Ein neuartiges Ex-vivo-Modell für Schafhaut mit hohem Durchsatz zum Testen neuer Antibiotika

Zusammenfassung

Das Protokoll beschreibt eine Schritt-für-Schritt-Methode zum Aufbau eines Ex-vivo-Modells für verwundete Haut von Schafen, die mit Staphylococcus aureus infiziert sind. Dieses Hochdurchsatzmodell simuliert Infektionen in vivo im Vergleich zu herkömmlichen mikrobiologischen Techniken besser und bietet Forschern eine physiologisch relevante Plattform, um die Wirksamkeit neuer antimikrobieller Mittel zu testen.

Zusammenfassung

Die Entwicklung antimikrobieller Mittel ist ein teurer Prozess mit immer niedrigeren Erfolgsraten, was weitere Investitionen in die Erforschung antimikrobieller Wirkstoffe weniger attraktiv macht. Die Entdeckung antimikrobieller Wirkstoffe und die anschließende Kommerzialisierung können lukrativer gestaltet werden, wenn ein Fail-Fast-and-Fail-Cheap-Ansatz innerhalb der Lead-Optimierungsphasen implementiert werden kann, in denen Forscher eine größere Kontrolle über das Design und die Formulierung von Arzneimitteln haben. In diesem Artikel wird der Aufbau eines ex vivo mit Staphylococcus aureus infizierten Modells für verwundete Schafe beschrieben, das einfach, kostengünstig, durchsatzfähig und reproduzierbar ist. Die bakterielle Physiologie im Modell ahmt nach, dass während der Infektion die bakterielle Proliferation von der Fähigkeit des Erregers abhängt, das Gewebe zu schädigen. Die Etablierung einer Wundinfektion wird durch eine Erhöhung der lebensfähigen Bakterienzahlen im Vergleich zum Inokulum verifiziert. Dieses Modell kann als Plattform verwendet werden, um die Wirksamkeit neuer antimikrobieller Mittel in der Phase der Leitoptimierung zu testen. Es kann behauptet werden, dass die Verfügbarkeit dieses Modells Forschern, die antimikrobielle Mittel entwickeln, ein Fail-Fast-and-Fail-Cheap-Modell bieten wird, das dazu beitragen wird, die Erfolgsraten in nachfolgenden Tierversuchen zu erhöhen. Das Modell wird auch die Reduzierung und Verfeinerung der Verwendung von Tieren für die Forschung erleichtern und letztendlich eine schnellere und kostengünstigere Übertragung neuartiger antimikrobieller Mittel für Haut- und Weichteilinfektionen in die Klinik ermöglichen.

Einleitung

Hautinfektionen sind ein wichtiges globales Problem mit hohen wirtschaftlichen Kosten für Gesundheitsdienstleister auf der ganzen Welt. Die Entwicklung von Multidrug-Resistenzen und Biofilmbildung durch Krankheitserreger spielt eine Schlüsselrolle bei der Prävalenz nicht heilender Wunden 1,2,3,4. Infolgedessen sind Haut- und Weichteilinfektionen einer der häufigsten Gründe für einen längeren Krankenhausaufenthalt und eine anschließende Wiederaufnahme⁵. Verzögerungen bei der Wundheilung sind sowohl für den Patienten als auch für die Gesundheitsdienstleister kostspielig, wobei einige Schätzungen darauf hindeuten, dass in den USA jährlich rund 6,5 Millionen Patienten betroffen sind. In Großbritannien führen Hautinfektionen und damit verbundene Komplikationen jährlich zu etwa 75.000 Todesfällen ^2,4,6.

Staphylococcus aureus (S. aureus) ist ein gewaltiger Wunderreger, der häufig aus Patientenwunden isoliert^{wird 2,7}. Die Rate der Entstehung von Multidrug-Resistenzen stieg in den 2000er Jahren drastisch an. Während dieser Zeit waren etwa 60% der akuten bakteriellen Haut- und Hautstrukturinfektionen kulturpositiv für Methicillin-resistente S. aureus¹. Die zunehmende Anzahl multiresistenter Stämme unter Staphylokokken und anderen Krankheitserregern in den letzten 2 Jahrzehnten weist auf einen dringenden Bedarf an der schnellen Entwicklung von Antibiotika mit neuen Wirkmechanismen hin, die Resistenzen überwinden können.

Seit Anfang der 2000er Jahre werden Antibiotika-Forschungsprogramme jedoch von längeren Entwicklungszeiten und niedrigen Erfolgsraten dominiert, wobei nur 17% der neuartigen Antibiotika in klinischen Studien in den USA die^{Marktzulassung erhalten} 8. Dies deutet auf eine Diskrepanz zwischen den Ergebnissen von In-vitro-Tests neuer Antibiotika und ihren klinischen Ergebnissen hin. Es kann argumentiert werden, dass diese Diskrepanz weitgehend auf Unterschiede in der bakteriellen Physiologie während Infektionen in vivo und während konventioneller mikrobiologischer Methoden bei der Prüfung der Wirksamkeit von Antibiotika in den präklinischen In-vitro-Stadien zurückzuführen ist. Daher sind neuartige Labormethoden erforderlich, die repräsentativer für die bakterielle Physiologie während der Infektion sind, um die Erfolgsraten in Antibiotika-Forschungsprogrammen zu verbessern.

Aktuelle Methoden zur Untersuchung von Hautinfektionen umfassen Studien an lebenden Tieren (z. B. Mäuse), Ex-vivo-Hautmodelle (z. B. Schweine) und 3D-Tissue-Engineering-Hautmodelle (z. B. Mensch)9,10,11,12. Studien an lebenden Tieren sind streng reguliert und haben einen relativ geringen Durchsatz. In Tiermodellen verursachen Verletzungen und Infektionen erhebliche Belastungen für die Tiere und werfen ethische Bedenken auf. Menschliche Hautmodelle, ex vivo oder Tissue-Engineering, erfordern eine ethische Genehmigung, die Einhaltung lokaler und globaler Gesetze (das Human Tissue Act, die Deklaration von Helsinki), und es gibt Schwierigkeiten beim Erwerb von Geweben, wobei einige Anfragen Jahre dauern, um^13,14 zu erfüllen. Beide Modelltypen sind arbeitsintensiv und erfordern erhebliches Fachwissen, um den experimentellen Erfolg zu gewährleisten. Einige aktuelle Ex-vivo-Hautinfektionsmodelle erfordern vorgeimpfte Bandscheiben und Zusatzstoffe für das Wundbett, um eine Infektion zu ermöglichen. Obwohl diese Modelle unglaublich nützlich sind, gibt es Einschränkungen im Infektionsprozess, da Zusatzstoffe die Nutzung des Wundbettes als Nährstoffquelle einschränken^10,15,16,17. Das in dieser Studie beschriebene Modell verwendet keine Zusatzstoffe für das Wundbett, was sicherstellt, dass die Pathologie der Infektion und die Anzahl der lebensfähigen Zellen das Ergebnis der direkten Nutzung des Wundbetts als einzige Nährstoffquelle sind.

Angesichts des Bedarfs an neuen Labormethoden wurde ein neuartiges Ex-vivo-Modell von Hautinfektionen mit hohem Durchsatz entwickelt, das zur Bewertung der Wirksamkeit neuer Antibiotika verwendet werden soll. Hautinfektionsstudien stehen vor vielen Herausforderungen - hohe Kosten, ethische Bedenken und Modelle, die kein vollständiges Bild zeigen^20,21. Ex-vivo-Modelle und 3D-Explantatmodelle ermöglichen eine bessere Visualisierung des Krankheitsprozesses und der Auswirkungen, die Behandlungen von einem klinisch relevanteren Modell haben können. Hier wird der Aufbau eines neuartigen Schafhautmodells beschrieben, das einfach, reproduzierbar und klinisch relevant ist und einen hohen Durchsatz aufweist. Schafhaut wurde ausgewählt, da Schafe eines der großen Säugetiere sind, die üblicherweise verwendet werden, um Reaktionen auf Infektionen in vivo zu modellieren. Darüber hinaus sind sie in Schlachthöfen leicht erhältlich, um eine stetige Versorgung mit Haut für die Forschung zu gewährleisten, und ihre Kadaver werden nicht verbrüht, was eine gute Gewebequalität gewährleistet. Diese Studie verwendete S. aureus als exemplarischen Erreger; Das Modell funktioniert jedoch gut mit anderen Mikroorganismen.

Protokoll

Lämmerköpfe aus dem Schlachthof R.B. Elliott und Son wurden in diesem Projekt als Quelle für Hautproben verwendet. Alle Lämmer wurden für den Verzehr als Lebensmittel geschlachtet. Anstatt die Köpfe wegzuwerfen, wurden diese für die Forschung wiederverwendet. Eine ethische Genehmigung war nicht erforderlich, da das Gewebe aus Abfällen stammte, die von Schlachthöfen weggeworfen wurden.

1. Sterilisation

1. Desinfizieren Sie die Pinzette vor dem Sammeln der Köpfe, indem Sie eine saubere Pinzette nehmen und eine trockene Hitzesterilisation in einem Ofen bei 200 ° C für 1 h durchführen. Autoklavieren Sie alle Glaswaren bei 121 °C für 15 min vor Gebrauch.
2. Führen Sie alle beschriebenen Arbeiten in einem Mikrobiologie-Schrank der Klasse 2 durch. Bereiten Sie alle Reagenzien gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.

2. Probenentnahme

1. Im Schlachthof wurden Swaledale-Lämmer durch Betäubung mit Strom oder einer Bolzenpistole geschlachtet und entblutet. Sammeln Sie Lammköpfe nicht später als 4 Stunden nach der Schlachtung.

3. Vorbereitung der Köpfe

1. Desinfizieren Sie den Stirnbereich des Lammes, indem Sie etwa 100 ml 200 ppm Chlordioxidlösung auf den Probenbereich gießen. Rasieren Sie den Stirnteil des Kopfes mit elektrischen Haarschneidern und waschen Sie den Bereich mit 200 ml 200 ppm Chlordioxidlösung.
2. Wischen Sie den Bereich mit Ethanol und blauer Rolle ab und bedecken Sie den Probenbereich 35 min lang mit einer Haarentfernungscreme. Kratzen Sie die Haarentfernungscreme vorsichtig mit einem Schabenwerkzeug ab und beurteilen Sie den Probenbereich. Wenn eine signifikante Menge an Haaren verbleibt, wiederholen Sie den Haarentfernungsvorgang.
3. Verwenden Sie weitere 200 ml Chlordioxidlösung, um den Bereich zu spülen, und spülen Sie dann mit Ethanol ab und wischen Sie mit einer blauen Rolle.
4. Schneiden Sie mit einem sterilen 8-mm-Biopsiestempel 8 mm Hautproben aus dem vorbereiteten Bereich aus. Entfernen Sie die Proben mit einer sterilen Pinzette und einem 15-Klingen-Skalpell, um sicherzustellen, dass das gesamte Hautfett entfernt wird.
5. Die Proben werden in ein steriles 0,5-l-Glas gegeben, das mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gefüllt ist, und dann in sterile 50-ml-Röhrchen mit 50 ml 200 ppm Chlordioxidlösung überführt, zweimal umgedreht und 30 min sterilisieren lassen.
6. Nehmen Sie die Proben aus der Chlordioxidlösung und waschen Sie sie, indem Sie sie in ein 50-ml-Röhrchen geben, das mit 40 ml sterilem PBS gefüllt ist. Nach dem Waschen legen Sie jede einzelne Hautprobe in eine separate Vertiefung einer 24-Well-Platte.
7. Fügen Sie 350 μL vorgewärmtes Medium hinzu, während die Probe an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche gehalten wird. Die Zusammensetzung der Medien ist wie folgt: MK-Medien (Medium 199 mit Hanks-Salzen, L-Glutamat und 1,75 mg / ml Natriumbicarbonat) und Hams F12 im Verhältnis 1: 1, mit Zusatz von FBS (10% v / v), EGF (10 ng / ml), Insulin (5 μg / ml), Penicillin-Streptomycin (100 U / ml) und Amphotericin B (2,5 μg / ml).
8. Verschließen Sie die 24-Well-Platten mit einer gasdurchlässigen Plattendichtung und inkubieren Sie bei 37 °C in einem befeuchteten 5% CO2-Gewebeinkubator für bis zu 24 h.

4. Pflege von Hautproben

1. Entfernen Sie nach der Inkubation das Kulturmedium und spülen Sie die Proben in 500 μL sterilem PBS ab. Fügen Sie jeder Probe antibiotikafreie Medien hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C in einem befeuchteten 5%_{CO2-Gewebeinkubator} für 24 Stunden, um Restantibiotika in der Probe zu entfernen.
2. Wenn sich nach 24 h Trübung oder Pilzinfektion in den antibiotikafreien Medien entwickelt, verwerfen Sie die Probe.

5. Vorbereitung des Inokulums

1. Bereiten Sie eine 50-ml-Tube mit 10 ml steriler tryptischer Sojabrühe vor. Nehmen Sie eine frische Agarplatte von S. aureus und verwenden Sie einen Tupfer, um mehrere Kolonien in die Brühe zu übertragen. 18 h bei 37 °C bei 150 U/min inkubieren.
2. Zentrifugieren bei 4.000 x g für 3 min. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 ml sterilem PBS. Wiederholen Sie dies zweimal, um eine ausreichende Reinigung der Zellen zu gewährleisten.
3. Stellen Sie das Inokulum auf 0,6 OD₆₀₀ in sterilem PBS ein. Bestätigen Sie die Inokulumbelastung, indem Sie eine manuelle Keimzahl durchführen.

6. Infektion von Hautproben

1. Bereiten Sie eine frische 24-Well-Platte mit 400 μL vorgewärmtem antibiotikafreiem Medium vor und fügen Sie die 24-Well-Einsätze mit einer sterilen Pinzette hinzu.
2. Entfernen Sie die Medien von den Hautproben, waschen Sie sie mit 500 μL sterilem PBS und entfernen Sie die Wäsche. Verwenden Sie eine sterile Pinzette, um die Probe vorsichtig am Boden der Vertiefung zu halten.
3. Verwenden Sie eine 4-mm-Stanzbiopsie, um eine zentrale Wundklappe herzustellen, die bis zu einer rauen Tiefe von 1-2 mm durchdringt. Verwenden Sie dann ein 15-Klingen-Skalpell und sterile gezahnte Allis-Gewebezangen, um die oberste Schicht des Wundlappens zu entfernen. Variabilität in den Wunddimensionen kann das Ergebnis der Infektion und die Endpunktkolonie bildenden Einheiten (CFU) beeinflussen.
4. Sobald alle Proben verwundet sind, werden sie mit einer sterilen Pinzette in die 24-Well-Einsätze überführt. Pipettieren Sie 15 μL des bakteriellen Inokulums in das Wundbett. Anschließend 24 h bei 37 °C in einem befeuchteten 5%_{CO2-Gewebeinkubator} inkubieren.
5. Wenn längere Inkubationszeiten erforderlich sind, entfernen Sie die Medien und ersetzen Sie sie alle 24 Stunden durch frische Medien und inkubieren Sie unter den gleichen Bedingungen.

7. Bestimmung der Keimbelastung

1. Entfernen Sie das Medium vom Boden der Vertiefungen. Mit einer sterilen Pinzette wird jede Probe in ein separates 50-ml-Röhrchen mit 1 ml sterilem PBS überführt.
2. Verwenden Sie einen feinspitzen Homogenisator, um die Oberfläche der Probe zu homogenisieren. Achten Sie darauf, dass das Wundbett in direktem Kontakt mit der Spitze des Homogenisators steht.
3. Homogenisieren Sie jede Probe für 35 s auf mittel/hoch. Der Homogenisator löst die Bakterien von der Oberfläche des Wundbettes, um eine Aufzählung der Bakterienbelastung zu ermöglichen.
4. Sobald alle Proben verarbeitet sind, wirbeln Sie jede Probe der Reihe nach vor dem Pipettieren durch. Dadurch soll sichergestellt werden, dass das bakterielle Homogenat gemischt wird.
5. 20 μL vortexiertes Homogenat werden in die entsprechende Vertiefung einer 96-Well-Platte pipettiert, die 180 μL steriles PBS enthält.
6. Jedes Probenhomogenat wird nacheinander auf 1 x 10⁻⁷ verdünnt und 10 μL des verdünnten Homogenats auf eine tryptische Sojaagarplatte in dreifacher Ausfertigung pipettiert.
7. Die Agarplatte 18 h bei 37 °C inkubieren. Zählen Sie dann die Anzahl der Kolonien, um die KBE für jede Probe zu bestimmen.

Ergebnisse

Die Identifizierung eines Weges zur Sterilisation der Haut vor der Einrichtung des Wundinfektionsmodells war eine Herausforderung. Die Herausforderung bestand darin, die Haut zu sterilisieren, ohne die verschiedenen Hautschichten zu beschädigen, was dann unbeabsichtigte Folgen für den Ausgang einer Infektion haben kann. Um ein geeignetes Sterilisationsregime zu identifizieren, wurden verschiedene Behandlungen über unterschiedliche Zeiträume ausprobiert, wie in Tabelle 1 dargestellt. Die Kontamination...

Diskussion

Die Entwicklung antimikrobieller Mittel ist ein wichtiges, aber teures Unterfangen, das schätzungsweise rund 1 Milliarde US-Dollar kostet und etwa 15 Jahre in Anspruch nimmt. Über 90 % der antimikrobiellen Wirkstoffforschung und präklinischen Studien zur Wirksamkeit antimikrobieller Arzneimittel werden von akademischen Forschern und kleinen und mittleren Unternehmen mit typischerweise weniger als 50 Mitarbeitern durchgeführt²². Diese Teams sind finanziell sehr eingeschränkt, was das Versagen ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 Well Companion Plate	SLS	353504
4 mm Biopsy Punch	Williams Medical	D7484
50 ml centrifuge tubes	Fisher Scientific	10788561
8 mm Biopsy Punch	Williams Medical	D7488
Amphotericin B solution, sterile	Sigma	A2942
Colour Pro Style Cordless Hair Clipper	Wahl	9639-2117X	Hair Clippers
Dual Oven Incubator	SLS	OVe1020	Sterilising oven
Epidermal growth factor	SLS	E5036-200UG
Ethanol	Honeywell	458600-2.5L
F12 HAM	Sigma	N4888
Foetal bovine serum	Labtech International	CA-115/500
Forceps	Fisher Scientific	15307805
Hair Removal Cream	Veet	Not applicable
Heracell VIOS 160i	Thermo Scientific	15373212	Tissue culture incubator
Heraeus Megafuge 16R	VWR	521-2242	Centrifuge
Homogenizer 220, Handheld	Fisher Scientific	15575809
Homogenizer 220, plastic blending cones	Fisher Scientific	15585819
Insert Individual 24 well 0.4um membrane	VWR International	353095
Insulin, recombinant Human	SLS	91077C-1G
Medium 199 (MK media)	Sigma	M0393
Microplate, cell culture Costar 96 well	Fisher Scientific	10687551
Multitron	Infors	Not applicable	Bacterial incubator
PBS tablets	Sigma	P4417-100TAB
Penicillin-Streptomycin	SLS	P0781
Plate seals	Fisher Scientific	ESI-B-100
Safe 2020	Fisher Scientific	1284804	Class II microbiology safety cabinet
Scalpel blade number 15	Fisher Scientific	O305
Scalpel Swann Morton	Fisher Scientific	11849002
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761-1KG
Toothed Allis Tissue Forceps	Rocialle	RSPU500-322
Tryptic Soy Agar	Merck Life Science UK Limited	14432-500G-F
Tryptic Soy Broth	Merck Life Science UK Limited	41298-500G-F
Vimoba Tablets	Quip Labs	VMTAB75BX