Herstellung hochoffenporiger Mikrokugeln (HOPMs) mittels mikrofluidischer Technologie

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Herstellung von hochoffenen porösen Mikrosphären (HOPMs) auf Basis von Poly(Milchsäure-Co-Glykolsäure) mittels der auf einer Einzelemulsionsformulierung basierenden einfachen mikrofluidischen Technologie. Diese Mikrosphären haben potenzielle Anwendungen im Tissue Engineering und im Arzneimittelscreening.

Zusammenfassung

Im Vergleich zu Massengerüsten und der direkten Injektion von Zellen allein haben die injizierbaren modularen Einheiten aufgrund der Bequemlichkeit bei der Verpackung von Zellen, einer verbesserten Zellretention und minimaler Invasivität ein enormes Interesse an der Reparatur von Fehlfunktionen geweckt. Darüber hinaus könnte die poröse Konformation dieser mikroskaligen Träger den Medienaustausch verbessern und das Niveau der Nährstoffe und Sauerstoffversorgung verbessern. Die vorliegende Studie veranschaulicht die bequeme Herstellung von hochoffenporigen Mikrokügelchen (PLGA-HOPMs) auf Basis von Poly(Milchsäure-Co-Glykolsäure) durch die einfache mikrofluidische Technologie für Zellabgabeanwendungen. Die resultierenden monodispersen PLGA-HOPMs besaßen Partikelgrößen von ~400 μm und offene Poren von ~50 μm mit miteinander verbundenen Fenstern. Kurz gesagt, die emulgierten Öltröpfchen (PLGA-Lösung in Dichlormethan, DCM), umwickelt mit der 7,5% (w/v) Gelatine-wässrigen Phase, wurden in die 1% (w/v) kontinuierlich fließende Polyvinylalkohol (PVA) wässrige Lösung durch die Koaxialdüse in der maßgeschneiderten mikrofluidischen Anordnung eingebracht. Anschließend wurden die Mikrosphären Lösungsmittelextraktions- und Lyophilisationsverfahren unterzogen, was zur Herstellung von HOPMs führte. Insbesondere verschiedene Formulierungen (Konzentrationen von PLGA und Porogen) und Verarbeitungsparameter (Emulgierleistung, Nadelstärke und Durchflussrate der dispergierten Phase) spielen eine entscheidende Rolle für die Qualitäten und Eigenschaften der resultierenden PLGA-HOPMs. Darüber hinaus könnten diese Architekturen möglicherweise verschiedene andere biochemische Hinweise wie Wachstumsfaktoren für erweiterte Anwendungen in der Arzneimittelforschung und Geweberegeneration kapseln.

Einleitung

Zellbeladene Mikrosphären bieten günstige Vorteile, wie z. B. eine verbesserte Zellretentionskapazität in situ, eine effiziente Lieferung von Zellen und die anschließende Fähigkeit zur Zellproliferation in vivo¹. Bis heute wurden zahlreiche Untersuchungen zur Entwicklung einer erfolgreichen Gerüststruktur durchgeführt, die eine förderliche Umgebung für Zellen für Geweberegeneration oder Drogenscreening-Anwendungen unterstützt². Die Hypoxie-Umgebung ist jedoch in den Innenräumen aufgrund unzureichender Versorgung mit Nährstoffen / Sauerstoff und der Ansammlung von Stoffwechselabfällen oft unvermeidlich³. Um diese Probleme zu überwinden, wurden hochporöse Mikrosphären (PMs) unter Verwendung verschiedener Biomaterialien ^4,5,6 entwickelt. Darüber hinaus leiden die Gerüste in dynamischer Kultur unter übermäßiger Scherspannung⁷, und der instabile Zustand des Kulturmediums kann die Genauigkeit von PMs brechen. Alternativ könnte Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) verwendet werden, um PMs mit guter mechanischer Festigkeit für die dynamische Kultur¹ zu verarbeiten. Zum Beispiel demonstrierten wir die Co-Injektion von Maus-Myoblasten (C2C12)-beladenen hochoffenen PLGA-PMs (HOPMs) und humanen Nabelschnurvenendothelzellen (HUVEC)-beladenen Polyethylenglykol-Hohlstäbchen, um volumetrischen Muskelverlust zu heilen und eine bemerkenswerte Verbesserung der in situ Skelettmuskelregeneration zu erzielen⁸.

Insbesondere sind PMs durch große Oberflächen und hohe Porositäten gekennzeichnet, was von besonderem Interesse für die Zelladhäsion und das Wachstum in Richtung minimalinvasiver Zellabgabe ist⁹. Unter Berücksichtigung dieser Aspekte wurden verschiedene biokompatible Materialien zur Herstellung der PMs^10,11 verwendet. Diese designbaren PMs, die mit Zellen kokultiviert werden, bieten eine ausgezeichnete Adhäsion, eine beträchtliche mechanische Festigkeit und stark miteinander verbundene Fenster, die die Zellproliferation zur Reparatur beschädigter Gewebe verbessern könnten¹². In diesem Zusammenhang wurden auch verschiedene Technologien zur Herstellung poröser Kugeln^{entwickelt 13,14}. Zum einen wurden PMs mit gasbildenden Mitteln wie_NH4HCO3 hergestellt, die aufgrund unzureichender Interkonnektivität 15,16,17 zurückgehalten wurden. Auf der anderen Seite wurden PMs direkt nach der Emulgierung geschert, was zu polydispersen PMs¹⁸ führte. Letztendlich ist die Tröpfchenmikrofluidik-Technologie, die auf dem Emulsions-Templating-Ansatz basiert, vielleicht eine effiziente Methode zur Konstruktion von PMs, da sie oft zu Partikeln einheitlicher Größe führt¹⁹. Insbesondere hängen die morphologischen Eigenschaften der Mikrosphären oft von der Qualität der erzeugten Emulsionströpfchen (d. h. Wasser-in-Öl, W/O, oder Öl-in-Wasser, O/W) ab, was die Eigenschaften der Biomaterialien signifikant beeinflussen kann²⁰. Es ist erwähnenswert, dass die vorgefertigte mikrofluidische Plattform zur Erzeugung der Mikrofasern oder Mikrokugeln eingesetzt werden kann. In einem Fall demonstrierten Yu et al. die Herstellung von zellbeladenen mikrofaserigen Strukturen auf der Grundlage kapillarbasierter mikrofluidischer Plattformen, die verwendet werden könnten, um zelluläre Netzwerke zur Nachahmung natürlicher Gewebe aufzubauen²¹. In einem anderen Fall stellten Ye et al. photonische Kristallmikrokapseln durch die Schablonenreplikation kolloidaler Siliziumdioxidkristallperlen durch mikrofluidische Technologien her, was viele Einschränkungen aktueller Techniken überwinden könnte, die eine komplexe Markierung und spezifische Vorrichtung erfordern²².

In der Tat ist die Begründung für die Verwendung dieser Technik auf verschiedene Vorteile zurückzuführen, wie z.B. die einfache Natur, die keine ausgeklügelte Ausrüstung erfordert, und die Bequemlichkeit bei der Synthese von PMs einheitlicher Größe für die Zellabgabe und Anwendungen der regenerativen Medizin. In diesem Zusammenhang können PMs mit vorgefertigten Komponenten des Emulsions-Templating bequem aus einem mikrofluidischen Gerät erhalten werden, das aus Polyvinylchlorid (PVC)-Rohren, einer Glaskapillare und einer Nadel zusammengesetzt ist. Ein W/O-Emulsionsvorläufer wird durch Homogenisieren einer wässrigen Lösung von Gelatine und einer organischen Lösung von PLGA hergestellt. Durch selektives Einspritzen des anwendbaren Teils der Emulsion in die mikrofluidische Plattform werden die PMs mit gleichmäßigen Partikelgrößen und miteinander verbundenen Poren in der gesamten Oberfläche zum Inneren hergestellt. Das vorliegende Protokoll zielt darauf ab, die PLGA-HOPMs durch Emulsions-Templating in der mikrofluidischen Plattform herzustellen. Es wird angenommen, dass dieses Protokoll eine reproduzierbare Produktion von PLGA-HOPMs ermöglicht und möglicherweise in den verwandten Bereichen des Tissue Engineering und des Arzneimittelscreenings anwendbar sein wird.

Protokoll

1. Vorbereitung von Lösungen

1. Bereiten Sie die PVA-Stammlösung im Voraus vor, indem Sie die PVA-Lösung in einem 80 °C-Wasserbad erhitzen und anschließend bei 4 °C in den Kühlschrank stellen. Abkühlen auf Raumtemperatur (RT) für den experimentellen Einsatz.
2. Die Emulsionsvorstufe wird durch Zugabe der wässrigen Gelatinelösung (1 ml, 7,5%, w/v) zur organischen Phase von PLGA (2 ml, 2%, w/v in Dichlormethan, DCM) hergestellt (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Im Allgemeinen umfasst die mikrofluidische Technologie verschiedene Phasen, um die Mikrosphären zu bilden. Die kontinuierliche oder Sammelphase umfasst ein wässriges Polyvinylalkohol (PVA, 600 ml, 1%, w/v).

2. Droplet-mikrofluidische Bauelementmontage und Herstellung von PLGA-HOPMs

HINWEIS: Die für diese Baugruppe erforderlichen Verbrauchsmaterialien sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Passen Sie die Tröpfchengeneratorbaugruppe an.
   1. Konstruieren Sie einen mikrofluidischen Co-Flow-Generator mit einer Glaskapillare (OD, 1 mm), PVC-Rohren (ID, 1 mm) und einer 26-G-Dosiernadel.
   2. Verbinden Sie die Glaskapillare mit dem Ende des PVC-Rohres und stechen Sie dann mit einer Nadel in die Verbindung der obigen Struktur.
   3. Legen Sie das andere Ende des PVC-Rohres während der Tröpfchenerzeugung in die kontinuierliche Phase. Versiegeln Sie die Lücken an der Fuge nach dem Aushärten mit UV-Kleber.
      HINWEIS: Die Nadel muss um 45 ° gebogen werden, um das Durchstechen am PVC-Rohr bequem zu ermöglichen, und die Nadelspitze muss in das Kapillarrohr gestreckt werden, um die koaxiale Struktur zu bilden.
2. Bereiten Sie die mikrofluidische Tröpfchenplattform vor.
   1. Verwenden Sie zwei Spritzenpumpen, wie in Abbildung 1 dargestellt. Verwenden Sie eine 50-ml-Spritze zum Laden der kontinuierlichen Phase und eine 5-ml-Spritze zur Emulsionsbildung.
   2. Stellen Sie die Durchflussraten der kontinuierlichen Phase und der Dispergierphase auf 2 ml/min bzw. 0,08 ml/min ein.
   3. Stellen Sie ein 500-ml-Becherglas in ein Eisbad und füllen Sie es mit einer vorgekühlten PVA-wässrigen Lösung (Schritt 1.1).
      HINWEIS: Das Ende der Glaskapillare muss in die Sammelphase eingetaucht werden. Es wird empfohlen, den Überstand der Sammelphase nach der Emulsionströpfchenbildung in der Plattform mit dem Glasstab zu rühren (1 h, 60 U/min). Emulsionströpfchen werden an der Spitze der Nadelspitze erzeugt. Im Allgemeinen beeinflusst das Messgerät der Nadel die Größe von PMs, wobei das kleinere Messgerät der kleineren Größe von PMs entspricht. Darüber hinaus korreliert der Porendurchmesser hauptsächlich mit der Porogenkonzentration, die mit entsprechender Gelatinekonzentration ansteigen kann¹.
3. Führen Sie die Emulgierung und Tröpfchenerzeugung durch.
   1. Bereiten Sie die Emulsion wie folgt vor.
      1. Bereiten Sie die Emulsion vor, indem Sie die wässrige Gelatinelösung sofort in die DCM-Lösung von PLGA dekantieren (Schritt 1.2) und mit dem Ultraschallgerät emulgieren (siehe Materialtabelle).
      2. Stellen Sie die Ultraschallleistung auf 400 W ein und stellen Sie die Gesamtverarbeitungszeit auf 90 s ein (Intervall 2 s, Ultraschallbehandlung 1 s), begleitet von einer ständigen manuellen Änderung der Position der Sonde.
      3. Stabilisieren Sie die resultierende Emulsion für Spritzenabsaugung und Tröpfchenerzeugung in ca. 20 min.
         HINWEIS: Setzen Sie die Sonde des Ultraschall-Zellschalters in die Öl-Wasser-Grenzfläche. Es wird empfohlen, die Ultraschallsonde nicht mit dem Behälter in Kontakt zu lassen.
   2. Führen Sie die Tröpfchengenerierung durch.
      1. Die vorbereitete Emulsion (Schritt 2.3.1) wird nach der Ultraschallbehandlung rasch in die 5-ml-Spritze der mikrofluidischen Plattform geladen.
      2. Die instabile W/O-Emulsion (die sich im Zuge der Phasentrennung befindet) wird als diskontinuierliche Phase in die mikrofluidische Vorrichtung eingebracht. Verwenden Sie gleichzeitig die wässrige Lösung von PVA als kontinuierliche Phase.
      3. Sammeln Sie die Mikrokugeln mit der Emulsion am Boden des Auffangbechers (PVA, 1%, w/v), nachdem Sie die richtigen Teile der Emulsion in die mikrofluidische Vorrichtung injiziert haben.
      4. Die Probe wird zur weiteren Stabilisierung über Nacht bei 4 °C platziert.
   3. Spülen und lyophilisieren Sie die vorbereiteten Mikrosphären (PLGA-HOPMs) gemäß den folgenden Schritten.
      HINWEIS: Die erzeugten PLGA-HOPMs enthalten beliebige Poren im Inneren und auf der Oberfläche.
      1. Lagern Sie die Mikrokugeln vor der Normalisierung auf RT bei 4 °C und rühren Sie mit einem Glasstab (1 h, 60 U/min) um, um das verbleibende DCM zu entfernen.
      2. Filtrieren Sie die Sammelphase im 500-ml-Becherglas vorsichtig und waschen Sie die gesammelten Mikrokugeln dreimal mit entionisiertem Wasser, um das restliche PVA auf der Oberfläche von PMs abzuwaschen.
      3. Die PLGA-Mikrokugeln für 30 min in das 37 °C warme Wasserbad geben, um die im PLGA-Rückgrat eingewickelte Gelatine aufzulösen.
      4. Die resultierenden PLGA-HOPMs werden zweimal mit dem entionisierten Wasser gespült, um die Restgelatine zu entfernen, und für die Lyophilisation bei -80 °C für 24 h vorgekühlt.
      5. Lagern Sie die trockenen PLGA-HOPMs bei -20 °C für weitere Experimente.

3. Rasterelektronenmikroskopische (REM) Bildgebung

1. PLGA-HOPMs werden auf dem Probentisch des REM (siehe Materialtabelle) bei RT abgeschieden und der Probentisch in die Sputterzelle des Magnetron-Sputters eingesetzt. Schalten Sie den Transformator und das Magnetron nacheinander ein. Führen Sie die Probe in das REM ein, nachdem sie 1 Minute lang mit Gold gesputtert wurde.
2. Erhalten Sie die REM-Bilder, indem Sie die Beschleunigungsspannung auf 5 kV einstellen.
3. Zusätzlich quantifizieren Sie die Partikelgröße von PLGA-HOPMs mit 100 PMs im variablen Feld der REM-Bildgebung. Messen Sie das repräsentative Ergebnis, um die Porengrößenverteilung zu quantifizieren.
   1. Öffnen Sie die Grafiken mit Bild J und verwenden Sie die "gerade Linie", um den Maßstabsbalken des REM-Bildes anzupassen, wodurch die Software Pixel zu Länge identifiziert.
   2. Klicken Sie auf Analysieren > stellen Sie den Maßstab ein, stellen Sie den "bekannten Abstand" auf den Maßstabsbalken des REM-Bildes ein und klicken Sie auf globale > OK.
   3. Klicken Sie auf Analyze > Tools > ROI Manager... , um die Poren- oder Partikelgröße von PLGA PMs zu messen und klicken Sie auf Hinzufügen. Messen Sie die Anzahl der Proben basierend auf der Anforderung.
   4. Klicken Sie auf Messen , um die quantitativen Daten der Grafiken für die weitere Berechnung zu erhalten.

4. Zellkultur- und Fluoreszenzbildgebung

HINWEIS: Für die vorliegende Arbeit wurden mesenchymale Stammzellen (BMSCs) des Knochenmarks von Ratten verwendet. Die Zellen wurden aus einer kommerziellen Quelle gewonnen (siehe Materialtabelle).

1. Kultur der Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium, ergänzt mit L-Glutamin (DMEM/F-12), 10% (v/v) fetalem Rinderserum und 1% Penicillin / Streptomycin. Die Zellen bei 37 °C und 5%_CO2 inkubieren.
2. Passieren Sie die Ratten-BMSCs in einem Verhältnis von 1: 2, nachdem Sie 90% des Zusammenflusses erreicht haben.
3. Führen Sie die Zelladhäsion durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
   1. Die PLGA-HOPMs mit Ethylalkohol (5 ml, 70%, v/v) inkubieren und bei 500 x g für 10 min bei RT sterilisieren.
   2. Die sterilisierten PLGA-HOPMs zweimal mit Phosphatpufferlösung waschen.
   3. Inkubieren Sie die HOPMs (fünf an der Zahl) mit der Zellsuspension (5 ml, 1 x 10⁵ Zellen/ml) in einem sterilen Zentrifugenröhrchen (50 ml) unter dynamischer Kultur für die Haftung von BMSCs an PLGA-HOPMs.
   4. Führen Sie die dynamische Kultur in einem thermostatischen aseptischen Schüttler (37 °C, 90 U/min) durch, indem Sie ein versiegeltes 50-ml-Zentrifugenröhrchen in den Shaker legen (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Die dynamische Kultur zielt darauf ab, die Adhärenzrate von BMSCs auf den Gerüsten zu erhöhen, anstatt die PMs und Zellen direkt auf die Kunststoffplatte zu inkubieren. Die Zellen und PLGA PMs werden in ein 50 ml steriles Zentrifugenröhrchen gegeben, wobei das Röhrchen an einem thermostatischen aseptischen Schüttler (37 °C, 90 U/min) inkubiert und das Medium alle 2 Tage gewechselt wird.
4. Führen Sie den Live- und Dead-Dual-Färbe-Assay durch.
   1. Spülen Sie die zellbeladenen PMs dreimal aus, um BMSCs ohne Befestigung an PLGA-HOPMs freizusetzen.
   2. Legen Sie die zellbeladenen PMs auf die 35 mm Glasbodenplatte. Fügen Sie der PBS-vorgewaschenen Probe 1 ml Färbepuffer (siehe Materialtabelle), einschließlich 1 μL Calcein-AM bzw. Propidiumiodid (PI), hinzu.
   3. Beurteilen Sie die Proben mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie (siehe Materialtabelle). Schalten Sie das Anregungslicht von 488 nm und 552 nm am entsprechenden Detektor ein. Stellen Sie für die z-Overlay-Analyse die z-Breite ein, um die verschiedenen Schichten der Probe durch z-Achsenbewegung des Mikroskops zu erfassen.
      HINWEIS: Es ist erwähnenswert, dass die anderen Flecken angemessen für die Analyse verwendet werden können.

Ergebnisse

Basierend auf früheren Arbeiten zur Optimierung der Hauptparameter¹ wurde PLGA im verdampfbaren DCM-Lösungsmittel gelöst. Die primäre W/O-Emulsion wurde durch Homogenisieren mit Gelatine unter Ultraschallsondenbehandlung hergestellt. Die maßgeschneiderte Co-Flow-Fluidstruktur wurde vereinfacht zusammengesetzt, wobei eine Spritze verwendet wurde, um die Strömungen ständig einzuleiten. Darüber hinaus wurden ausreichende Spülverfahren durchgeführt, um PVA und Gelatine von PLGA-Mikrokugeln z...

Diskussion

Dieser Artikel beschreibt eine effiziente Strategie zur Herstellung von PLGA-basierten Architekturen, nämlich die PLGA-HOPMs. Es ist zu beachten, dass mehrere kritische Schritte sorgfältig unternommen werden müssen, einschließlich der Vermeidung der Lösungsmittelverflüchtigung von PLGA und der sanften Anpassung der Ultraschallleistung an die Zielposition während der Herstellung der Emulsion. Darüber hinaus kann der Flüssigkeitsaustritt der 20-ml-Spritze bis zu einem gewissen Grad eingestellt werden, um die Phase...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuge tube	Solarbio, Beijing, China		5 mL & 50 mL (sterility)
Confocal laser scanning microscopy	Leica, Wetzlar, Germany		TCS SP8
Dichloromethane	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China	20161110	Research Grade
Dispensing needle	Kindly, Shanghai, China		26 G, ID: 250 μm, OD: 460 μm
DMEM/F-12	Gibco; Life Technologies Corporation, Calsbad, USA	15400054	DMEM/F-12 50/50, 1x (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine
Ethyl alcohol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China	20210918	Research Grade
Ethyl-enediaminetetraacetic acid (EDTA)-trypsin	Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra		Trypsin (0.25%), EDTA (0.02%)
Fetal bovine serum (FBS)	Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra		Research Grade
Freeze drier	Bilon, Shanghai, China		FD-1B-50
Gelatin	Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA	lot# SZBF2870V	From porcine skin, Type A
Glass bottom plate	Biosharp, Hefei, China		BS-15-GJM, 35 mm
Glass capillary	Huaou, Jiangsu, China		0.9-1.1 × 120 mm
Incubator shaker	Zhicheng, Shanghai, China	ZWYR-200D
Live dead kit cell imaging kit	Solarbio, Beijing, China	60421211112	Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm)
Low-speed centrifuge	Xiangyi, Hunan, China		TD5A
Magnetron sputter	Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China	MSP-2S
Microflow injection pump	Harvard Apparatus, Holliston, USA		Harvard Pump 11 Plus
Penicillin-streptomycin	Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra	2135250	Research Grade
Phosphate buffered saline (PBS)	Servicebio Technology Co.,Ltd. Wuhan, China	GP21090181556	PBS 1x, culture grade, no Calcium, no Magnesium
Poly(lactic-co-glycolic acid)	Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA	lot# MKCF9651	66–107 kDa, lactide:glycolide 75:25
Poly(vinyl alcohol)	Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA	lot# MKCK4266	13-13 kDa, 98% Hydrolyzed
PVC tube	Shenchen, Shanghai, China		Inner diameter, ID: 1 mm
Rat bone marrow mesenchyml stem cells	Procell, Wuhan, China
Scanning electron microscope	Phenom pure, Eindhoven, Netherlands		Set acceleration voltage at 5 kV
Syrine for medical purpose	Kindly, Shanghai, China		5 mL & 50 mL (with the needle)
Temperature water bath	Mingxiang, Shenzhen, China		36 W
Transformer	Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China	SZ-2KVA
Ultrasonic cell breaker	JY 92-IID, Scientz, Ningbo, China		JY 92-IID
UV curing glue	Zhuolide, Foshan, China		D-3100