Beschaffung und Perfusions-Dezellularisierung von porcinen vaskularisierten Klappen in einem maßgeschneiderten Perfusionsbioreaktor

Zusammenfassung

Das Protokoll beschreibt die chirurgische Beschaffung und anschließende Dezellularisierung von vaskularisierten Schweinelappen durch die Perfusion von Natriumdodecylsulfat-Waschmittel durch das Lappengefäßsystem in einem maßgeschneiderten Perfusionsbioreaktor.

Zusammenfassung

Großvolumige Weichteildefekte führen zu funktionellen Defiziten und können die Lebensqualität des Patienten stark beeinträchtigen. Obwohl die chirurgische Rekonstruktion mittels autologem freien Lappentransfer oder vaskularisierter Kompositallotransplantation (VCA) durchgeführt werden kann, haben solche Methoden auch Nachteile. Probleme wie Morbidität an der Spenderstelle und Gewebeverfügbarkeit begrenzen den autologen freien Lappentransfer, während die Immunsuppression eine signifikante Einschränkung der VCA darstellt. Technisch hergestellte Gewebe in der rekonstruktiven Chirurgie mit Dezellularisierungs-/Rezellularisierungsmethoden stellen eine mögliche Lösung dar. Dezellularisiertes Gewebe wird mit Methoden erzeugt, die natives Zellmaterial entfernen und gleichzeitig die zugrunde liegende extrazelluläre Matrix (ECM) -Mikroarchitektur erhalten. Diese azellulären Gerüste können dann anschließend mit empfängerspezifischen Zellen rezellularisiert werden.

Dieses Protokoll beschreibt die Beschaffungs- und Dezellularisierungsmethoden, die verwendet werden, um azelluläre Gerüste in einem Schweinemodell zu erhalten. Darüber hinaus enthält es auch eine Beschreibung des Perfusionsbioreaktordesigns und -aufbaus. Die Lappen umfassen das porcine Omentum, den Tensor fascia lata und den radialen Unterarm. Die Dezellularisierung erfolgt durch Ex-vivo-Perfusion von Natriumdodecylsulfat (SDS)-Detergens mit niedriger Konzentration, gefolgt von einer DNase-Enzymbehandlung und einer Peressigsäuresterilisation in einem maßgeschneiderten Perfusionsbioreaktor.

Eine erfolgreiche Gewebedezellularisierung zeichnet sich makroskopisch durch ein weiß-opakes Aussehen der Lappen aus. Azelluläre Lappen zeigen das Fehlen von Kernen bei histologischer Färbung und eine signifikante Verringerung des DNA-Gehalts. Dieses Protokoll kann effizient verwendet werden, um dezellularisierte Weichteilgerüste mit erhaltener ECM und vaskulärer Mikroarchitektur zu erzeugen. Solche Gerüste können in nachfolgenden Rezellularisierungsstudien verwendet werden und haben das Potenzial für eine klinische Translation in der rekonstruktiven Chirurgie.

Einleitung

Traumata und Tumorentfernungen können zu großen und komplexen Weichteildefekten führen. Diese Defekte können die Lebensqualität der Patienten beeinträchtigen, zu Funktionsverlust führen und zu dauerhaften Behinderungen führen. Während Techniken wie der Transfer autologer Gewebelappen häufig praktiziert wurden, sind Probleme mit der Verfügbarkeit von Lappen und der Morbidität der Spenderstelle wesentliche Einschränkungen ^1,2,3. Die vaskularisierte Komposit-Allotransplantation (VCA) ist eine vielversprechende Alternative, die zusammengesetzte Gewebe, z. B. Muskeln, Haut, Gefäße, als eine Einheit an die Empfänger überträgt. VCA erfordert jedoch eine langfristige Immunsuppression, die zu Arzneimitteltoxizität, opportunistischen Infektionen und Malignomen führt ^4,5,6.

Tissue-engineered azelluläre Gerüste sind eine mögliche Lösung für diese Einschränkungen⁷. Azelluläre Gewebegerüste können mit Dezellularisierungsmethoden erhalten werden, die zelluläres Material aus nativen Geweben entfernen und gleichzeitig die zugrunde liegende extrazelluläre Matrix (ECM) -Mikroarchitektur erhalten. Im Gegensatz zur Verwendung synthetischer Materialien im Tissue Engineering bietet die Verwendung von biologisch gewonnenen Scaffolds ein biomimetisches ECM-Substrat, das Biokompatibilität und das Potenzial für die klinische Translation ermöglicht⁸. Nach der Dezellularisierung kann die anschließende Rezellularisierung von Gerüsten mit empfängerspezifischen Zellen dann funktionelle, vaskularisierte Gewebe mit wenig bis gar keiner Immunogenität erzeugen 9,10,11. Durch die Entwicklung eines effektiven Protokolls zur Gewinnung von azellulärem Gewebe mithilfe von Perfusionsdezellularisierungstechniken kann eine breite Palette von Gewebetypen entwickelt werden. Aufbauend auf dieser Technik wiederum ermöglicht die Anwendung auf komplexere Gewebe. Bisher wurde die Perfusionsdezellularisierung von vaskularisierten Weichteilen unter Verwendung einfacher vaskularisierter Gewebe wie einem fasziokutanen Lappen voller Dicke in Nagetier 12, Schweine 13 und Humanmodellen¹⁴ sowie Schweinerectus abdominis Skelettmuskel¹⁵ untersucht. Darüber hinaus wurden komplexe vaskularisierte Gewebe auch perfusionsdezellularisiert, wie in Schweine- und menschlichen Ohrmodellen^16,17 und menschlichen Vollgesichtstransplantatmodellen¹⁸ gezeigt wurde.

Hier beschreibt das Protokoll die Dezellularisierung von vaskularisierten freien Lappen unter Verwendung biologisch abgeleiteter ECM-Gerüste. Wir stellen die Dezellularisierung von drei klinisch relevanten Klappen vor: 1) das Omentum, 2) die Tensorfaszie lata und 3) den radialen Unterarm, die alle repräsentativ für Arbeitspferdeklappen sind, die routinemäßig in der rekonstruktiven Chirurgie verwendet werden und bisher nicht in Tierversuchen im Rahmen der Gewebedezellularisierung untersucht wurden. Diese biotechnologisch hergestellten Klappen bieten eine vielseitige und leicht verfügbare Plattform, die das Potenzial für klinische Anwendungen im Bereich der Reparatur und Rekonstruktion großer Weichteildefekte bietet.

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Protokoll

Alle Verfahren mit Tiermotiven wurden vom University Health Network Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt und werden in Übereinstimmung mit dem Protokoll und den Verfahren des University Health Network Animal Resource Centre und den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care durchgeführt. Für alle Experimente wurden fünf Yorkshire-Schweine (35-50 kg; Alter ca. 12 Wochen alt) verwendet.

1. Herstellung von Perfusionsbioreaktoren

1. Siehe Abbildung 1 für alle Komponenten, die im Perfusionsbioreaktor verwendet werden. Verwenden Sie für die Herstellung der Gewebekammer handelsübliche Polypropylen-Schnappverschlussbehälter mit wasserdichten und luftdichten Deckeln, die eine Silikondichtungsauskleidung enthalten. Stellen Sie sicher, dass die Behälter autoklavkompatibel sind.
2. Bohren Sie zwei 1/4-in-Löcher an den Seiten des Behälters und fädeln Sie ein kurzes Segment aus platinbeschichteten L/S-16-Silikonschläuchen ein. Ein Schlauch trägt das Zuflussperfusat und der andere ist für den Abfluss.
3. Für den Zuflussschlauch befestigen Sie einen männlichen Luer-Anschluss am inneren Teil, der zur Verbindung mit der Gewebekanüle verwendet wird. Befestigen Sie eine Luer-Buchse am äußeren Ende des Zulaufschlauchs, der zum Anschluss an einen Drei-Wege-Absperrhahn verwendet wird.
4. Bohren Sie ein einzelnes 1/4-Zoll-Loch auf den Kammerdeckel und fädeln Sie ein weiteres kurzes Segment des platinbeschichteten L/S-16-Silikonschlauchs ein. Dieser Schlauch dient als Entlüftung.
5. Machen Sie den Zu- und Abflussschlauch, indem Sie ca. 50 cm L/S-16 platinbeschichteten Silikonschlauch messen. Verbinden Sie ein Ende mit einem gelben Drei-Stufen-Pumpenschlauch und das andere Ende mit einer sterilen 2-ml-serologischen Pipette, um Perfusat aus den Reinigungsmittelbehältern in die Bioreaktorkammer zu transportieren.
6. Autoklavieren Sie alle Komponenten (Kammer und Schläuch) in einzeln verpackten sterilen Verpackungen.

Abbildung 1: Herstellung des Perfusionsbioreaktors. Der Perfusionsbioreaktor besteht aus (A) einer Kunststoff-Polypropylen-Gewebekammer (B) mit seitlichen Löchern, die gebohrt sind, um Perfusionsschläuche mit luft- und wasserdichtem Deckel aufzunehmen. (C) Absperrhähne sind an Schläuchen befestigt, um die Befestigung des Perfusionsschlauchs zu ermöglichen, der Dezellularisierungsmittel aus dem Waschmittelbehälter in einem Durchgang zum Abfall transportiert. (D) Kompatible Pumpenkassetten werden verwendet, um den Drei-Stufen-Schlauch mit der Schlauchpumpe zu verbinden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

2. Herstellung von Dezellularisierungslösungen

1. Herstellen einer heparinisierten normalen Kochsalzlösung (15 I.E./ml) durch Verdünnen von 1,5 ml 1000 I.E./ml Heparin-Stammlösung in 100 ml normaler Kochsalzlösung.
2. Bereiten Sie 0,05% w/v Natriumdodecylsulfat (SDS) -Lösung vor, indem Sie langsam 9 g SDS-Pulver zu 18 L autoklaviertem destilliert-entionisiertem Wasser geben. Verwenden Sie einen großvolumigen Polypropylen (PP)-Carboy, um die SDS-Lösung aufzunehmen. Die Lösung ist gebrauchsfertig, wenn sie vollständig aufgelöst ist. Bei Raumtemperatur lagern.
3. Bereiten Sie die Arbeitslösung DNase I vor. Zunächst wird lyophilisierte DNase I auf eine Stammkonzentration von 10 mg/ml mit 5 mM CaCl2 in sterilem_dH2Orekonstituiert. Lagerung der rekonstituierten Stamm-DNase I-Lösung als Aliquots in einem −20 °C-Gefrierschrank bis zur Gebrauchstauglichkeit. Am Tag der Anwendung wird DNase I 1:100 mit Mg++(1,29 mM) und Ca⁺⁺(1,98 mM) in sterilem_dH2Oauf eine Endkonzentration von 0,1 mg/ml verdünnt.
   HINWEIS: Die DNase-Aktivität verschlechtert sich, wenn sie nicht eingefroren gelagert wird. Für den enzymatischen Aufschluss von DNA bei Raumtemperatur sollte nur frisch arbeitende DNase-Lösung verwendet werden.
4. Bereiten Sie 1x PBS-Lösung vor, indem Sie 10x PBS-Schaft 1:10 mit sterilem autoklaviertem Wasser in einem 5 L Endvolumen in einem PP-Carboy verdünnen. Bei Raumtemperatur lagern.
5. Bereiten Sie 1% Antibiotika / Antimykotika (A / A) in PBS vor. 100x Antibiotika/Antimykotika 1:100 mit steriler 1x PBS-Lösung auf ein Endvolumen von 1 L verdünnen. Bei Raumtemperatur lagern.
6. 0,1% (v/v) Peressigsäure (PAA)/4% (v/v) Ethanol (EtOH) durch Zugabe von 3,13 mL PAA + 40 mL 100% Ethanol + 956 mL sterilem_dH2Oherstellen. Das endgültige Volumen auf 1.000 ml bringen und bei Raumtemperatur lagern.

3. Beschaffung von Schweineklappen

HINWEIS: Dies ist ein Terminalverfahren. Ein Schwein wurde verwendet, um alle drei Klappen zu beschaffen. Humane Euthanasierung des Tieres nach der Beschaffung aller Klappen.

1. Präoperative Versorgung
   1. Schnelle Schweine mindestens 12 h vor der Operation. Sedieren Sie die Tiere mit Ketamin (20 mg/kg intramuskulär, IM), Atropin (0,04 mg/kg IM) und Midazolam (0,3 mg/kg IM).
   2. Induktion der Anästhesie durch Inhalation von 5% Isofluran durch eine Maske mit einer Flussrate von 22-44 ml / kg / min für die periphere Line-Insertion und Intubation. Halten Sie die Anästhesie mit 0,5% -2% Isofluran bei 22-44 ml / kg / min aufrecht. Stellen Sie eine ausreichende Anästhesietiefe sicher, indem Sie die hämodynamische Stabilität überprüfen und fehlende Lid-/Pedalentzugsreflexe oder den Kiefermuskeltonus notieren, um ein angemessenes Maß an verabreichtem Anästhetikum anzugeben. Verabreichen Sie intravenös Remifentanil (10-20 μg/kg/h) kontinuierliche Infusion während der Operation zur Analgesie.
   3. Das Schwein wird mit einem geeigneten Endotrachealtubus (7-8 mm) intubiert und an ein Beatmungsgerät angeschlossen, das auf ein Tidalvolumen von 8 ml/kg, einen PEEP von 5 cm H 2 0,FiO₂ von 0,5 und eine Atemfrequenz von 14 eingestellt ist.
   4. Führen Sie einen 22 G Angiokatheterkatheter in die Ohrvene ein. Sobald der intravenöse (IV) Zugang erhalten ist, gießen Sie während des gesamten Verfahrens warme 0,9% normale Kochsalzlösung bei 5-10 ml / kg / h auf, um den mittleren arteriellen Druck zwischen 60 mmHg und 90 mmHg aufrechtzuerhalten.
   5. Überwachen Sie kontinuierlich die Herzfrequenz, die Pulsoximetrie und das endtidale CO₂. Beurteilen Sie Blutdruck und Körpertemperatur alle 5 Minuten.
   6. Tragen Sie Augensalbe auf, um Augentrockenheit während der Narkose zu verhindern. Bereiten Sie das gesamte Operationsfeld mit Povidon-Jod vor. Drapieren Sie das Operationsfeld mit sterilen Handtüchern.
2. Omentale Klappe
   1. Legen Sie das Schwein in Rückenlage und führen Sie eine xypho-Nabel-Laparotomie durch.
   2. Beim Betreten des Bauches mobilisieren Sie den Magenkopf, um das größere Omentum zu visualisieren. Legen Sie das Omentum vorsichtig in das Operationsfeld und identifizieren Sie die gastroepiploischen Gefäße, die entlang der größeren Krümmung des Magens verlaufen (Abbildung 2A).
   3. Beginnen Sie am linken Aspekt der größeren Krümmung, wo die linke gastro-epiploische Arterie mit der Milzarterie verbunden ist. Mit einer geraden Stevens-Tenotomieschere skelettieren Sie sowohl die linke gastro-epiploische Arterie als auch die Vene. Ligate teilt dann beide separat mit chirurgischen Bindern oder Clips.
   4. Gehen Sie entlang der größeren Krümmung des Magens von links nach rechts. Ligieren und teilen Sie die kurzen Gefäßäste, die aus dem Omentum hervorgehen und die größere Krümmung des Magens versorgen. Achten Sie darauf, den gastroepiploischen Hauptstiel des Omentums während dieses Schritts nicht zu verletzen.
   5. Setzen Sie die Mobilisierung des größeren Omentums fort, bis die Verbindung der rechten gastro-epiploischen Gefäße und der Arteria gastroduodenus angetroffen wird. Mit Clips oder Krawatten teilen Sie dann die rechte gastroepiploische Arterie und Venen separat, um den omentalen Lappen zu befreien.
   6. Nach der Befreiung kann das Omentum entlang der Mitte in zwei Hälften geteilt werden, wobei jede Hälfte von einer jeweiligen gastro-epiploischen Arterie und Vene begleitet wird. Dies ermöglicht die Beschaffung von zwei omentalfreien Klappen aus einem Tierbetrieb. Die gastro-epiploischen Gefäße einzeln mit einer 20-22 G Kanüle kanülieren und dann mit 3-0 Seidenkrawatten sichern.
   7. Heparinisierte Kochsalzlösung (15 I.E./ml) in die gastro-epiploische arterielle Kanüle spülen, bis ein deutlicher venöser Abfluss beobachtet wird.
3. Tensorfaszie lata Klappe
   HINWEIS: Das Protokoll basiert auf einer früheren Beschreibung des Schweinetensors fascia lata flap von Haughey et ^al.19. Die Modifikation wird vorgenommen, um nur den faszialen Teil der Tensorfaszie lata Lappe zu isolieren.
   1. Legen Sie das Schwein in die seitliche Dekubitusposition und rasieren Sie die gesamte obere Hinterbeine beidseitig. Bereiten Sie es mit den üblichen sterilen Verfahren vor und drapieren Sie es.
   2. Markieren Sie die vordere Grenze des Lappens mit einer Linie, die sich von der vorderen oberen Beckenwirbelsäule (ASIS) in Richtung der lateralen Patella erstreckt. Die Lage des Stiels ist ca. 6-8 cm vom ASIS entlang dieser Linie entfernt.
   3. Markieren Sie eine parallele hintere Linie, die etwa 8 cm bis 10 cm vom vorderen Schnitt entlang der Femurachse entfernt ist, um die Breite des Lappens einzubeziehen. Markieren Sie den distalen Rand der Klappe an der seitlichen Patella.
   4. Beginnen Sie die Dissektion am distalen Rand an der Patella mit einem scharfen Hautschnitt mit einem Skalpell. Vertiefen Sie den Hautschnitt mit Kauterisation durch das Unterhautgewebe, bis die Faszie über dem Rectus femoris angetroffen wird.
   5. Setzen Sie die Hautschnitte in Richtung ASIS entlang der oben beschriebenen markierten vorderen und hinteren Grenzen fort. Um den Fasziallappen allein zu isolieren, entfernen Sie die darüber liegende Hautkomponente von der darunter liegenden Faszienschicht. Ligate oder kauterisieren Sie kleine Perforatorgefäße auf die Haut.
   6. Kehren Sie zum distalen Rand des Lappens zurück und schneiden Sie die tiefe Faszie ein, um die Mobilisierung des darunter liegenden Musculus vastus lateralis zu ermöglichen. Mobilisieren Sie die Faszien in Richtung ASIS.
   7. Identifizieren Sie während der Mobilisation den Gefäßstiel, der zwischen den Muskeln vastus lateralis und rectus femoris austritt (Abbildung 2B). Achten Sie darauf, eine übermäßige Traktion zu vermeiden, um die Pedikelgefäße nicht zu verletzen.
   8. Sezieren Sie den proximalen Aspekt von der ASIS und schützen Sie gleichzeitig den Gefäßstiel. Sezieren, bis die Klappe ausreichend um ihren Stiel herum mobilisiert ist.
   9. Verfolgen Sie den Stiel zu den tiefen Femurgefäßen. Skelettieren Sie sowohl die Arteria circumflexa femoralis lateralis als auch die Vene, die den Fasziallappen versorgt. Ligate teilt dann beide Gefäße proximal, wo sie sich mit den tiefen Femurgefäßen verbinden.
   10. Cannulatieren Sie die Pedikelgefäße einzeln mit 20 G bis 24 G Angiokathetern, gesichert mit 3-0 Seidenbinden. Heparinisierte Kochsalzlösung (15 I.E./ml) in die arterielle Lappenkanüle spülen, bis ein deutlicher venöser Abfluss beobachtet wird.
4. Radiale Unterarmklappe
   HINWEIS: Das folgende Protokoll basiert auf einer veröffentlichten Beschreibung des Schweins radialen Unterarmlappenmodells von Khachatryan et ^al.20.
   1. Stellen Sie das Schwein in der seitlichen Dekubitusposition auf den Operationstisch. Positionieren Sie das abhängige Vorderbein innerhalb des Operationsfeldes.
   2. Markieren Sie einen ca. 3 cm x 3 cm großen Hautlappen quadratisch auf dem radialen Unterarm. Zeichne eine Linie zwischen dem Mittelpunkt des proximalen Lappenrandes und der Fossa antecubitalis, um den ungefähren Verlauf des radialen Arterienstiels zu bezeichnen. Bestätigen Sie den arteriellen Verlauf mit Palpation.
      HINWEIS: Im Schweinemodell befinden sich die radialen Gefäße relativ tiefer als beim Menschen. Ihre Lage liegt zwischen dem Flexor carpi radialis und Brachioradialis.
   3. Schneiden Sie die Haut mit einem Skalpell am distalen Aspekt mit einer Tiefe bis zur vorbrachialen Faszie ein. Stumpf mit der Tenotomieschere sezieren, bis man auf die Arteria radialis distal und ihre beiden Venae comitantes trifft. Ligieren Sie die Arterie und Venen mit chirurgischen Bindungen einzeln und teilen Sie sich.
   4. Setzen Sie die Hautschnitte am radialen und ulnaren Rand des markierten Hautquadrats fort. Mobilisieren Sie den Lappen vom darunter liegenden radialen Knochen mit einer chirurgischen Klinge, die von radialer bis ulnarer Richtung verläuft, und heben Sie gleichzeitig den Hautlappen proximal in Richtung der antekubitalen Fossa an.
      HINWEIS: Halten Sie eine subfasziale Dissektionsebene aufrecht, um sicherzustellen, dass der radiale Arterienstiel mit der darüber liegenden Hautschicht verbunden bleibt.
   5. Am proximalen Rand den Raum zwischen Brachioradialis und Flexor carpi radialis mit einem selbsthaltenden Retraktor zurückziehen, um die Arteria proximales radialis und ihre Venae comitantes freizulegen (Abbildung 2C).
   6. Mit einer Tenotomieschere skelettieren Sie die Arteria radialis und die Venae comitantes proximal an der Fossa antecubitalis, wo sie mit der Arteria brachialis bzw. den Venen verbunden sind. Sezieren Sie die Gefäße aus dem umgebenden Fibrofettgewebe, um eine ausreichende Pedikellänge von ca. 5-6 cm zu erreichen. Ligate und teilen Sie Arterie und Venen separat, um den radialen Unterarmlappen freizugeben.
   7. Cannulatieren Sie die Pedikelgefäße mit 20 G bis 24 G Angiokathetern, gesichert mit 3-0 Seidenkrawatten. Spülen Sie heparinisierte Kochsalzlösung (15 IE / ml) in die arterielle Kanüle des Lappens, bis ein deutlicher venöser Abfluss beobachtet wird.
   8. Nach der Lappenbeschaffung die Klappen in kalter Kochsalzlösung bei 4 °C aufbewahren, bis sie für die Dezellularisierung bereit sind. Unter tiefer Isofluran-Narkose werden die Tiere mit einer intravenösen Injektion von Kaliumchlorid (100 mg/kg IV) eingeschläfert. Bestätigen Sie den Tod durch das Fehlen von Vitalzeichen.

Abbildung 2: Beschaffung von drei vaskularisierten Schweinelappen . (A) Omentum. Die rechten (i) und linken (ii) gastroepiploischen Arterien sind im omentalen Lappen (iii) kanüliert. (B) Tensorfaszie lata. Der Stiel des Lappens (iv) ist der aufsteigende Ast der Arteria circumflexa femoralis lateralis (v). (C) Radiale Unterarmklappe. Die Beschaffung des radialen Unterarmlappens (vi) basiert auf der Arteria radialis und der Vena comitantes (vii) als Gefäßstiel (HINWEIS: Auf Vorhänge wurde zu Demonstrationszwecken verzichtet). Maßstabsbalken: 3 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

4. Einrichtung des Dezellularisierungssystems

1. Montieren Sie die Gewebekammer mit Klappen unter sterilen Bedingungen in einer Laminar-Flow-Biosicherheitswerkbank.
2. Befestigen Sie einen Drei-Wege-Absperrhahn sowohl an den Zu- als auch an den Abflussöffnungen des Bioreaktors. Befestigen Sie einen 0,2-μm-Filter an der Lüftungsöffnung am Deckel der Gewebekammer. Grundieren Sie den Zulaufschlauch mit steriler heparinisierter Kochsalzlösung, um Luftblasen zu eliminieren.
3. Legen Sie die Klappen in die Kammer. Verbinden Sie die Klappen mit sterilen Hämostaten über den Luer-Stecker mit dem Zulaufschlauch. Schrauben Sie die jeweilige arterielle Kanüle jeder Klappe auf den männlichen Luer und sorgen Sie für einen dichten Verschluss.
4. Spülen Sie heparinisierte Kochsalzlösung durch den Absperrhahn, um zu überprüfen, ob die Luer-Verbindung keine Lecks aufweist und ob die Klappen mit Anzeichen eines venösen Abflusses durchblutet werden können. Schließen Sie den Deckel der Gewebekammer.
5. Verbinden Sie den Zulaufschlauch mit einem gelben Drei-Stufen-Pumpenschlauch mit dem Zulaufhahn der Gewebekammer. Befestigen Sie außerdem einen Inline-Drucksensoraufnehmer am Dreiwegehahn für den Zufluss, um die Überwachung des Perfusionsdrucks zu ermöglichen.
6. Schalten Sie die Zulauf-Schlauchpumpe ein. Fahren Sie auf dem Einstiegsbildschirm mit der Pfeiltaste zur dritten Registerkarte fort, um die Schlauch-ID auf 1,85 mm einzustellen. Fahren Sie anschließend mit der zweiten Registerkarte fort, um die Perfusionsrate einzustellen. Eingangsrate als Lieferart und eingestellt auf 2 ml/min. Stellen Sie sicher, dass die Flussrichtung korrekt ist, wie auf dem Bildschirm angezeigt. Laden Sie den Drei-Stufen-Pumpenschlauch mit einer kompatiblen Kassette in die Schlauchpumpe.
7. Wiederholen Sie den Vorgang für die Ausströmschlauchpumpe ähnlich wie oben. Stellen Sie die Einstellung der Durchflusspumpe auf 4 ml/min ein. Verbinden Sie den Abflussschlauch mit einem gelben Drei-Stufen-Pumpenschlauch mit dem Abflusshahn der Gewebekammer. Laden Sie den Drei-Stufen-Pumpenschlauch mit einer kompatiblen Kassette in die Schlauchpumpe. Starten Sie den Durchfluss für beide Pumpen durch Drücken der Power-Taste .
   HINWEIS: Die höhere Rate der Ausströmpumpe ist eine entscheidende Sicherheitsmaßnahme, um ein Überlaufen der Gewebekammer zu verhindern und sicherzustellen, dass der Kammerausfluss während der Dezellularisierung immer den Zufluss übersteigt. Der gesamte zusammengesetzte Dezellularisierungsaufbau ist in Abbildung 3 dargestellt.

Abbildung 3: Zusammengebautes Perfusionsdezellularisierungssystem. (A) Schematische Darstellung des Perfusionsdezellularisierungssystems. Der Zulaufschlauch transportiert Perfusat aus dem Waschmittelreservoir in einem Durchgang mit Drucksensorüberwachung in die Gewebekammer. Der Abflussschlauch entfernt Perfusat aktiv aus der Gewebekammer in den Abfallbehälter. Schwarze Pfeile zeigen die Richtung des Perfusionsflusses an. Eine Schlauchpumpe wird mit der linken Pumpe verwendet, um den Zufluss zu steuern. Der Abfluss wird aktiv mit einer zweiten Schlauchpumpe durch den jeweiligen Schlauch abgeführt. Figur erstellt mit BioRender.com. (B) Foto des Perfusionsdezellularisierungssystems, das auf dem Arbeitstisch montiert ist, wobei die Einströmschlauchpumpe (i) mit den Gewebekammern (ii) und dann die Ausströmschlauchpumpe (iii) verbunden ist. Der Zulaufperfusatdruck wird vor dem Eintritt in die Gewebekammer mit einem Inline-Drucksensor (iv) überwacht. Hier werden drei Klappen parallel dezellularisiert. Sowohl das Waschmittel als auch die Abfallbehälter befinden sich unter der Tischplatte und sind nicht fotografiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

5. Dezellularisierung von Schweineklappen

1. Führen Sie alle folgenden Schritte zur Perfusionsdezellularisierung bei Raumtemperatur durch. Eine Zusammenfassung der Perfusionsraten und -dauern finden Sie in Tabelle 1. Beginnen Sie die Perfusion der heparinisierten Kochsalzlösung bei 2 ml / min mit einer Peristaltikpumpe und perfundiert Sie die Lappen mit heparinisierter Kochsalzlösung in der Gewebekammer für 15 Minuten, um alle zurückgehaltenen Blutgerinnsel zu entfernen.
2. Nach Abschluss der heparinisierten Salzperfusion die Restsalzlösung in der Gewebekammer absaugen. Füllen Sie die Gewebekammer mit ca. 500 ml SDS-Dezellularisierungslösung, um die Klappe ausreichend einzutauchen.
3. Übertragen Sie den Zulaufschlauch in die SDS-Dezellularisierungslösung und perfundiert Sie das Gewebe mit 2 ml/min. Die Dauer der Perfusion variiert je nach Lappen; Perfusion SDS für 2 Tage für Omentum, 3 Tage für Tensorfaszie und 5 Tage für radialen Unterarm Faszien-Hautlappen.
4. Nach Abschluss der SDS-Dezellularisierung aspirieren Sie das vorhandene SDS-Perfusat, das in der Gewebekammer enthalten ist. Den Zulaufschlauch in 1x PBS-Lösung überführen und die Klappen 1 Tag lang bei 2 ml/min durchbluten.
5. Entfernen Sie die vorherige PBS-Lösung, und übertragen Sie den Zulaufschlauch in die DNase-Arbeitslösung. Durchblutung für 2 h bei 2 ml/min. Entfernen Sie die DNase-Lösung aus der Gewebekammer und legen Sie den Zulaufschlauch in 1x PBS-Lösung. Tauchen Sie das Gewebe mit 1x PBS-Lösung in die Kammer und perfusionieren Sie 1x PBS-Lösung für 1 Tag bei 2 ml/min.
6. Sterilisieren Sie die Klappen mit PAA/EtOH-Lösung. Den Zulaufschlauch in PAA/EtOH in dH2O-Lösungüberführen und das Gewebe in dieselbe Lösung tauchen. PAA/EtOH bei 2 ml/min für 3 h durchbluten. Sobald die PAA/EtOH-Sterilisation abgeschlossen ist, trennen Sie den Schlauch von den Dreiwege-Absperrhähnen.
7. Entfernen Sie die Klappen aseptisch und legen Sie die sterilen Instrumente in PBS, das 1% Antibiotika / Antimykotika (A / A) enthält. Tauchen Sie die Klappen mit PBS + 1% A / A für 15 Minuten in zwei separate Wäschen, um Restsäure vollständig zu neutralisieren. Halten Sie die Klappen in PBS + 1% A/A bei 4 °C, bis sie für die Rezellularisierung bereit sind.
8. Überprüfen Sie die Sterilität der Gerüste, indem Sie eine Tupferkultur auf Agarplatten durchführen und auf mikrobielles Wachstum untersuchen. Beimpfen Sie Agarplatten mit Tupfern von jeder Lappenoberfläche. Die Agarplatten bis zu 2 Wochen bei 37 °C kultivieren. Sterilität wird durch das Fehlen von mikrobiellem Koloniewachstum nachgewiesen.

Tabelle 1: Zusammenfassung der Parameter des Perfusions-Dezellularisierungsprotokolls. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

6. Bewertung der Dezellularisierung

1. Mit einer Stanzbiopsie werden Proben von 3 mm bis 10 mm Dicke aus den Klappen entnommen.
2. Für die Histologie fixieren Biopsien in histologischen Kassetten in normalem gepuffertem Formalin für 24 h bei Raumtemperatur.
3. Waschen Sie die Biopsiekassetten 15 Minuten lang in Wasser oder PBS und legen Sie sie dann in 70% Ethanol, bis sie für die Gewebeverarbeitung bereit sind. Verarbeiten Sie die Kassetten in einem Tissue-Prozessor nach Standardprotokollen.
4. Die Biopsien in Paraffin einbetten, so dass sich das Wachs für 10-15 min auf einer kalten Platte verfestigen kann. Paraffinblöcke auf einem Mikrotom bis 5 μm Dicke schneiden. Färben Sie die Objektträger mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gemäß Standardprotokollen. Bilden Sie die Objektträger des Gewebes mit Lichtmikroskopie ab.
5. Zur Quantifizierung des DNA-Gehalts erhalten Sie das Trockengewicht der Gewebebiopsien nach nächtlicher Gewebetrocknung in einem Ofen bei 60 °C. Die Proben werden über Nacht in einem Papain-Extraktionspuffer bei 65 °C aufgeschlossen. Zentrifugieren Sie die aufgeschlossenen Proben bei 10.000 x g und überführen Sie den Überstand in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen. Bestimmen Sie den DNA-Gehalt mit einem handelsüblichen DNA-Extraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.

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Ergebnisse

Dieses Protokoll zur Dezellularisierung vaskularisierter Schweinelappen beruht auf der Durchblutung eines ionenbasierten Waschmittels, SDS, durch das Klappengefäßsystem in einem maßgeschneiderten Perfusionsbioreaktor. Vor der Dezellularisierung wurden drei vaskularisierte Lappen in einem Schweinemodell beschafft und entsprechend ihrer Hauptversorgungsgefäße kanüliert. Die Klappen wurden sofort nach der Beschaffung gespült, um ein patentiertes, durchlässiges Gefäßsystem aufrechtzuerhalten, das eine erfolgreiche ...

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Diskussion

Das vorgeschlagene Protokoll verwendet die Perfusion von SDS mit niedriger Konzentration, um eine Reihe von Schweineklappen zu dezellularisieren. Mit diesem Verfahren können azelluläres Omentum, Tensor fascia lata und radiale Unterarmlappen erfolgreich mit einem Protokoll dezellularisiert werden, das SDS mit niedriger Konzentration begünstigt. Vorläufige Optimierungsexperimente haben ergeben, dass SDS bei einer niedrigen Konzentration (0,05%) zwischen 2 Tagen und 5 Tagen in der Lage ist, Zellmaterial für das Omentum...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm pore Acrodisk Filter	VWR	CA28143-310
0.9 % Sodium Chloride Solution (Normal Saline)	Baxter	JF7123
20 L Polypropylene Carboy	Cole-Parmer	RK-62507-20
3-0 Sofsilk Nonabsorbable Surgical Tie	Covidien	LS639
3-way Stopcock	Cole-Parmer	UZ-30600-04
Adson Forceps	Fine Science Tools	11027-12
Antibiotic-Antimycotic Solution, 100X	Wisent	450-115-EL
Atropine Sulphate 15 mg/30ml	Rafter 8 Products	238481
BD Angiocath 20-Gauge	VWR	BD381134
BD Angiocath 22-Gauge	VWR	BD381123
BD Angiocath 24-Gauge	VWR	BD381112
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	C4901	DNAse Co-factor
DNase I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	DN25
DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit)	Invitrogen	P7589
DPBS, 10X	Wisent	311-415-CL	without Ca++/Mg++
Halsted-Mosquito Hemostat	Fine Science Tools	13008-12
Heparin, 1000 I.U./mL	Leo Pharma A/S	453811
Ketamine Hydrochloride  5000 mg/50 ml	Bimeda-MTC Animal Health Inc.	612316
Ismatec Pump Tygon 3-Stop Tubing	Cole-Parmer	RK-96450-40	Internal Diameter:  1.85 mm
Ismatec REGLO 4-Channel Pump	Cole-Parmer	78001-78
Ismatec Tubing Cassettes	Cole-Parmer	RK-78016-98
Isoflurane 99.9%, 250 ml	Pharmaceutical Partners of Canada Inc.	2231929
LB Agar Lennox	Bioshop Canada	LBL406.500	Sterility testing agar plates
Magnesium Sulfate	Sigma-Aldrich	M7506	DNAse Co-factor
Masterflex L/S 16 Tubing	Cole-Parmer	RK-96410-16
Midazolam 50 mg/10 ml	Pharmaceutical Partners of Canada Inc.	2242905
Monopolar Cautery Pencil	Valleylab	E2100
Normal Buffered Formalin, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128
N°11 scalpel blade	Swann Morton	303
Papain from papaya latex	Sigma-Aldrich	P3125
Peracetic Acid	Sigma-Aldrich	269336
Plastic Barbed Connector for 1/4" to 1/8" Tube ID	McMaster-Carr	5117K61
Plastic Barbed Tube 90° Elbow Connectors	McMaster-Carr	5117K76
Plastic Quick-Turn Tube Plugs	McMaster-Carr	51525K143	Male Luer
Plastic Quick-Turn Tube Sockets	McMaster-Carr	51525K293	Female Luer
Punch Biopsy Tool	Integra Miltex	3332
Potassium Chloride 40 mEq/20 ml	Hospira Healthcare Corporation	37869
Povidone-Iodine, 10%	Rougier	833133
Serological Pipet, 2mL	Fisher Science	13-678-27D
Snap Lid Airtight Containers	SnapLock	142-3941-4
Sodium Dodecyl Sulfate Powder	Sigma-Aldrich	L4509
Surgical Metal Ligation Clips, Small	Teleflex	001200
Stevens Tenotomy Scissors, 115 mm, straight	B. Braun	BC004R
TruWave Pressure Monitoring Set	Edwards Lifesciences	PX260