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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine 96-Well-Störung einzelner bakteriell besiedelter Caenorhabditis elegans nach Kältelähmung und Oberflächenbleiche, um externe Bakterien zu entfernen. Die resultierende Suspension ist auf Agarplatten plattiert, um eine genaue Quantifizierung der Keimbelastung in einer großen Anzahl einzelner Würmer mit mittlerem Durchsatz zu ermöglichen.

Zusammenfassung

Der Fadenwurm Caenorhabditis elegans ist ein Modellsystem für Wirt-Mikroben- und Wirt-Mikrobiom-Interaktionen. Viele Studien verwenden bisher Batch-Digests anstelle von einzelnen Wurmproben, um die Keimbelastung in diesem Organismus zu quantifizieren. Hier wird argumentiert, dass die große interindividuelle Variabilität, die bei der bakteriellen Besiedlung des Darms von C. elegans beobachtet wird, informativ ist und dass Batch-Digest-Methoden Informationen verwerfen, die für einen genauen Vergleich zwischen den Bedingungen wichtig sind. Da die Beschreibung der diesen Proben innewohnenden Variation eine große Anzahl von Individuen erfordert, wird ein praktisches 96-Well-Plattenprotokoll für die Störung und Kolonieplattierung einzelner Würmer erstellt.

Einleitung

Heterogenität in Wirt-Mikroben-Assoziationen wird allgegenwärtig beobachtet, und Variationen zwischen Individuen werden zunehmend als beitragender Faktor in Populationsprozessen von Konkurrenz und Koexistenz1 bis zur Krankheitsübertragungerkannt 2,3,4. In C. elegans wurde wiederholt eine "versteckte Heterogenität" innerhalb isogener Populationen beobachtet, wobei Subpopulationen von Individuen unterschiedliche Phänotypen in der Hitzeschockreaktion 5,6, Alterung und Lebensdauer 7,8,9,10,11 und vielen anderen Aspekten der Physiologie und Entwicklung zeigten 12 . Die meisten Analysen, die versuchen, die Subpopulationsstruktur zu identifizieren, liefern Hinweise auf zwei Subpopulationen in experimentellen Populationen von isogenen, synchronisierten Würmern 5,7,8, obwohl andere Daten die Möglichkeit von Verteilungen von Merkmalen innerhalb der Population anstelle von verschiedenen Gruppen nahelegen 7,12,13 . Von Bedeutung ist hierbei, dass eine erhebliche Heterogenität in Darmpopulationen sogar innerhalb isogener Populationen von Würmern beobachtet wird, die aus einer gemeinsamen Quelle von Mikroben 13,14,15,16 besiedelt sind, und diese Heterogenität kann durch die Batch-Digest-Messungen verdeckt werden, die weit verbreitet sind17,18,19,20 für die bakterielle Quantifizierung im Wurm.

Diese Arbeit präsentiert Daten, die auf eine größere Abhängigkeit von Einzelwurmmessungen in der Wirt-Mikroben-Assoziation hindeuten, sowie Protokolle zur Erhöhung der Genauigkeit und des Durchsatzes bei Einzelwurmstörungen. Diese Protokolle wurden entwickelt, um die mechanische Störung einer großen Anzahl einzelner C. elegans zur Quantifizierung der lebensfähigen Keimbelastung zu erleichtern und gleichzeitig eine bessere Wiederholbarkeit und einen geringeren Aufwand pro Probe als die stößelbasierte Störung einzelner Würmer zu bieten. Ein empfohlener Darmspülschritt, bei dem sich Würmer vor der Vorbereitung auf eine Störung von hitzeabgetöteten E. coli ernähren dürfen, ist enthalten, um die Beiträge von kürzlich aufgenommenen und anderen vorübergehenden (nicht anhaftenden) Bakterien zu minimieren. Diese Protokolle umfassen eine Kältelähmungsmethode zur Reinigung der Kutikula mit einer oberflächenschonenden Behandlung mit niedriger Konzentration; Das Oberflächenbleichen kann als vorbereitender Schritt bei der Einzelwurmzerstörung oder als Methode zur Herstellung lebender, äußerlich keimfreier Würmer eingesetzt werden. Diese Oberflächenbleichmethode reicht aus, um eine breite Palette externer Mikroben zu entfernen, und die Kaltbehandlung bietet eine Alternative zur herkömmlichen Lähmung auf Levamisolbasis. Während Levamisol für kälteempfindliche Experimente bevorzugt wird, minimiert die Kältelähmung den Beitrag zu gefährlichen Abfallströmen und ermöglicht eine schnelle Wiederaufnahme der normalen Aktivität. Während das vollständige Protokoll ein Laborexperiment beschreibt, bei dem Würmer mit bekannten Bakterien besiedelt werden, können die Verfahren zur Reinigung von Würmern und Einzelwurmstörungen leicht auf Würmer angewendet werden, die aus Wildproben isoliert oder in Mikrokosmosexperimenten besiedelt werden. Die hier beschriebenen Protokolle produzieren lebende Bakterien, die aus dem Wurmdarm extrahiert werden und für die Beschichtung und Quantifizierung von koloniebildenden Einheiten (CFUs) in einzelnen Würmern geeignet sind; Für die sequenzierungsbasierte Analyse der Darmgemeinschaft sollten diesen Protokollen nachfolgende Zelllyse- und Nukleinsäureextraktionsschritte hinzugefügt werden.

Protokoll

Würmer, die in diesen Experimenten verwendet wurden, wurden aus dem Caenorhabditis Genetic Center gewonnen, das vom NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) finanziert wird. Bristol N2 ist der Wildtyp. DAF-2/ IGF-Mutanten daf-16(mu86 ) I (CGC CF1038) und daf-2(e1370) III (CGC CB1370 ) werden verwendet, um Unterschiede in der Darmbakterienbelastung zu veranschaulichen.

HT115(DE3) E. coli , das den pos-1 RNAi-Vektor trägt, stammt aus der Ahringer-Bibliothek21. Die MYb-Sammlung von C. elegans nativen Darmbakterien22 wurde aus dem Schulenburg-Labor gewonnen. Salmonella enterica LT2 (ATCC 700720) attB:GFP-KmR stammt aus diesem Labor23. Pseudomonas mosselii wurde in diesem Labor isoliert. Staphylococcus aureus MSSA Newman pTRKH3-mGFP wurde aus dem LaRock-Labor der Emory University gewonnen.

Alle Wurmpuffer und -medien werden gemäß der zuvor veröffentlichten Literatur24 mit geringfügigen Änderungen vorbereitet (siehe Zusatzdatei 1).

1. Herstellung von synchronisierten sterilen C. elegans

HINWEIS: In diesem Abschnitt werden Schritt-für-Schritt-Verfahren zur Generierung einer synchronisierten Population reproduktiv steriler erwachsener Würmer beschrieben. Die Fütterung mit pos-1 RNAi-Platten wird hier verwendet, um die Produktion von Nachkommen zu verhindern, da diese Interferenz embryonal tödlich ist; L1-Larven, die auf pos-1 RNAi bis zum Erwachsenenalter aufgezogen werden, entwickeln sich zu eiablegenden Hermaphroditen, aber diese Eier sind25 nicht lebensfähig. Das RNAi-Fütterungsprotokoll ist wie im Kapitel "Reverse genetics" von Wormbook26.

  1. Stellen Sie vor dem Synchronisieren von Würmern sicher, dass frische 10 cm NGM + pos-1 RNAi-Platten verfügbar sind. Platten können frisch aus konzentrierter induzierter Flüssigkultur (+Amp +IPTG) hergestellt oder als Rasen auf NGM + 100 μg/ml Ampicillin + 1 mM IPTG beimpft und bei 25 °C im Dunkeln für 1 Tag27 wachsen gelassen werden.
    HINWEIS: Carbenicillin (25 μg / ml) wird häufig anstelle von Ampicillin auf RNAi-Platten verwendet. Ampicillin ist weniger teuer, aber weniger stabil; Bei Verwendung von Ampicillin sollten die Platten sofort nach dem Trocknen ausgesät und so schnell wie möglich verwendet werden (kann für <1 Woche bei 4 ° C gelagert werden)27. Die hier empfohlene hohe Antibiotikakonzentration wird dazu beitragen, eine angemessene Auswahl zu gewährleisten.
  2. Beginnen Sie mit mehreren (typischerweise zwei bis vier) NGM-Platten mit großen Populationen von graviden Hermaphroditen. Isolieren Sie Eier mit Bleich-NaOH-Synchronisation24.
    1. Waschen Sie Würmer von Agarplatten mit 2 ml sterilem ddH 2 O pro Platte. Verteilen Sie die Flüssigkeit gleichmäßig in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen (ein Röhrchen pro Platte oder Hermaphroditen).
    2. Drehen Sie sich für ~ 5 s in einer Tisch-Minizentrifuge (2.000 x g) nach unten, um Erwachsene auf den Boden der Röhrchen zu ziehen. Pipette vom Überstand und wegwerfen.
    3. Waschen mit 1 ml sterilem ddH2O; Drehen Sie sich wie zuvor nach unten und verwerfen Sie den Überstand.
    4. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt, um verbleibende Bakterienreste zu reduzieren.
    5. Resuspendiert den Inhalt jedes Röhrchens in 1 ml sterilem ddH2O. Jedem Röhrchen werden 130 μL handelsübliches Bleichmittel (8,25 % Natriumhypochlorit) und 130 μL 5 N Natriumhydroxid (NaOH, Endkonzentration 0,5 N) beigemessen.
    6. Wirbelröhren kräftig für mindestens 10-15 s alle 2 Minuten, bis erwachsene Körper zerbrochen sind. Lassen Sie die Bleichmittel-NaOH-Behandlung nicht länger als 5 Minuten dauern, um das Abtöten von Eiern zu vermeiden.
    7. In einer Minizentrifuge für 30-60 s bei 2.000 x g drehen, um die Eier zu pelletieren. Pipette vom Überstand und wegwerfen. Es kann ein sichtbares Pellet geben oder auch nicht, das ist normal.
    8. Fügen Sie 1 ml M9-Wurmpuffer hinzu und drehen Sie für 30-60 s bei 2000 x g. Verwerfen Sie den Überstand.
    9. Wiederholen Sie den Spülschritt (1.2.8) 5x, um die Bleichmittel-NaOH-Mischung gründlich zu entfernen, und entfernen Sie so viel wie möglich vom Überstand, ohne das Eipellet zu stören.
    10. Übertragen Sie Eier auf 10 ml M9-Wurmpuffer in einem konischen 50-ml-Röhrchen oder einem 30-ml-Kulturröhrchen mit Kappe. Wenn Sie konische Schläuche verwenden, lassen Sie den Deckel leicht abgeschraubt und verwenden Sie ein wenig Klebeband, um ihn sicher zu halten. Inkubieren Sie mit Schütteln über Nacht (16 h) bei 25 ° C und 200 U / min, damit die Larven schlüpfen können.
  3. Übertragen Sie synchronisierte L1-Larven auf RNAi-Platten, um bis zum Erwachsenenalter zu wachsen.
    1. Fügen Sie 2 ml sterilen M9-Puffer + 0,01% Triton X-100 (im Folgenden M9TX-01) zu jedem L1-Rohr hinzu und übertragen Sie das gesamte Volumen (12 ml) auf ein 15 mL verschraubtes konisches Rohr.
    2. Platzieren Sie 15 ml-Schläuche mit L1-Würmern bei 4 ° C für 10 Minuten, um die Larvenbewegung zu verlangsamen.
    3. Drehen Sie 15 ml konische Röhrchen in einer großen Tischzentrifuge (1.500 x g bei 4 °C für 3 min; Beschleunigung und Verzögerung sollten nicht höher als 80% des Maximums sein).
    4. Pipettieren Sie vorsichtig den Überstand ab, ohne das L1-Pellet zu stören. Verwerfen Sie den Überstand.
    5. Fügen Sie 12 ml kaltes M9TX-01 zu jeder Röhre hinzu. Wiederholen Sie die Zentrifugation. Pipetten Sie vorsichtig ab und entsorgen Sie den Überstand. Jede Röhre sollte ~ 200 μL übrig haben.
    6. Spülen Sie eine 200-μL-Pipettenspitze in M9TX-01 ab, um zu verhindern, dass Würmer am Kunststoff haften, und verwenden Sie diese Spitze, um das Wurmpellet wieder aufzuhängen. Übertragen Sie resuspendierte Würmer auf vorbereitete POS-1-Platten , indem Sie Flüssigkeitstropfen auf den Bakterienrasen pipettieren.
    7. Inkubieren Sie die Platten bei 25 °C bis zum ersten Tag des Erwachsenenalters.
      HINWEIS: Wenn Würmer auf pos-1 RNAi-Platten wachsen, MÜSSEN sich Würmer ad libitum von den RNAi-Bakterien ernähren, bis sie vollständig ins Erwachsenenalter übergegangen sind, um eine hohe Penetranz des embryonal-letalen Phänotyps zu gewährleisten. Überprüfen Sie die Platten bei 24 und 48 h. Wenn die Platten ausgehungert oder fast verhungert erscheinen, müssen die Würmer auf frische Teller gebracht werden, um zu Erwachsenen in voller Größe zu wachsen. Um zu vermeiden, dass sich die Platten erschöpfen, bevor Würmer gezüchtet werden, sollten Sie 250-500 L1-Larven zu jeder 10 cm RNAi-Platte hinzufügen.
  4. Ernten Sie Erwachsene und reinigen Sie Darm-E. coli, um keimfreie Würmer zu erzeugen.
    1. Spülen Sie erwachsene Würmer von Platten mit 5 ml M9TX-01 pro Platte. Übertragen Sie Puffer + Würmer auf eine 15 ml konische Röhre und ermöglichen Sie es Erwachsenen, sich am Boden der Röhre niederzulassen.
    2. Spülen Sie Erwachsene in Wechseln von 10 ml frischem M9TX-01-Puffer ab, bis keine sichtbare bakterielle Trübung mehr verbleibt (typischerweise 1-2x). Röhrchen können bei 700 x g für 30 s zentrifugiert werden, um Würmer zu pelletieren, oder Erwachsene können sich durch Schwerkraft absetzen lassen.
    3. Führen Sie eine zusätzliche Wäsche mit 10 ml M9TX-01 durch, um externe Bakterien zu reduzieren.
    4. Übertragen Sie Würmer auf 50 ml konische Röhrchen oder 30 ml Kulturröhrchen mit 5 ml S Medium + 2x hitzeabgetötetem E. coli OP50 (~ 5 x 109 abgetötete Zellen/ml) + 200 μg/ml Gentamycin + 50 μg/ml Chloramphenicol. Wenn Sie konische Schläuche verwenden, lassen Sie den Deckel leicht abgeschraubt und verwenden Sie ein wenig Klebeband, um ihn sicher zu halten. Verwenden Sie Glaspipetten oder spülen Sie Plastikpipetten in M9TX-01 ab, um zu verhindern, dass die Würmer anhaften.
    5. Inkubieren Sie Erwachsene bei 25 ° C mit Schütteln bei 200 U / min für 24-48 Stunden, um keimfreie Erwachsene zu erzeugen.
      HINWEIS: Wenn die Würmer für >24 h in Antibiotika bleiben sollen, muss möglicherweise mehr hitzeabgetötetes OP50 hinzugefügt werden, um sicherzustellen, dass die Würmer eine ausreichende Nahrungsquelle haben. Prüfen Sie die Röhrchen bei 24 h und ergänzen Sie sie mit wärmeabgetötetem OP50, wenn die Trübung sichtbar reduziert ist.
  5. Saccharose wäscht Erwachsene gemäß den Wormbook-Protokollen24 , um saubere, reproduktiv sterile, synchronisierte Bestände nur für Erwachsene für die bakterielle Besiedlung zu erhalten.
    1. Stellen Sie sicher, dass kalte Volumina von 60% Saccharose, M9-Wurmpuffer und M9TX-01 einsatzbereit sind. Der Einfachheit halber können diese am Vorabend bei 4 °C belassen werden.
    2. Für jede zu waschende Probe ein beschriftetes 15 ml konisches Röhrchen mit 8 ml M9TX-01 erstellen und auf Eis legen. Diese werden in Schritt 1.5.10 benötigt.
    3. Fügen Sie 5 ml M9TX-01 zu jeder 50-ml-Röhre hinzu, die L1-Larven enthält. Übertragen Sie das gesamte Volumen (jetzt 10 ml) auf ein leeres 15 ml verschraubtes konisches Rohr und lassen Sie Erwachsene sich am Boden des Rohres niederlassen.
    4. Den Überstand vorsichtig pipettieren und verwerfen.
    5. Fügen Sie 10 ml M9TX-01 zu jedem Rohr hinzu und bewegen Sie die Rohre für 5-10 min in einen Eiskübel.
      HINWEIS: Ab diesem Zeitpunkt sollten Würmer und alle Puffer auf Eis gehalten werden.
    6. Verwenden Sie die Einstellung "Schnelle Temperatur", um eine große Tischzentrifuge auf 4 °C zu kühlen.
    7. Fügen Sie 10 ml kaltes M9TX-01 zu jedem Röhrchen hinzu, um verbleibende Ablagerungen abzuspülen. Lassen Sie Würmer sich auf Eis niederlassen; Entfernen Sie den Überstand und verwerfen Sie ihn.
    8. Saccharose-Float: Fügen Sie 5 ml kalten M9-Puffer und 5 ml kalte 60% Saccharoselösung zu jedem Röhrchen hinzu und mischen Sie es gründlich. Dann lassen Sie vorsichtig 1 ml kalten M9-Puffer auf die Saccharose-Puffer-Mischung in jedem Rohr schweben. Nicht mischen, nachdem der Schwimmer hinzugefügt wurde.
      ACHTUNG: Bewegen Sie sich schnell für die nächsten Schritte - Würmer können austrocknen, wenn sie zu lange hohen Konzentrationen von Saccharose ausgesetzt sind!
    9. Zentrifuge bei 1500 x g für 3 min bei 4 °C. Lebende erwachsene Würmer befinden sich an der Grenzfläche des M9 und der Saccharose, etwa 1 ml von der Oberseite der Röhre entfernt.
    10. Verwenden Sie eine serologische 5-ml-Pipette aus Glas, um die Wurmschicht auf vorbereitete 15-ml-konische Röhrchen mit kaltem M9TX-01 (aus Schritt 1.5.2) zu übertragen. Seien Sie sehr vorsichtig, um die Schicht von lebenden Würmern zu bekommen, ohne zu viel von der Saccharose zu pipettieren.
    11. Falls erforderlich, fügen Sie M9TX-01 hinzu, um gleiche Volumina von 10-12 ml / Tube zu erhalten. Bei 1500 x g bei 4 °C für 1 min zentrifugieren und dann den Überstand pipettieren. Würmer können an dieser Stelle wieder auf Raumtemperatur gebracht werden.
    12. Wiederholen Sie den Waschschritt 1.5.11 zweimal und reduzieren Sie die Geschwindigkeit auf 700 x g bei 4 °C und die Zeit auf 30 s.

2. Fütterung von Würmern mit lebenden Bakterien in flüssiger Kultur

HINWEIS: Dieses Protokoll wird verwendet, um Würmer mit im Labor gezüchteten Bakterien unter gut gemischten Bedingungen in flüssiger Kultur zu besiedeln (Ergänzende Abbildung 1). Würmer können mit einzelnen Isolaten aus Reinkultur (z.B. Krankheitserregern wie Enterococcus faecium28,29) oder Isolatmischungen (z.B. Minimalmikrobiomgemeinschaften14) besiedelt werden.

  1. Beginnen Sie mit Saccharose-gewaschenen synchronisierten erwachsenen Würmern aus Protokollschritt 1.5 in einem 15 ml konischen Rohr. Waschen Sie die Würmer einmal in 12 ml S-Puffer und entsorgen Sie den Überstand.
  2. Suspendieren Sie die gewaschenen Würmer in dem für das Experiment benötigten Volumen von S-Medium. Betrachten Sie das Volumen der Versuchsbedingungen, die Anzahl der Bedingungen, unter denen Würmer gespalten werden, und die endgültigen Konzentrationen von Würmern und Bakterien.
    HINWEIS: Die Fütterung bei Würmern variiert mit der bakteriellen Verfügbarkeit30 und Würmer können durch Überfüllung31 gestresst werden. Für die Besiedlung in flüssiger Kultur werden <1000 Würmer/ml und >107 KBE/ml empfohlen; 1011 KBE/ml gelten als "ad libitum"-Fütterungsdichte an E. coli32.
  3. Spin Down Bakterienkulturen. Gießen Sie den Überstand ab; Aspiration oder Pipettieren kann verwendet werden, um den Überstand für Bakterien zu entfernen, die lose Pellets bilden.
    HINWEIS: Für Kulturen >5 ml auf 15 ml-Röhrchen übertragen und bei ~ 2800 x g in einer großen Tischzentrifuge für 8-10 min drehen. Kulturen <5 ml können in 1,5 ml-Röhrchen überführt und bei 9000 x g für 1-2 min in einer kleinen Tischzentrifuge zentrifugiert werden. Stark bewegliche Bakterien (z. B. viele Arten von Pseudomonas) müssen möglicherweise 10-15 Minuten lang bei 4 ° C gekühlt werden, um die Bildung eines stabilen Pellets zu erleichtern, und es kann besser sein, bei 4 ° C zu zentrifugieren.
  4. Bakterienkulturen in einem Volumen S-Puffer resuspendieren und wieder zum Pellet zentrifugieren. Entfernen und verwerfen Sie den Überstand wie zuvor.
  5. Resuspendieren Sie Bakterienkulturen in S-Medium mit der gewünschten Dichte für das Experiment sowie alle Antibiotika zur Auswahl. Die zu verwendenden Antibiotika, falls vorhanden, hängen vom Resistenzprofil der Bakterien ab, die für die Besiedlung verwendet werden.
  6. Mit einer mit M9TX-01 beschichteten Pipettenspitze werden Pipettenwürmer sanft auf und ab gebracht, bis Würmer gründlich in S-Medium resuspendiert sind, und dann zur bakteriellen Besiedlung in Rohre oder Plattenvertiefungen überführt.
  7. Fügen Sie jeder Wurmkultur eine bakterielle Suspension hinzu, um die gewünschte bakterielle Konzentration und das gewünschte Endvolumen zu erreichen.
  8. Wenn Sie eine Multi-Well-Platte für die Kolonisation verwenden, bedecken Sie die Platte mit einer sterilen 96-Well-Gasdurchlässigkeits-Dichtungsmembran.
  9. Inkubieren Sie mit Schütteln bei 200 U / min, um zu verhindern, dass sich Bakterien während der Inkubation absetzen.

3. Mechanische Störung einzelner Würmer im 96-Well-Format

HINWEIS: In diesem Abschnitt wird ein 96-Well-Plattenformatprotokoll für mechanische Störungen einzelner bakteriell besiedelter C. elegans beschrieben. Die ersten Schritte des Protokolls (3.1-3.8) beschreiben eine Methode zur Entfernung nicht anhaftender Bakterien aus dem Wurmdarm und zur Reinigung des Äußeren der Würmer mittels Kältelähmung und Oberflächenbleiche. Diese Schritte führen zu sauberen, lebenden erwachsenen Würmern, die zur Quantifizierung des bakteriellen Inhalts mechanisch gestört werden können (3,8-end) oder für weitere Experimente verwendet werden können (Ergänzende Abbildung 1). Dieses Protokoll kann angepasst werden, um Bakterien in Würmern zu quantifizieren, die in flüssiger Kultur (Abschnitt 2), auf Agarplatten oder aus natürlichen oder mikrokosmischen Böden besiedelt sind.

  1. Legen Sie ein Aliquot von M9TX-01 zum Abkühlen auf Eis (4-5x die Anzahl der Proben in ml).
  2. Ein Aliquot von M9TX-01 + Bleichmittel (6% Natriumhypochlorit, 1:1000 oder 1:2000 v/v, 1 ml pro Probe + 1 mL extra) zubereiten und zum Abkühlen auf Eis legen. Dieses Aliquot wird in Schritt 3.8 verwendet.
  3. Bereiten Sie 96-Well-Platten für die serielle Verdünnung von gestörten Wurmproben vor.
    1. Erhalten Sie sterile 300 μL Kapazität 96-Well-Platten mit Deckeln; Dieses Protokoll verwendet eine Verdünnungsplatte pro 12 verdaute Würmer.
    2. Verwenden Sie einen 96-Well-Mehrkanalpipettor, um die Reihen B-D jeder 96-Well-Platte (300 μL Kapazität) mit 180 μL 1x PBS-Puffer zu füllen. Lassen Sie die oberste Zeile leer. Die Zeilen B-D werden zu 10-fachen seriellen Verdünnungen der Wurmverdauungen [0,1x, 0,01x, 0,01x].
    3. Teller beiseite stellen. Verdünnungsplatten werden in Schritt 3.13 verwendet.
  4. Resuspendiert jede Wurmprobe in 1 ml M9TX-01 in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
  5. Schleuderschläuche kurz (2-3 s) in einer Minizentrifuge mit niedriger Geschwindigkeit (2.000 x g) bei 25 °C zum Pellet Erwachsene. Pipette vom Überstand und entsorgen, wobei darauf zu achten ist, dass das Wurmpellet nicht gestört wird.
  6. Mit den Zentrifugationseinstellungen in Schritt 3.5 spülen Sie Würmer zweimal mit 1 ml M9TX-01, dann einmal mit 1 ml M9-Wurmpuffer aus, um externe Bakterien zu reduzieren.
  7. Reinigen Sie nicht anhaftende Bakterien aus dem Wurmdarm.
    1. Resuspendiert jede Probe von Würmern in 1 ml S medium + 2x hitzegetötetem OP50 in einem Kulturröhrchen.
    2. Inkubieren Sie bei 25 ° C für 20-30 Minuten, um den Durchgang von nicht anhaftenden Bakterien aus dem Darm zu ermöglichen.
      HINWEIS: Dies wird auch jedes extrazelluläre fluoreszierende Protein aus dem Lumen entfernen und eine klarere Visualisierung der markierten Bakterien ermöglichen, die am Darmepithel haften, insbesondere wenn säurefeste Fluorophore (z. B. mCherry, dsRed) verwendet werden.
  8. Bleichwürmer an der Oberfläche, um externe Bakterien zu entfernen.
    1. Spülen Sie gespülte Würmer zweimal mit 1 ml kaltem M9TX-01 aus und verwerfen Sie den Überstand.
    2. Lassen Sie die Röhrchen 10 min auf Eis (bevorzugt) oder bei 4 °C abkühlen. Dies wird Würmer lähmen und die Aufnahme von Bleichmittel verhindern.
      HINWEIS: Andere Protokolle verwenden ein chemisches Lähmungsmittel wie Levamisol; Dies ist ein etablierter Ansatz33, der die Hinzufügung eines gefährlichen Abfallstroms erfordert.
    3. Fügen Sie 1 ml eiskalten M9-Wurmpuffer + unparfümiertes Bleichmittel (8,25% Natriumhydroxid, 1:1000 oder 1:2000 v/v) zu jeder Tube hinzu. Lassen Sie die Röhren mindestens 10 Minuten lang auf Eis (bevorzugt) oder bei 4 ° C sitzen, um externe Bakterien abzutöten.
      HINWEIS: Überschreiten Sie nicht die Bleichmittelkonzentration von 1:1000. Selbst bei gelähmten Würmern kann die Sterblichkeit die Folge sein.
    4. Bleichmittelpuffer abperlen und entsorgen; Rückführung von Schläuchen auf Eis, um sicherzustellen, dass Würmer das Pumpen nicht wieder aufnehmen, bis Bleichmittel beseitigt ist.
    5. Fügen Sie 1 ml kaltes M9TX-01 zu jeder Röhre hinzu. Spin für ~5 s in einer Minizentrifuge (2.000 x g bei 25 °C); Rückholschläuche auf Eis. Entfernen Sie den Überstand und verwerfen Sie ihn.
    6. Wiederholen Sie diesen Spülschritt mit weiteren 1 ml kaltem M9TX-01 und verwerfen Sie so viel wie möglich vom Überstand.
      HINWEIS: Wenn Sie Würmer für weitere Experimente verwenden, überspringen Sie den Permeabilisierungsschritt (Protokoll 3.9) und übertragen Sie stattdessen frisch an der Oberfläche gebleichte Erwachsene in einen eiskalten Puffer in einer 6 cm großen Petrischale und trennen Sie Würmer in experimentelle Bedingungen wie in Protokoll 3.10. Halten Sie Würmer kalt, um zu verhindern, dass die Motilität wieder ansteigt, aber arbeiten Sie schnell - Würmer für >30 Minuten auf Eis zu halten, kann möglicherweise zu einer <100% igen Wiederaufnahme der normalen Aktivitätführen 34.
  9. Chemische Permeabilisierung der Wurmkutikula mit Natriumdodecylsulfat und Dithiothrietol (0,25% SDS + 300 mM DTT) (basierend auf35)
    ACHTUNG: DVB-T ist ein Reduktionsmittel und reizend. Tragen Sie PSA und arbeiten Sie in einem Abzug, wenn Sie trockene Vorräte oder Lösungen handhaben. Ein gefährlicher Abfallstrom ist erforderlich.
    1. Bereiten Sie im Abzug genügend SDS/DTT-Lösung vor, um 100 μL für jede Probe zu ermöglichen. Für 1 ml, bis 965 μL M9 Wurmpuffer oder M9TX-01 in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, fügen Sie 5 μL 5% (w/v) SDS und 30 μL 1M DTT hinzu.
      HINWEIS: 1 M DTT-Lösung (wässrig) sollte frisch zubereitet oder in Aliquots bei -20 °C gelagert werden, um die Wirksamkeit zu gewährleisten. Aliquots sollten so dimensioniert werden, dass sie in zwei bis drei Experimenten verbraucht werden, um ein übermäßiges Frost-Tau-Recycling zu vermeiden.
    2. Bewegen Sie Mikrozentrifugenröhrchen mit oberflächengebleichten Schnecken in ein Röhrchenrack mit Raumtemperatur. Jedes Röhrchen sollte Würmer in ~ 20 μL Puffer enthalten.
    3. Fügen Sie jeder Wurmprobe 100 μL SDS/DTT-Lösung hinzu. Entsorgen Sie alle verbleibenden SDS/DVB-T-Lösungen im entsprechenden Gefahrgutstrom.
    4. Lassen Sie die Behandlung bis zu 8 Minuten auf der Bank fortlaufen, um die widerstandsfähige Kutikula der erwachsenen Würmer teilweise abzubauen. Würmer sterben und setzen sich während dieser Zeit am Boden der Röhre ab.
    5. Nachdem die Permeabilisierungszeit abgelaufen ist, pipettieren Sie vorsichtig den SDS/DVB-T-Überstand ab und entsorgen Sie ihn in einem geeigneten SDB/DVB-T-Sonderabfallstrom.
    6. Fügen Sie 1 ml M9TX-01 zu jeder Röhre hinzu. Drehen Sie kurz in einer Tischzentrifuge, um die Würmer zu pelletieren, oder lassen Sie die Würmer sich durch Schwerkraft am Boden der Rohre absetzen, ziehen Sie dann den Überstand ab und entsorgen Sie ihn in einem SDS / DTT-Sonderabfallstrom.
    7. Resuspendieren Sie Würmer in 1 mL M9 Wurmpuffer + 0,1% Triton X-100 bis zur Gebrauchsfertigkeit.
  10. Trennen Sie die Würmer in eine tiefe 96-Well-Platte mit Siliziumkarbid-Körnung für mechanische Störungen. Bereiten Sie die 96-Well-Unterbrechungsplatte wie folgt vor.
    1. Erhalten Sie eine sterile 2 ml Tiefbrunnenplatte mit 96 Well und eine passende Silizium-96-Well-Plattenabdeckung.
      HINWEIS: Es ist wichtig, Platten zu verwenden, die mit den 96-Well-Adaptern für den Gewebedisruptor kompatibel sind. Winzige Unterschiede in den Außenabmessungen machen den Unterschied zwischen einer Platte, die von den Adaptern entfernt werden kann, und einer, die dies nicht kann.
    2. Fügen Sie mit einem sterilen Messlöffelspatel eine kleine Menge steriles 36-Korn-Siliziumkarbid zu jeder Vertiefung der Platte hinzu, die einen Wurm erhält. Verwenden Sie genug Splitt, um den Boden des Brunnens kaum zu bedecken (ca. 0,2 g pro Bohrloch). Übermäßiges Material macht es schwierig, eine Pipettenspitze zum Boden des Brunnens zu bringen, wenn der Inhalt abgerufen wird.
    3. Fügen Sie 180 μL M9-Wurmpuffer zu jeder Vertiefung hinzu.
    4. Beschriften Sie die Spalten oder Zeilen, um anzugeben, wohin jede Probe gehen wird, und bedecken Sie die Platte dann lose mit der Silizium-96-Well-Plattenabdeckung.
  11. Übertragen Sie einzelne Würmer zur Störung auf die 96-Well-Platte.
    1. Bewegen Sie permeabilisierte Würmer vorsichtig zu einer kleinen (35 oder 60 mm) Petrischale, die genügend M9TX-01 enthält, um die Schale bis zu einer Tiefe von ~ 1 cm zu füllen.
      HINWEIS: Wenn eine große Anzahl von Würmern vorhanden ist, ist es möglicherweise nicht möglich, die gesamte Probe zu übertragen, da die Flüssigkeit überfüllt wird und es schwierig sein wird, einzelne Würmer zu pipettieren.
    2. Mit einem Seziermikroskop oder einem anderen Gerät mit geringer Vergrößerung pipettieren Sie einzelne Würmer in 20 μL-Volumina ab und übertragen diese Würmer auf einzelne Vertiefungen der 96-Well-Platte.
      HINWEIS: Es ist am besten, nur frisch getötete Würmer zu ernten. Vermeiden Sie Würmer mit einer starren linearen Form, da diese Würmer möglicherweise schon seit einiger Zeit tot sind. Versuchen Sie, Würmer zu nehmen, die gekrümmt oder S-förmig sind, mit normaler grober Physiologie und einem intakten Darm.
    3. Stellen Sie nach dem Übertragen jedes Volumens sicher, dass der ausgewählte Wurm tatsächlich in das Bohrloch ausgestoßen wurde. Dazu pipettieren Sie 20 μL M9TX-01 aus einem klaren Bereich der Petrischale und geben das volle Volumen wieder in die Schale ab; Dadurch wird normalerweise der Wurm ausgestoßen, wenn er an der Pipette klebt. Wenn der Wurm stecken geblieben ist, entfernen Sie 20 μL aus dem Bohrloch und versuchen Sie den Transfer erneut.
    4. Sobald alle Würmer übertragen wurden, bedecken Sie die 96-Well-Platte mit einem Blatt handelsüblicher flexibler papiergestützter Siegelfolie (2 x 2 Quadrate) und stellen Sie sicher, dass die papierhinterlegte Seite der Siegelfolie nach unten auf die Probenvertiefungen zeigt. Achten Sie darauf, die Siegelfolie nicht zu dünn zu dehnen, da es sonst sehr schwierig sein wird, sie später zu entfernen.
    5. Legen Sie die Silikon-Dichtmatte leicht auf die flexible Dichtfolie; Drücken Sie die Abdeckung zu diesem Zeitpunkt nicht in die Brunnen.
    6. Bewegen Sie die Platte auf 4 ° C, um sie für 30-60 min zu kühlen. Dies verhindert eine Überhitzung während der Unterbrechung, die die Proben beschädigen kann.
      HINWEIS: Dies ist ein Haltepunkt im Protokoll. In den meisten Fällen kann die Platte vor dem Schleifen bis zu 4 h bei 4°C belassen werden. Lassen Sie die Würmer nicht über Nacht, da dies die Keimzahl verändert.
  12. Laden Sie 96-Well-Platten auf einen Gewebedisruptor, um Wurmgewebe aufzubrechen und Darmbakterien freizusetzen.
    HINWEIS: (Optional) Wenn Sie eine ungerade Anzahl von 96-Well-Platten für Digests verwenden, ist es notwendig, ein Gegengewicht vorzubereiten, bevor Sie fortfahren. Verwenden Sie eine leere tiefe 96-Well-Platte und füllen Sie die Brunnen mit Wasser, bis sie das gleiche Gewicht wie die erste Platte hat.
    1. Drücken Sie die Silikon-Dichtmatte fest in die Vertiefungen, um eine Abdichtung zu erzeugen, und stellen Sie sicher, dass der Deckel über die gesamte Oberfläche der Platte flach liegt.
      HINWEIS: Wenn die flexible Dichtfolie nach dem Dehnen zu dick ist, ist es schwierig, den Silikondeckel so zu befestigen, dass er in allen Vertiefungen flach liegt. Dies führt zu einer unzureichenden Abdichtung und einer gut bis gut verlaufenden Kontamination während des Schüttelns.
    2. Sichern Sie Platten im Gewebedisruptor mit den 96-Well-Plattenadaptern. Schütteln Sie die Platten für 1 min bei 30 Hz, dann drehen Sie die Platten um 180 ° und schütteln Sie erneut für 1 min. Dies wird dazu beitragen, gleichmäßige Störungen in allen Vertiefungen der Platte zu gewährleisten.
    3. Klopfen Sie die Platten zwei- bis dreimal fest auf die Bank, um Splitter von der flexiblen Dichtungsfolie zu entfernen.
    4. Mit einer großen Zentrifuge mit zwei 96-Well-Plattenadaptern drehen Sie die Platten 2 Minuten lang mit 2400 x g nach unten, um das gesamte Material am Boden der Bohrlöcher zu sammeln.
    5. Entfernen Sie den Silikondeckel und ziehen Sie die flexible Dichtfolie vorsichtig ab.
      HINWEIS: Wenn die flexible Dichtungsfolie in einer der Vertiefungen haften bleibt, verwenden Sie eine 200-μL-Pipettenspitze, um sie zu entfernen. Dies ist üblich, wenn die flexible Dichtfolie zu dünn gestreckt wurde.
  13. Seriell verdünnte Wurmaufschlussproben in 300 μL in 96-Well-Platten.
    1. Mit einem auf 200 μL eingestellten Multi-Well-Pipettierer mehrmals langsam und vorsichtig auf und ab pipettieren, um den Inhalt der Vertiefungen neu zu mischen, und dann so viel Flüssigkeit wie möglich abziehen. Diese Flüssigkeit wird in die oberen Reihen der in Schritt 3.3 vorbereiteten 96-Well-Platten überführt.
    2. Mit einem 96-Well-Pipettierer, der auf 20 μL eingestellt ist, entfernen Sie dieses Flüssigkeitsvolumen aus der oberen Reihe und geben Sie es in Reihe B ab. Pipette auf und ab 8-10x zum Mischen. Verwerfen Sie Tipps.
    3. Wiederholen Sie Schritt 3.13.2, beginnend mit den 0,1x-Proben in Zeile B, um 0,01x-Verdünnungsproben in Zeile C zu erstellen.
    4. Wiederholen Sie Schritt 3.13.2 erneut, indem Sie von Zeile C zu Zeile D wechseln.
    5. Platte auf festem Agar zur bakteriellen Quantifizierung. Bei monokolonisierten Würmern reicht es im Allgemeinen aus, 10-20 μL Tropfen jeder Verdünnung [1x-0,001x] auf Agarplatten zu kleben. Für die Besiedlung mehrerer Arten wird jede Verdünnung separat beschichtet, indem 100 μL auf eine 10 cm Agarplatte pipettiert werden. Verteilen Sie sich sofort mit verglasten Perlen.

4. Reinigung von Siliziumkarbid-Körnung zur Wiederverwendung

HINWEIS: Dieses Verfahren wird verwendet, um das Mahlmaterial, Siliziumkarbid-Körnung, für die Wiederverwendung nach Experimenten zu reinigen und zu sterilisieren. Dieses Protokoll sollte vor der ersten Verwendung vollständig befolgt werden, da Siliziumkarbid-Splitt ein industrielles Produkt ist und nicht vorsterilisiert wird. Si-Carbid-Körnung (3,2 g/cc) ist ein dichtes, raues Material, das effizient arbeitet, um zähe Proben zu stören. Die Partikel können sich jedoch bei wiederholtem Gebrauch abnutzen und sollten ersetzt werden, wenn sich ein Verschleiß abzeichnet. Glücklicherweise ist das Material preiswert und die normalerweise verkauften Größen (~ 1 lb) sind für viele Experimente ausreichend.

  1. Nachdem Sie Proben für die Beschichtung entfernt haben, fügen Sie 10% Bleichlösung zu allen Vertiefungen der 96-Well-Platte hinzu und lassen Sie sie mindestens 10 Minuten einwirken.
  2. Entfernen Sie den Großteil des Streuguts, indem Sie die 96-Well-Platte schnell über eine kleine hochseitige Schale oder einen leeren P1000-Pipettenspitzenbehälter drehen, der groß genug ist, um den gesamten Inhalt aufzufangen. Die Körnung sinkt sofort auf den Boden des Trays. Gießen Sie die Bleichlösung in eine Spüle.
  3. Füllen Sie die 96-Well-Platte wieder mit Leitungswasser auf und kehren Sie sie in dieselbe Schale um, um den verbleibenden Streugut auszuspülen. Gießen Sie das Wasser in die Spüle.
  4. Wiederholen Sie dies noch ein bis drei Mal mit Leitungswasser, bis die Platte vollständig frei von Sand ist.
  5. Spülen Sie Splitt 2x in Leitungswasser und füllen Sie das Tablett jedes Mal.
    HINWEIS: Die 96-Well-Tiefbrunnenplatte kann in einer Laborspülmaschine gewaschen, sicher mit Folie abgedeckt und mit anderen wiederverwendbaren Kunststoffen autoklaviert werden. Splitt muss nicht sofort gewaschen werden und kann an dieser Stelle beiseite gelegt werden. Verwendeter Splitt wird normalerweise aus mehreren Experimenten vor dem Waschen und Autoklavieren angesammelt.
  6. Waschen Sie Splitt in einer Lösung von Laborwaschmittel für 30 min, wobei Sie gelegentlich durch Wirbeln oder Mischen mit einem Metallspatel rühren.
  7. Spülen Sie alle Spuren von Reinigungsmittel in mehreren (8-10) Wechseln des Leitungswassers ab und spülen Sie dann 2x mit destilliertem Wasser ab.
  8. Streugut in einer offenen Schale, z. B. einer flachen Polypropylen-Autoklavschale, verteilen und mehrere Stunden bei 40-70 °C trocknen.
    HINWEIS: Wenn der Splitt im trockenen Zustand klumpig ist, wurde er nicht ausreichend gereinigt oder gespült. Wiederholen Sie das Reinigungsprotokoll ab Schritt 4.6 und fügen Sie in Schritt 4.7 zusätzliche Spülungen hinzu.
  9. Sauberes, trockenes Streugut in autoklavierbare Glasflaschen mit Schraubverschluss bis zu einer maximalen Tiefe von 5-6 cm verteilen. Autoklav im Vorvakuumzyklus für 30 Minuten zu sterilisieren.

Ergebnisse

Bleichsterilisation von lebenden Würmern
Oberflächengebleichte Würmer sind effektiv frei von äußeren Bakterien, bis die Motilität zurückkehrt und die Ausscheidung wieder aufgenommen wird. Unter den hier verwendeten Bedingungen wird ein schnelles Aussterben von Bakterien im Puffer beobachtet (Abbildung 1A-C, Ergänzende Abbildung 2, Video 1), ohne die darmassoziierten Bakterien in kaltgelähmten Würmern zu stören (Abbildung 1D-F

Diskussion

Hier werden Daten zu den Vorteilen der Einzelwurmquantifizierung der Bakterienlast in C. elegans sowie ein 96-Well-Disruptionsprotokoll vorgestellt, um die schnelle und konsistente Erfassung großer Datensätze dieses Typs zu ermöglichen. Im Vergleich zu bestehenden Methoden33 ermöglichen diese Protokolle eine höhere Durchsatzmessung von intestinalen mikrobiellen Gemeinschaften im Wurm.

Dieser Ansatz hat Plating als ratenbegrenzenden Schritt und ist nicht wi...

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Die Autoren möchten H. Schulenberg und C. LaRock für ihre großzügige gemeinsame Nutzung der in diesen Experimenten verwendeten Bakterienstämme danken. Diese Arbeit wurde durch Mittel der Emory University und der NSF (PHY2014173) unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well flat-bottom polypropylene plates, 300 uLEvergreen Labware290-8350-03F
96-well plate sealing mat, silicon, square wells (AxyMat)AxygenAM-2ML-SQ
96-well plates, 2 mL, square wellsAxygenP-2ML-SQ-C-S
96-well polypropylene plate lidsEvergreen Labware290-8020-03L
AgarFisher Scientific443570050
Bead mill adapter set for 96-well platesQIAGEN119900Adapter plates for use with two 96-well plates on the TissueLyser II
Bead mill tissue homogenizer (TissueLyser II)QIAGEN85300Mechanical homogenizer for medium to high-throughput sample disruption
BioSorterUnion BiometricaBy quotationLarge object sorter equipped with a 250 micron focus for C. elegans
Bleach, commercial, 8.25% sodium hypochloriteClorox
Breathe-Easy 96-well gas permeable sealing membraneDiversified BiotechBEM-1Multiwell plate gas permeable polyurethane membranes. Thin sealing film is permeable to O2, CO2, and water vapors and is UV transparent down to 300 nm. Sterile, 100/box.
Calcium chloride dihydrateFisher ScientificAC423525000
CholesterolVWRAAA11470-30
Citric acid monohydrateFisher ScientificAC124910010
Copper (II) sulfate pentahydrateFisher ScientificAC197722500
Corning 6765 LSE Mini MicrocentrifugeCorning COR-6765
Disodium EDTAFisher Scientific409971000
DL 1,4 Dithiothreitol, 99+%, for mol biology, DNAse, RNAse and Protease free, ACROS OrganicsFisher Scientific327190010
Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes, naturalEppendorf
Eppendorf 5424R microcentrifugeEppendorf540600064024-place refrigerated benchtop microcentrifuge
Eppendorf 5810R centrifuge with rotor S-4-104Eppendorf226270403L benchtop centrifuge with adaptors for 15-50 mL tubes and plates
Eppendorf plate bucket (x2), for Rotor S-4-104Eppendorf22638930
Ethanol 100%Fisher ScientificBP2818500
Glass beads, 2.7 mmLife Science ProductsLS-79127
Glass beads, acid-washed, 425-600 µmSigmaG877-500G
Glass plating beadsVWR76005-124
Hydrochloric acidVWRBDH7204-1
Iron (II) sulfate heptahydrateFisher Scientific423731000
Kimble Kontes pellet pestle motorDWK Life Sciences749540-0000
Kimble Kontes polypropylene pellet pestles and microtubes, 0.5 mLDWK Life Sciences749520-0590
Leica DMi8 motorized inverted microscope with motorized stageLeica11889113
Leica LAS X Premium softwareLeica11640687
Magnesium sulfate heptahydrateFisher ScientificAC124900010
Manganese(II) chloride tetrahydrateVWR470301-706
PARAFILM M flexible laboratory sealing filmAmcorPM996
PeptoneFisher ScientificBP1420-500
Petri dishes, round, 10 cmVWR25384-094
Petri dishes, round, 6 cmVWR25384-092
Petri dishes, square, 10 x 10 cmVWR10799-140
Phospho-buffered saline (1X PBS)Gold BioP-271-200
Polypropylene autoclave tray, shallowFisher Scientific13-361-10
Potassium hydroxideFisher ScientificAC134062500
Potassium phosphate dibasicFisher ScientificBP363-1
Potassium phosphate monobasicFisher ScientificBP362-1
R 4.1.3/RStudio 2022.02.0 build 443R Foundationn/a
Scoop-type laboratory spatula, metalVWR470149-438
Silicon carbide 36 gritMJR Tumblersn/aBlack extra coarse silicon carbide grit. Available in 0.5-5 lb sizes from this vendor.
Sodium dodecyl sulfateFisher ScientificBP166-100
Sodium hydroxideVWRBDH7247-1
Sodium phosphate dibasic anhydrousFisher ScientificBP332-500
Sodum chlorideFisher ScientificBP358-1
SucroseFisher ScientificAC419760010
Tri-potassium citrate monohydrateFisher ScientificAC611755000
Triton X-100Fisher ScientificBP151-100
Zinc sulfate heptahydrateFisher ScientificAC205982500

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