Beschaffung und Dezellularisierung von Rattenhinterbeinen mit einem Ex-vivo-Perfusions-basierten Bioreaktor für die vaskularisierte Komposit-Allotransplantation

Zusammenfassung

Wir beschreiben die Operationstechnik und den Dezellularisierungsprozess für zusammengesetzte Rattenhinterbeine. Die Dezellularisierung erfolgt unter Verwendung von Natriumdodecylsulfat mit niedriger Konzentration durch ein Ex-vivo-Maschinenperfusionssystem.

Zusammenfassung

Patienten mit schweren traumatischen Verletzungen und Gewebeverlust benötigen eine komplexe chirurgische Rekonstruktion. Vaskularisierte Komposit-Allotransplantation (VCA) ist ein sich entwickelnder rekonstruktiver Weg zum Transfer mehrerer Gewebe als zusammengesetzte Untereinheit. Trotz der vielversprechenden Natur von VCA sind die langfristigen immunsuppressiven Anforderungen aufgrund des erhöhten Risikos von Malignomen, Endorgantoxizität und opportunistischen Infektionen eine signifikante Einschränkung. Das Tissue Engineering von azellulären Kompositgerüsten ist eine mögliche Alternative zur Verringerung des Bedarfs an Immunsuppression. Hierin wird die Beschaffung eines Rattenhinterbeins und dessen anschließende Dezellularisierung unter Verwendung von Natriumdodecylsulfat (SDS) beschrieben. Die vorgestellte Beschaffungsstrategie basiert auf der Arteria femoralis. Ein maschinelles perfusionsbasiertes Bioreaktorsystem wurde konstruiert und zur ex vivo Dezellularisierung der Hinterbeine eingesetzt. Eine erfolgreiche Perfusionsdezellularisierung wurde durchgeführt, was zu einem weißen, durchscheinenden Aussehen der Hinterbeine führte. Ein intaktes, perfusierbares, vaskuläres Netzwerk in der gesamten Hinterbeine wurde beobachtet. Histologische Analysen zeigten die Entfernung von Kerninhalten und die Erhaltung der Gewebearchitektur über alle Gewebekompartimente hinweg.

Einleitung

VCA ist eine neue Option für Patienten, die eine komplexe chirurgische Rekonstruktion benötigen. Traumatische Verletzungen oder Tumorresektionen führen zu einem volumetrischen Gewebeverlust, der schwer zu rekonstruieren ist. VCA bietet die Transplantation mehrerer Gewebe wie Haut, Knochen, Muskeln, Nerven und Gefäße als zusammengesetztes Transplantat von einem Spender an einen Empfänger^an 1. Trotz seiner vielversprechenden Natur ist VCA aufgrund langfristiger immunsuppressiver Therapien begrenzt. Der lebenslange Gebrauch solcher Medikamente führt zu einem erhöhten Risiko für opportunistische Infektionen, Malignome und Endorgantoxizität ^1,2,3. Um die Notwendigkeit einer Immunsuppression zu reduzieren und / oder zu eliminieren, sind Tissue-Engineering-Gerüste mit Dezellularisierungsansätzen für VCA vielversprechend.

Die Dezellularisierung des Gewebes beinhaltet die Beibehaltung der extrazellulären Matrixstruktur bei gleichzeitiger Entfernung des zellulären und nukleären Inhalts. Dieses dezellularisierte Gerüst kann mit patientenspezifischen Zellen wieder bevölkert werden⁴. Die Erhaltung des ECM-Netzwerks aus zusammengesetzten Geweben ist jedoch eine zusätzliche Herausforderung. Dies ist auf das Vorhandensein mehrerer Gewebetypen mit unterschiedlichen Gewebedichten, Architekturen und anatomischen Positionen innerhalb eines Gerüsts zurückzuführen. Das vorliegende Protokoll bietet eine Operationstechnik und eine Dezellularisierungsmethode für eine Rattenhinterbeine. Dies ist ein Proof-of-Concept-Modell für die Anwendung dieser Tissue-Engineering-Technik auf zusammengesetzte Gewebe. Dies kann auch zu nachfolgenden Bemühungen führen, Kompositgewebe durch Rezellularisierung zu regenerieren.

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Protokoll

Leichenförmige männliche Lewis-Ratten (300-430 g), die vom Toronto General Hospital Research Institute erhalten wurden, wurden für alle Experimente verwendet. Für alle chirurgischen Eingriffe wurden sterile Instrumente und Verbrauchsmaterialien verwendet, um die aseptische Technik aufrechtzuerhalten (siehe Materialtabelle). Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Animal Care Committee am Toronto General Hospital Research Institute, University Health Network (Toronto, ON, Kanada) durchgeführt. Insgesamt vier Hinterbeine waren dezellularisiert.

1. Präoperative Vorbereitung

1. Bereiten Sie 50 ml 5% heparinisierte Kochsalzlösung vor. Aus einem 50-ml-Kochsalzbeutel 2,5 ml Kochsalzlösung mit einer 5-ml-Spritze entnehmen und entsorgen. Geben Sie mit einer 5-ml-Spritze 2,5 ml Heparin in den Kochsalzbeutel. Drehen Sie den Kochsalzbeutel um, um den Inhalt zu mischen.
2. Legen Sie eine Leichenratte in Rückenlage unter ein blaues Pad. Rasieren Sie die Hinterbeine und die Leistengegend umlaufend mit einem Elektrorasierer und entfernen Sie Haare.
3. Bringen Sie die Ratte zur chirurgischen Station und tragen Sie Povidone Jodpeelinglösung mit einer Gaze auf die Hinterbeine und die Leistengegend auf. Anschließend 70% Isopropylalkohol auftragen, um die Peelinglösung mit Gaze abzuwischen.
4. Entsorgen Sie das blaue Pad aus Schritt 1.2 und wechseln Sie in neue, sterile Handschuhe.

2. Beschaffung der Hinterbeine der Ratte

1. Machen Sie einen Hautschnitt mit einer chirurgischen Klinge # 10 und einem Klingenläufer # 3 entlang der Leistenbandebene und bewegen Sie sich von einer lateralen in eine mediale Richtung (Abbildung 1A). Verwenden Sie Adson-Pinzetten, um die umgebende Haut zu halten, um einen glatten Schnitt zu gewährleisten.
2. Wenn das darunter liegende Fett freigelegt ist, verwenden Sie eine stumpfe Dissektion, um das Fett vorsichtig zu sezieren. Lokalisieren Sie die oberen epigastrischen Gefäße.
3. Verwenden Sie eine Mikroschere, um in der Nähe zu sezieren und den darunter liegenden Oberschenkelnerv, die Arterie und die Vene auf der Ebene des Leistenbandes freizulegen.
4. Identifizieren Sie unter einem Dissektionsmikroskop die Femurgefäße und sezieren Sie Arterie und Vene proximal mit feinen Pinzetten, um eine ausreichende Länge von den Bifurkationspunkten des arteriellen Netzwerks zu erhalten (Abbildung 1B).
5. Ligieren Sie die Oberschenkelarterie und die Vene separat mit 6-0-Nähten.
6. Führen Sie eine umlaufende Dissektion um den Rest der Hinterbeine durch, ohne die ligierten Femurgefäße zu stören.
7. Transektieren Sie den Oberschenkelknochen in der Mitte mit einem Knochenschneider.
8. Um die Hinterbeine vollständig zu isolieren, transektieren Sie die ligierten Femurgefäße unterhalb der Ligaturen mit einer Mikroschere.
9. Cannulatieren Sie die Oberschenkelarterie mit einem 24 G Angiokatheter unter dem Dissektionsmikroskop. Verwenden Sie eine feine Pinzette, um die Kanüle vorsichtig einzuführen. Mit heparinisierter Kochsalzlösung spülen, bis ein deutlicher Abfluss aus der Oberschenkelvene beobachtet wird.
10. Sichern Sie die Kanüle, indem Sie eine Naht um das kanülierte Gefäß und eine andere Naht distal um die Kanüle selbst binden. Stellen Sie sicher, dass die Kanüle proximal platziert ist, um eine Blockierung der Gabelungspunkte zu vermeiden.
11. Tauchen Sie die beschafften Hinterbeine bis zur Dezellularisierung in phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS).

Abbildung 1: Beschaffung der Hinterbeine der Ratte. (A) Markierung des Hautschnitts auf der Ebene des Leistenbandes von lateral nach medial. (B) Blick auf die Vena femoralis und die Arteria femoralis, die in der Nähe des Leistenbandes seziert wurden, angezeigt durch die gestrichelte Linie. Abkürzungen: L = lateral; M = medial; FV = Vena femoralis; FA = Arteria femoralis. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

3. Vorbereitung von Lösungen

1. In einem 6-L-Glaskolben wird ein 5-L-Waschmittelreservoir mit 0,25%igem Natriumdodecylsulfat (SDS) hergestellt, indem 12,5 g SDS-Pulver in 5 l hochreinem destilliertem Wasser gelöst werden. Decken Sie die Öffnung des Kolbens mit Parafilm ab, um ihn zu verschließen.
2. In einem 1-l-Glasgefäß 1 l 0,25%ige SDS-Lösung separat vorbereiten, indem 2,5 g SDS in 1 L hochreines destilliertes Wasser gelöst werden. Fügen Sie einen Rührbalken hinzu, um die Lösung auf einem Magnetrührer zu mischen, bis sich das gesamte SDB aufgelöst hat.
3. Bereiten Sie 1 L 1x PBS-Waschlösung mit 1% iger Antibiotika-Antimykotikum (AA) -Lösung vor. In einem 1-L-Kolben werden 990 ml 1x PBS-Lösung und 10 ml AA hinzugefügt.
4. Separat in einem 500-ml-Glasgefäß 1x PBS + 1% AA-Lösung erneut mit 495 ml 1x PBS-Lösung und 5 ml AA zubereiten.
5. Bereiten Sie 200 ml 1% Peressigsäure (PAA)/4% Ethanol (EtOH) Lösung vor. Bereiten Sie diese Lösung unter einem Abzug vor.

4. Aufbau von Bioreaktor und Perfusionskreislauf

HINWEIS: In Abbildung 2 finden Sie die Konfiguration des Bioreaktors und des Perfusionskreislaufs während der aufgeführten Schritte.

1. Bohren Sie in einer 500-ml-Kammer (Kunststoffbehälter) drei Löcher (1/4 Zoll) an den in Abbildung 2 gekennzeichneten Stellen: Anschluss A ist die Einlassleitung, Anschluss B ist die Nachfüllleitung und Anschluss C ist die Auslassleitung. Entfernen und entsorgen Sie überschüssiges Plastik. Besprühen und wischen Sie die Kammer mit 70% Ethanol ab.
2. Schneiden Sie drei 5 cm lange Silikonschläuche ab und führen Sie einen halb in jeden Port der Kammer ein. Schließen Sie einen Luer-Stecker an der Öffnung von Port A zur Innenseite der Kammer und eine Luer-Buchse am anderen Ende der Röhre außerhalb der Kammer an.
3. Schließen Sie eine Luer-Buchse an Port B und Port C an den Enden der Röhren an, die aus der Kammer zeigen.
4. Bohren Sie in einem luftdichten Deckel für den Kunststoffbehälter ein Loch auf die Oberfläche des Deckels.
5. Schneiden Sie einen 3 cm langen Silikonschlauch und führen Sie ihn in das Loch des Deckels ein. Stellen Sie sicher, dass sich etwa 2 cm des Röhrchens außerhalb des Deckels befinden, wie in Abbildung 2 dargestellt.
6. Sterilisieren Sie sowohl die Kammer als auch den Deckel mit dem Schlauch.
7. Schneiden Sie zwei 30 cm Silikonschläuche mit einer Schere ab. Schließen Sie einen 1/16-Zoll-Anschluss an einem Ende jeder Röhre an einen 1/8-Zoll-Anschluss an.
8. Schneiden Sie separat zwei 12 cm Silikonschläuche mit einer Schere ab. Schließen Sie einen 1/16-Zoll-Anschluss an einen 1/8-Zoll-Stecker an einem Ende beider Röhren an. Schließen Sie einen Luer-Stecker am anderen Ende einer Röhre und eine Luer-Buchse an die andere Röhre an.
9. Sterilisieren Sie das gesamte Schlauchmaterial aus Schritt 4.7 und Schritt 4.8. Schließen Sie zwei 3-Stufen-Pumpenschläuche (1,85 mm) in die Sterilisation ein.
10. Bereiten Sie drei 3-Wege-Absperrhähne, einen Spritzenfilter, zwei serologische 1-ml-Pipetten und eine 10-ml-Spritze für den Dezellularisierungsaufbau vor. Entfernen Sie den Filter von den 1-ml-serologischen Pipetten.

Abbildung 2: Vorbereitung der Konstruktion des Bioreaktors und des Perfusionskreislaufs. Gezeigte Vorrichtung des Perfusionskreislaufs einschließlich (A) Schlauchpumpe und (B) entsprechender Kassetten für Einlass- und Auslassleitungen. (C, D) Silikonschläuche von 12 cm und 30 cm werden ebenfalls mit entsprechenden Verbindern gezeigt. (E) Schlauch für Schlauchpumpe (1,85 mm). Bioreaktorkammer mit beschrifteten Anschlüssen für (F) Zufluss, (G) Nachschuböffnung und (H) Abfluss. (I) Bioreaktordeckel mit Lüftungsöffnung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

5. Dezellularisierung der Hinterbeine von Ratten

1. Platzieren Sie die sterilisierte Kammer und schrauben Sie drei Einweg-3-Wege-Absperrhähne an den Einlass-, Auslass- und Nachfüllleitungen. Stellen Sie sicher, dass der Absperrhahn für den Nachschubanschluss an den verbleibenden zwei Anschlüssen verschlossen ist, um ein Auslaufen zu verhindern.
2. Befestigen Sie die in Schritt 4.8 hergestellten Rohre an den Absperrhähnen an den Ein- und Auslassleitungen.
3. Verbinden Sie den Schlauch mit den Schläuchen im obigen Schritt. Befestigen Sie die Kassette am Schlauch und legen Sie sie auf die Schlauchpumpe. Sichern Sie die Kassetten noch nicht mit einem Schlauch.
4. Verbinden Sie ein Rohr von Schritt 4.7 mit dem Ende des Schlauchs der Auslassleitung aus dem obigen Schritt. Schließen Sie am anderen Ende eine 1-ml-serologische Pipette an. Hängen Sie das mit einer serologischen Pipette befestigte Ende in den Abfallbehälterkolben.
5. Wiederholen Sie Schritt 4.7 für die Einlassleitung. Hängen Sie das Ende des Röhrchens, das an der serologischen Pipette befestigt ist, in den Waschmittelbehälter auf. Verschließen Sie die Öffnung des Waschmittelbehälterkolbens sofort mit Parafilm. Siehe Abbildung 3A,B für eine Übersicht über den Dezellularisierungskreislauf.
6. 0,25% SDS aus dem 1-Liter-Glas (Schritt 3.2) auf halber Höhe in die Bioreaktorkammer geben.
7. Nehmen Sie das beschaffte Hinterbein mit einer Adson-Pinzette und hängen Sie es vorsichtig in die Bioreaktorkammer.
8. Verwenden Sie zwei Paar Adson-Pinzetten, um den kanülierten Teil der Hinterbeine zur Einlasslinie zu führen. Während Sie die Kanüle mit einer Pinzette halten, verwenden Sie die andere Pinzette, um die Einlassleitung an der Kanüle zu drehen und zu befestigen. Stellen Sie sicher, dass die Kanüle nicht gezogen oder verdreht wird, um eine Dekanülierung zu verhindern.
9. Nach dem Sichern fügen Sie weitere 0,25% SDS aus dem 1-Liter-Glasgefäß hinzu, um die Extremität nach Bedarf vollständig einzutauchen. Stellen Sie sicher, dass der Auslassanschluss ebenfalls in den Bioreaktorbehälter eingetaucht ist, um sicherzustellen, dass ein gleichmäßiger Abfluss aufrechterhalten wird (Abbildung 3C).
10. Befestigen Sie einen Einwegspritzenfilter an der Belüftungsöffnung am Deckel der Bioreaktorkammer unter Bezugnahme auf Schritt 4.4 und Schritt 4.5.
11. Befestigen Sie den Deckel am Bioreaktor, und stellen Sie sicher, dass die Kammer von allen Seiten abgedichtet ist (Abbildung 3B).
12. Um Luft aus dem Schlauch zu entfernen und den Perfusionskreislauf anzusaugen, verwenden Sie eine neue 10-ml-Einwegspritze, um das Reinigungsmittel mit dem 3-Wege-Absperrhahn an der Einlassleitung aus dem Waschmittelbehälter zu ziehen.
13. Verwenden Sie nach dem Ziehen die gleiche Flüssigkeit, um sie in den 3-Wege-Absperrhahn an der Auslassleitung einzuführen. Stellen Sie sicher, dass sich im gesamten Schlauch sowohl an den Einlass- als auch an den Auslassleitungen Reinigungsmittel befindet.
14. Drücken Sie die Kassetten nach unten und befestigen Sie sie mit dem Schlauch in der Schlauchpumpe. Schalten Sie die Schlauchpumpe mit dem Netzschalter ein.
    1. Fahren Sie auf dem Bildschirm der Schlauchpumpe mit der Pfeiltaste zur zweiten Registerkarte fort, um die Perfusionsrate für den ersten Kanal einzustellen. Eingangsdurchfluss als Lieferart und Einstellung der Perfusionsrate auf 1 ml/min. Stellen Sie sicher, dass die Strömungsrichtung entsprechend der Geräteeinrichtung korrekt ist. Wiederholen Sie diesen Vorgang für den zweiten Kanal.
    2. Kalibrieren Sie die Schlauchpumpe, um sicherzustellen, dass die Flüssigkeitsmenge, die durch die Einlassleitung abgegeben und/oder aus der Auslassleitung entnommen wird, mit einer konsistenten Rate zwischen den beiden fließt. Stellen Sie sicher, dass die Schlauch-ID auf 1,85 mm eingestellt ist.
15. Beginnen Sie mit der Dezellularisierung über die Maschinenperfusion bei 1 ml / min sowohl für die Einlass- als auch für die Ausgangsleitungen, indem Sie den Netzschalter auf der Tastatur drücken. Überwachen und stellen Sie sicher, dass der Durchfluss sowohl an den Einlass- als auch an den Auslassleitungen konsistent und kontinuierlich ist.
16. Setzen Sie die Dezellularisierung fort und überwachen Sie sie täglich. Verwenden Sie den 1 L 0,25% SDS (Schritt 3.2), um das Bioreaktorreservoir nach Bedarf durch den Nachfüllanschluss aufzufüllen. Suchen Sie nach einem weißen, durchscheinenden Aussehen des Gewebes, das am Tag 5 erscheint, was auf eine Dezellularisierung der Hinterbeine der Ratte hinweist.

Abbildung 3: Überblick über den Perfusionsdezellularisierungs-Bioreaktorkreislauf der Rattenhinterbeine . (A) Schematische Darstellung des Bioreaktor-Perfusionskreislaufs. Blaue Pfeile zeigen die Richtung des Waschmittel- und Abfallflusses an. (B) Überblick über den Dezellularisierungskreislauf mit Bioreaktor mit Rattenhinterbein. Das SDS-Reservoir (linker Kolben) führt in die Schlauchpumpe und in den Einlassschlauch des Bioreaktors. Der Abfluss wird durch die Schlauchpumpe mit dem Abfallbehälter (rechter Kolben) verbunden. (C) (I) Bioreaktor mit Rattenhinterbein mit Einlassschläuchen, die mit der Kanülenarterie femoralisiert verbunden sind. (II) Auffüllen des Anschlusses in der Ecke für die Perfusion von Reinigungsmittel. (III) Abflussrohre, die im Aufhängungsbehälter aufgehängt sind. Abkürzung: SDS = Natriumdodecylsulfat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

6. Waschen und Sterilisieren nach der Dezellularisierung

1. Nach der Bestätigung der Dezellularisierung ersetzen Sie den Waschmittelbehälter durch den 1x PBS + 1% AA-Behälter. Die Öffnung des Kolbens wird mit Parafilm verschlossen. Beginnen Sie 1x PBS + 1% AA Perfusion bei 1 ml / min und fahren Sie für 2 Tage fort.
2. Ersetzen Sie das 1x PBS + 1% AA-Reservoir durch 200 ml 0,1% PAA/4% EtOH-Reservoir und beginnen Sie mit der Perfusion bei 1 ml/min für 2 h.
3. Trennen Sie die Hinterbeine von der Einlassleitung mit zwei Paaren steriler Adson-Pinzetten, wobei eine Pinzette die Einlasslinie dreht und die andere die Kanüle hält. Stellen Sie sicher, dass die Kanüle nicht gezogen wird, um eine Dekanülierung zu verhindern.
4. Lagern Sie die Extremität bis zur weiteren Verwendung in einem 500 ml Glasgefäß mit 1x PBS + 1% AA bei 4 °C.

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Ergebnisse

Das Beschaffungsprotokoll war erfolgreich bei der Isolierung und Kanülierung der gemeinsamen Oberschenkelarterien für nachfolgende Perfusionsschritte. Die repräsentativen Dissektionsbilder in Abbildung 1A,B zeigen die Inzisionslage und Exposition der Femurgefäße mit ausreichendem Abstand zu den Bifurkationspunkten. Abbildung 2 zeigt die Apparatur, die für die Vorbereitung des Bioreaktors und des Perfusionskreislaufs erforderlich ist. Der ...

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Diskussion

Rattenhinterbeine sind als experimentelle Modelle in VCA⁵ nützlich. Das Tissue Engineering von azellulären Gerüsten stellt den ersten Schritt dar, um die Mängel langfristiger Immunsuppressionsregime im Zusammenhang mit VCA zu beheben. Die Verwendung von Komposittransplantaten stellt eine zusätzliche Herausforderung dar, da mehrere Gewebe vorhanden sind, von denen jedes einzigartige funktionelle, immunogene und strukturelle Eigenschaften aufweist. Das vorliegende Protokoll zeigt eine erfolgrei...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride Injection USP 50 mL	Baxter Corporation	JB1308M
1 mL Disposable Serological Pipets	VWR	75816-102
10 cc Disposable Syringes			Obtained from Research Institution
3-way Stopcock			Obtained from Research Institution
5cc Disposable Syringes			Obtained from Research Institution
70% Isopropyl Alcohol			Obtained from Research Institution
Acrodisc Syringe Filter 0.2 µm	VWR	CA28143-310
Adson Forceps, Straight	Fine Science Tools	11006-12
Angiocatheter 24 G 19 mm (¾”)	VWR	38112
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) 100 mL	Multicell	450-115-EL
Bone Cutter	Fine Science Tools	12029-12
Connectors for  1/16" to 1/8" Tubes	McMasterCarr	5117K52
Female Luer to barbed adapter (PVDF) - 1/8" ID	McMasterCarr	51525K328
Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Fine Forceps with Micro-Blunted Tips	Fine Science Tools	11253-20
Heparin Sodium Injection 10,000 IU/10 mL	LEO Pharma Inc.	006174-09
Male Luer to barbed adapter (PVDF) - 1/8" ID	McMasterCarr	51525K322
Micro Needle Holder	WLorenz	04-4125
Microscissors	WLorenz	SP-4506
Peracetic Acid	Sigma Aldrich	269336-100ML
Peristaltic Pump, 3-Channel	Cole Parmer	RK-78001-68
Phosphate Buffered Saline 1x 500 mL	Wisent	311-425-CL
Povidone Surgical Scrub Solution			Obtained from Research Institution
Pump Tubing, 3-Stop, Tygon E-LFL	Cole Parmer	RK-96450-40
Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone	Cole Parmer	RK-96410-16
Scalpel Blade - #10	Fine Science Tools	10010-00
Scalpel Handle - #3	Fine Science Tools	10003-12
Sodium Dodecyl Sulfate Reagent Grade: Purity: >99%, 1 kg	Bioshop	SDS003.1
Surgical Suture #6-0	Covidien	VS889