolgende Transformationsschritte überführen.
7. Kochen Sie Träger-DNA aus Lachshoden oder Heringssperma für 1 min und legen Sie sie sofort auf Eis. Für jede Transformation werden 10 μL 10 mg/ml denaturierte, einzelsträngige Träger-DNA in das Mikrozentrifugenröhrchen gegeben, das 125 μL der kompetenten Zellen enthält, gefolgt von einem vorsichtigen Mischen mit einer Mikropipettenspitze. Anschließend werden 50 μg der S. pombe cDNA-Bibliothek in das zuständige Zellträger-DNA-Gemisch-enthaltende Mikrozentrifugenröhrchen gegeben.
8. Die Mikrozentrifugenröhrchen bei Raumtemperatur für 10 min inkubieren und dann 260 μL Polyethylenglykol-Lithiumacetat-Lösung (40% [w/v] PEG 4.000, 100 mM Lithiumacetat, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) in die Röhrchen geben und vorsichtig mit Hilfe einer Mikropipettenspitze mischen.
9. Die Mikrozentrifugenröhrchen mit dem Transformationsgemisch 2 h lang bei 32 °C ohne Schütteln inkubieren. 43 μL vorgewärmtes Dimethylsulfoxid (DMSO) in das Mikrozentrifugenröhrchen geben und vorsichtig mischen. Anschließend werden die Röhren 5 min lang einem Hitzeschock bei 42 °C ausgesetzt.
10. Pelletieren Sie die Zellen bei 4.000 × g für 5 min bei Raumtemperatur. Verwerfen Sie den Überstand und entfernen Sie die restliche PEG-LiAc-TE-Lösung mit Hilfe einer Mikropipettenspitze.
11. Resuspendieren Sie die Zellen in 100 μL sterilem Wasser und Platte auf einer EMM2 (Tabelle 1) Platte (150 mm) mit den erforderlichen Ergänzungen und 0,2 μg / ml 4-NQO.
12. Inkubieren Sie die Platten bei 32 °C für 5-6 Tage, damit Kolonien auf den Platten erscheinen können. Streifen Sie die erhaltenen Kolonien auf derselben Medienplatte in Gegenwart von 0,2 μg / ml 4-NQO und verwenden Sie sie für das weitere Screening.
13. Verwenden Sie für ein Bibliothekstransformationsexperiment 500 μL kompetente Zellen (125 μL kompetente Zellen x 4 Mikrozentrifugenröhrchen) für die Transformation, wie in den Schritten 1.8 bis 1.14 oben beschrieben.
14. Als Kontrolle Platte 1/10 der Transformationsmischung auf einer EMM2-Platte (150 mm) mit erforderlichen Ergänzungen, aber ohne 4-NQO, um die Gesamtzahl der Bibliotheksklone zu berechnen, die nach Transformation der Bibliothek erhalten wurden, und Screening für die Isolierung^der Suppressorklone.

2. Testen und validieren Sie die Rettung/Unterdrückung des Phänotyps, der mit dem Abfragemutantenstamm verbunden ist, durch den mutmaßlichen Suppressor

HINWEIS: Stresspunkt-Assays wurden wie unten beschrieben durchgeführt, um die Rettung/Unterdrückung der ell1-deletionsassoziierten 4-NQO-Stressempfindlichkeit durch den/die mutmaßlichen Suppressor(en) zu testen und zu validieren.

1. Fügen Sie 100-200 μL steriles Wasser in jede der verschiedenen Vertiefungen einer sterilen 96-Well-Mikrotiterplatte hinzu.
2. Wählen Sie eine kleine Menge Inokulum aus jeder der verschiedenen Kolonien, die nach der cDNA-Bibliothekstransformation auf der Platte mit 4-NQO erhalten wurden, mit einem sterilen Zahnstocher oder einer 20-200 μL Mikropipettenspitze. Geben Sie das Inokulum aus jeder der verschiedenen Kolonien in separate unabhängige Vertiefungen der Mikrotiterplatte, die 100-200 μL steriles Wasser enthalten. Gründlich mischen.
3. Spot 3 μL der Zellsuspension aus jeder Vertiefung auf EMM2-Agarplatten, die Adenin (225 μg/ml) und Uracil (225 μg/ml) enthalten, aber Leucin fehlen (der wählbare auxotrophe Marker, der auf dem Plasmidvektor vorhanden ist, der für den Aufbau der in dieser Arbeit verwendeten Bibliothek verwendet wird). Fügen Sie den Platten nach Bedarf geeignete Konzentrationen von 4-NQO hinzu.
4. Inkubieren Sie die Platten bei 32 °C für 3-4 Tage, damit die Zellen wachsen können. Identifizieren Sie die Kolonien, die Wachstum in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von 4-NQO als mutmaßliche Suppressoren zeigen.
5. Um die Suppressoren weiter zu validieren, züchten Sie die ausgewählten Suppressoren zusammen mit geeigneten Kontrollstämmen über Nacht bei 32 °C mit Schütteln (200-250 U/min) in EMM2-Medium, das jeweils 225 μg/ml Adenin und Uracil enthält, aber Leucin fehlt.
6. Am nächsten Tag verdünnen Sie die Zellen auf einen OD 600 nm von 0,3 in frischem EMM2-Medium und züchten sie bei 32 °C mit Schütteln bis zur Mitte der Log-Phase (ca._{OD 600 nm} von 0,6-0,8).
7. Geeignete serielle Verdünnungen (1:10 oder 1:5) von Kulturen auf EMM2-Platten mit erforderlichen Ergänzungen, die entweder 0,4 μM 4-NQO oder 0,01% MMS enthalten. Zur Kontrolle erkennen Sie die Stämme auf einer EMM2-Platte mit den erforderlichen Ergänzungen, aber ohne DNA-schädigendes Mittel.
8. Inkubieren Sie die Platten bei 32 °C für 3-5 Tage, um das Wachstum zu überwachen.
   HINWEIS: Geeignete Assays basierend auf dem Phänotyp, der mit dem Abfragemutantenstamm assoziiert ist, sollten verwendet werden, um die Rettung oder Unterdrückung des Phänotyps zu testen. Wenn beispielsweise Suppressoren eines kälteempfindlichen Phänotyps eines Abfragemutantenstamms identifiziert werden müssen, würde der Assay zum Testen und Validieren der Suppressorklone die Züchtung von Transformanten bei niedrigen Temperaturen beinhalten.
9. Erkennen Sie die mutierten Stämme, die mit einem interessierenden Gen in voller Länge (in diesem Fall Spell1 ) oder einem leeren Vektor als positive bzw. negative Kontrollen zusammen mit den Bibliothekstransformanten transformiert wurden.

3. Isolierung des Plasmids aus den Klonen der S. pombe-Suppressoren

ANMERKUNG: Die Plasmidisolierung aus S. pombe wurde nach dem in Fission yeast: a laboratory manual²⁸ beschriebenen Protokoll mit einigen Änderungen durchgeführt.

1. Beimpfen Sie eine einzelne Hefekolonie in EMM2-Medium, das 225 μg/ml Adenin und Uracil enthält, und lassen Sie die Zellen über Nacht bei 32 °C mit Schütteln bei 200-250 U/min wachsen. Am nächsten Tag ernten Sie 5 AD-Zellen (d.h. 10 ml Kultur von AD 0,5) durch Zentrifugieren für 2 min bei 4.000 × g bei Raumtemperatur.
2. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 0,2 ml Lysepuffer (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris HCl (pH 8,0) und 1 mM Na2_EDTA).
3. 0,2 ml Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1) und 0,3 g säuregewaschene Glasperlen in das Mikrozentrifugenröhrchen geben. Das Mikrozentrifugenröhrchen 2 min bei 4 °C vorstrecken und 1 min auf Eis inkubieren. Wiederholen Sie diesen Schritt 6x.
4. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 10.000 × g für 15 min bei Raumtemperatur. Die obere wässrige Schicht wird in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen überführt und 200 μL Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1) hinzugefügt.
5. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 10.000 × g für 10 min. Die obere wässrige Schicht in ein frisches Röhrchen geben und zwei Volumina 100% Ethanol (~ 400 μL) und 1/10 Volumen Natriumacetat (3 M, pH 5,8) (~ 20 μL) in das Röhrchen geben. Das Mikrozentrifugenröhrchen 1 h lang bei -70 °C inkubieren.
6. Die DNA wird durch Zentrifugation bei 10.000 × g für 15 min bei 4 °C gefällt und der Überstand entfernt. Waschen Sie das DNA-Pellet mit 70% Ethanol (~ 500 μL) und halten Sie es bei Raumtemperatur, um es an der Luft zu trocknen.
7. Resuspendieren Sie die DNA in 20 μL sterilem Wasser. Verwenden Sie 2-5 μL Plasmid-DNA für die Transformation kompetenter E. coli-Zellen.
   HINWEIS: Plasmid kann auch aus Hefezellen unter Verwendung eines der kommerziell erhältlichen Hefeplasmid-Isolierungskits isoliert werden.

4. Identifizierung des vom Suppressorklon kodierten Gens

1. Die isolierten Hefeplasmide werden unter Verwendung des Standardprotokolls²⁹ in E. coli Top10-Stamm [F-mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80LacZM15 lacX74 recA1 ara139 (ara-leu)7697 galUgalKrpsL (StrR) endA1 nupG] umgewandelt und die Zellen mit den erforderlichen Antibiotika auf LB (Luria Broth) -Platten verteilt.
2. Isolieren Sie das/die Plasmid(e) aus E. coli-Transformanten unter Verwendung des alkalischen Standard-Lyseprotokolls²⁹ und befolgen Sie die entsprechenden Kombinationen von Restriktionsenzymen, um die Freisetzung des DNA-Fragments durch Restriktionsaufschluss zu überprüfen.
   HINWEIS: Suppressorplasmid 84 wurde mit Bam HI-Restriktionsenzym und Suppressorplasmid 104 mit PstI / BamHI-Restriktionsenzymen verdaut.
3. Retransformieren Sie die Plasmide, die eine Insertfreisetzung nach Restriktionsaufschluss im ell1 Δ-Stamm zeigen, um ihre Fähigkeit zu überprüfen, den genotoxischen stresssensitiven Phänotyp des ell1Δ-Stammes zu retten.
4. Wählen Sie die Plasmidklone aus, die eine Unterdrückung der genotoxischen Stressempfindlichkeit zeigen, und sequenzieren Sie das in diesen Plasmidklonen vorhandene DNA-Fragment mit vektorspezifischen Vorwärts- und Rückwärtsprimern.
   HINWEIS: In dieser Studie wurde der adh1-Promotor-spezifische universelle Vorwärtsprimer (5'CATTGGTCTTCCGCTCCG 3') verwendet³⁰.
5. Um das für die Unterdrückung verantwortliche Gen zu identifizieren, richten Sie die Sequenz aus, die mit NCBI-Nukleotidblast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_SPEC=GeoBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch) oder Pombase-Sequenz-Alignment-Tool (https://fungi.ensembl.org/Schizosaccharomyces_pombe/Tools/Blast?db=core) erhalten wurde. Wählen Sie die Sequenz aus, die die maximale Ausrichtung zeigt, und identifizieren Sie sie als das Gen für das Multicopy-Suppressorplasmid.

Ergebnisse

Screening auf Multicopy-Suppressor(s) der ell1-deletionsassoziierten genotoxischen Stresssensitivität bei S. pombe
Wir führten das genetische Screening unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls durch, um Multicopy-Suppressoren des Funktionsverlust-Phänotyps des Abfrage-ell1-Deletionsmutantenstamms zu identifizieren. Die wachstumsbedingte Sensitivität des ell1-Deletionsstamms, die in Gegenwart des genotoxischen...

Diskussion

Hefen wurden häufig verwendet, um die grundlegenden biologischen Prozesse und Wege zu untersuchen, die evolutionär in eukaryotischen Organismen konserviert sind. Die Verfügbarkeit genetischer und genomischer Werkzeuge sowie ihre Zugänglichkeit für verschiedene biochemische, genetische und molekulare Verfahren machen Hefen zu einem ausgezeichneten Modellorganismus für die genetische Forschung^34,35,36. Im Laufe der Jahre wur...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-NQO	Sigma	N8141
Acetic Acid, glacial	Sigma	1371301000
Adenine Sulphate	Himedia	GRM033
Agar	Himedia	GRM026
Agarose	Lonza	50004L
Ammonium Chloride	Himedia	MB054
BamHI	Fermentas	ER0051
Biotin	Himedia	RM095
Boric Acid	Himedia	MB007
Calcium Chloride	Sigma	C4901
Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1	Sigma	C0549
Citric Acid	Himedia	RM1023
Disodium hydrogen phospahte anhydrous	Himedia	GRM3960
single stranded DNA from Salmon testes	Sigma	D7656
EDTA disodium	Sigma	324503
Ferric Chloride Hexahydrate	Himedia	RM6353
Glucose	Amresco	188
Ionositol	Himedia	GRM102
Isopropanol	Qualigen	Q26897
Leucine	Himedia	GRM054
Lithium Acetatae	Sigma	517992
Magnesium Chloride Hexahydrate	Himedia	MB040
Molybdic Acid	Himedia	RM690
Nicotinic Acid	Himedia	CMS177
PEG, MW 4000	Sigma	81240
Pentothinic Acid	Himedia	TC159
Phenol	Himedia	MB082
Plasmid Extraction Kit	Qiagen	27104
Potassium Chloride	Sigma	P9541
Potassium hydrogen Pthallate	Merc	DDD7D670815
Potassium iodide	Himedia	RM1086
RNAse	Fermentas	EN0531
SDS	Himedia	GRM205
Sodium Hydroxide	Himedia	GRM1183
Sodium Sulphate	Himedia	RM1037
Tris free Base	Himedia	MB209
Uracil	Himedia	GRM264
Yeast Extract Powder	Himedia	RM668
Zinc Sulphate Heptahydrate	Merc	DJ9D692580