Die Peel-Blot-Technik: Eine Kryo-EM-Probenvorbereitungsmethode zur Trennung einzelner Schichten von mehrschichtigen oder konzentrierten biologischen Proben

Zusammenfassung

Die Peel-Blot-Technik ist eine Kryo-EM-Gittervorbereitungsmethode, die die Trennung von mehrschichtigen und konzentrierten biologischen Proben in einzelne Schichten ermöglicht, um die Dicke zu reduzieren, die Probenkonzentration zu erhöhen und die Bildverarbeitung zu erleichtern.

Zusammenfassung

Die Peel-Blot-Kryo-EM-Gittervorbereitungstechnik ist eine deutlich modifizierte Rückinjektionsmethode mit dem Ziel, eine Reduzierung der Schichten von mehrschichtigen Proben zu erreichen. Diese Entfernung von Schichten vor dem Einfrieren kann dazu beitragen, die Probendicke auf ein Niveau zu reduzieren, das für die Kryo-EM-Datenerfassung geeignet ist, die Probenebenheit zu verbessern und die Bildverarbeitung zu erleichtern. Die Peel-Blot-Technik ermöglicht die Trennung von mehrschichtigen Membranen in einzelne Schichten, von geschichteten 2D-Kristallen in einzelne Kristalle und von gestapelten, blattartigen Strukturen löslicher Proteine, die ebenfalls in einzelne Schichten getrennt werden können. Die hohe Probendicke dieser Probentypen stellt häufig unüberwindliche Probleme für die Kryo-EM-Datenerfassung und Kryo-EM-Bildverarbeitung dar, insbesondere wenn der Mikroskoptisch für die Datenerfassung geneigt werden muss. Darüber hinaus können Gitter mit hohen Konzentrationen jeder dieser Proben für eine effiziente Datenerfassung vorbereitet werden, da die Probenkonzentration vor der Gittervorbereitung erhöht und die Peel-Blot-Technik angepasst werden kann, um eine dichte Verteilung der einschichtigen Probe zu erreichen.

Einleitung

Die Peel-Blot-Technik wurde entwickelt, um gestapelte zweidimensionale Kristalle von Membranproteinen in einzelne Schichten zu trennen, um entsprechend dünne Proben für die Kryo-EM 2D- und 3D-Datenerfassung zu erhalten und die Bildverarbeitung zu erleichtern¹. Das Protokoll eignet sich in ähnlicher Weise für andere Arten von mehrschaligen Proben sowie zum Erreichen hoher Probenkonzentrationen beider Probentypen auf dem Gitter, ohne die Dicke in Z zu erhöhen.

Die Reduktion der Probenschichten auf eine Schicht wird durch die Anwendung einer Kombination aus Kapillardruck und Scherkräften in einem Protokoll erreicht, das die Rückinjektionsmethode² wesentlich erweitert und modifiziert. Ein erster Löschschritt führt zu einem dichten Sandwiching und einer Haftung auf dem Kohlenstofffilm und einem Gitterstab auf beiden Seiten der mehrschichtigen Probe während des Blottings auf Submikron anstelle der Porengröße von 20-25 μm Filterpapier bei der Rückinjektionsmethode. Die Trennung oder das Ablösen einer einzelnen Schicht erfolgt, wenn die Trennung der Sandwichschichten erzwungen wird, sobald das Gitter vertikal auf einen Trehalose-Tropfen gedrückt wird, wodurch der Kohlenstofffilm vom Gitterstab weggedrückt wird (Abbildung 1). Die Neupositionierung der Kohlenstofffolie weg von der ursprünglichen Kontaktstelle mit der Gitterstange erfolgt im nächsten Schritt, wenn das Gitter erneut auf Submikron-Filterpapier abgetupft wird. Die Anzahl der Iterationen dieser Schritte kann für bestimmte Proben optimiert werden. Darüber hinaus kann das Protokoll verwendet werden, um die Probenkonzentrationen zu erhöhen und gleichzeitig eine Aggregation in Z zu vermeiden. Aufgrund der Abhängigkeit von der Haftung an Gitterstab und Kohlenstofffilm sowie der kraftvollen Trennung ist dieser Ansatz möglicherweise nicht für hochzerbrechliche Moleküle wie bestimmte empfindliche und/oder instabile Proteine und Proteinkomplexe geeignet.

Die Peel-Blot-Technik erfordert weder spezielle Ausrüstung noch teure Vorräte. Die Anwendbarkeit auf bestimmte Proben erfordert jedoch eine sorgfältige Berücksichtigung biologischer Parameter. Die Entscheidung ist für 2D-Kristalle einfacher, da Kohlenstofffilm erforderlich ist, um die Ebenheit zu gewährleisten, aber die Manipulation über die Peel-Blot-Technik kann die biologische Integrität der Probe oder die kristalline Ordnung beeinträchtigen. Die Eignung der Peel-Blot-Technik für einzelne Partikel ist auf diejenigen beschränkt und kann für diejenigen getestet werden, die Kohlenstofffilm benötigen und stabil gegen Manipulation sind. Proben mit kritischen biologischen Wechselwirkungen zwischen Schichten sind aufgrund der Störung solcher Wechselwirkungen möglicherweise nicht für die Charakterisierung mit Hilfe der Peel-Blot-Technik geeignet.

Die Peel-Blot-Technik ("Peel-Blot") wird am schnellsten durch Testen und Screening mit negativen Flecken oder ungefärbten Proben durch TEM bei Raumtemperatur optimiert. Sobald die optimale Anzahl von Peel-Blot-Iterationen identifiziert wurde, kann die Zeit bis zur Kontrolle der Dicke vor der Vitrifikation bestimmt werden.

Protokoll

1. Vorbereitungsschritte für die Peel-Blot-Technik

HINWEIS: Zur Vorbereitung müssen die folgenden Elemente nebeneinander platziert werden.

1. Stapeln Sie zwei Stück Filterpapier im Porenformat 20-25 μm (siehe Materialtabelle).
2. Legen Sie eine ~8 cm x 10 cm lange Paraffinfolie mit dem Papier nach oben neben das Filterpapier.
3. Legen Sie ein Stück Submikron-Filterpapier auf zwei weitere Stücke Filterpapier #4 (Abbildung 1-1).
4. Positionieren Sie die Antikapillarzange mit dem gebeugten Bein nach oben und dem geraden Bein nach unten. Wählen Sie dann ein Raster mit 600 Mesh und der glatten/glänzenden Seite nach oben. Legen Sie die Pinzette auf eine Petrischale oder eine andere erhöhte Oberfläche, um den Kontakt des sauberen Gitters mit anderen Gegenständen zu vermeiden.
5. Entfernen Sie das Papier von der Paraffinfolie und ziehen Sie an den Seiten (~5 mm), um einen kleinen Rand zu erzeugen. Pipettieren Sie zwei 150 μL Tropfen 4% Trehalose-Lösung ~1-2 cm von einer kurzen Seite des Paraffinfilms und ~1 cm auseinander auf dem Paraffinfilm.
6. Gießen Sie auf einer separaten Bank oder auf dem Boden flüssigen Stickstoff in einen kleinen Polystyrolschaumbehälter (siehe Materialtabelle).
   ACHTUNG: Lassen Sie sich im richtigen Umgang mit Handschuhen und Gesichtsschutz schulen, um Erfrierungen zu vermeiden.
7. Stellen Sie einen kleinen Kryo-EM-Gitterbehälter in den flüssigen Stickstoff und decken Sie den Styroporschaumbehälter mit fusselfreien Tüchern ab.

2. Platzieren der Kohlenstofffolie auf dem Gitter

1. Verwenden Sie die Dumont #5 Pinzette (siehe Materialtabelle), um den Kohlenstofffilm vom Glimmer zu schweben, indem Sie eine Seite des Glimmers in einem leichten Winkel nach unten (~ 20 ° -40 °) auf einem der Tropfen Trehalose-Lösung berühren und die Wasserspannung langsam vom Kohlenstofffilm abheben lassen, indem Sie den Glimmer nach unten bewegen. Geben Sie den Glimmer frei, sobald der Kohlenstofffilm auf der Oberfläche des Tröpfchens schwimmt.
2. Untersuchen Sie den Kohlenstofffilm visuell, um die Verwendung von Kohlenstoff mit Schäden in Form von Brüchen zu vermeiden.
3. Führen Sie das Gitter, das von der Antikapillarzange gehalten wird, in einem Winkel (~ 20 ° -30 °) in einen Trehalose-Tropfen an einer Position neben und dann zentriert unter dem Kohlenstofffilm ein. Nehmen Sie den Kohlenstofffilm auf (Abbildung 1-2).
4. Halten Sie das Gitter in der gleichen Ausrichtung und senken Sie es langsam auf die Oberfläche des zweiten Tropfens Trehalose, ohne die Oberflächenspannung des Tropfens zu brechen, um unnötigen Kohlenstofffilm zu entfernen, der sich möglicherweise um den Rand des Gitters zur rauen Seite gewickelt hat.

3. Trennung von mehrschichtigen 2D-Kristallen in einzelne Schichten

1. Drehen Sie die Antikapillarzange (siehe Materialtabelle), und legen Sie sie mit der Kohlenstoffseite des Gitters nach unten auf eine Petrischale (Abbildung 1-3).
2. Pipettieren Sie 1,3 μl der Probe in den leichten Trehalose-Meniskus auf dem Gitter. Pipetten Sie die Lösung ~ 8-10 mal, um die Trehalose und die Probe auf beiden Seiten des Gitters zu mischen und zu verteilen.
3. Während Sie die Lösung für 1 Minute inkubieren, pipetten Sie einen oder mehrere 1,7 μL Tropfen Trehalose-Lösung auf die Paraffinfolie.
4. Drehen Sie das Gitter wieder in seine ursprüngliche Position, wobei der Kohlenstofffilm nach oben zeigt.
5. Verwenden Sie die Antikapillarzange, um das Gitter auf das Submikron-Filterpapier zu drücken (Abbildung 1-4). Sobald die Lösung vom Filterpapier absorbiert wurde und der Kohlenstofffilm flach liegt, warten Sie 3s, bevor Sie das Gitter anheben und senkrecht auf den 1,7 μL Tropfen Trehalose-Lösung bewegen (Abbildung 1-5).
   HINWEIS: Wiederholen Sie diesen Schritt mehrmals für stark gestapelte Proben, oder das Raster wird für die Vitrifikation in den nächsten Schritten vorbereitet.
6. Tupfen Sie das Raster auf den beiden Filterpapierstücken ab, und heben Sie dann das Raster vom Filterpapier ab (Abbildung 1-6). Nach ca. 13 s, je nach Feuchtigkeit und Probenpuffer, tauchen Sie das Gitter in den flüssigen Stickstoff im kleinen Styroporbehälter und legen Sie das Gitter in den Kryo-EM-Gitterbehälter oder übertragen Sie es direkt zum Kryo-EM-Screening oder zur Datenerfassung.
   HINWEIS: Um das Protokoll schnell zu optimieren, färben Sie das abgeschlitzte Gitter bei diesem Schritt negativ, anstatt es in flüssigen Stickstoff zu tauchen. Färben Sie die Probe negativ, indem Sie 3 μL 1% Uranylacetat auf das Gitter auftragen, das Gitter für 30 s inkubieren und mit einem zerrissenen Stück 20-25 μm porengroßes Filterpapier abtupfen. Gitter aus 2D-Kristallen, die in Trehalose, Tannin oder Glukose verglast sind, werden routinemäßig zur Vitrifikation von Hand getaucht, da Trehalose, Tannin und Glukose die Bildung von kristallinem Eis mit Raten verhindern, die für das Eintauchen von Hand verwendet^{werden 2}.

Ergebnisse

Ein erfolgreiches Peel-Blot-Experiment führt zu einzelnen Probenschichten mit oft hohen Konzentrationen. Es ist zu erwarten, dass einige Regionen in den meisten Rasterquadraten immer noch mehrere Schichten enthalten, insbesondere bei einer geringeren Anzahl von Iterationen der Peel-Blot-Schritte. Die Mehrheit der Gitterquadrate wird jedoch ausgedehnte Regionen von Einzelschichten enthalten, wie sie für 2D-Kristalle der menschlichen Leukotrien-C4-Synthase (Abbildung 2) und Liposomen (hinzugefügt in Schritt 3.2,

Diskussion

Der Peel-Blot ist eine leistungsstarke Methode, um das Stapeln und die Dicke von mehrschichtigen 2D-Kristallen und ähnlichen Proben für die Kryo-EM-Datenerfassung und Bildverarbeitung zu überwinden. Eine Entscheidung über die Verwendung des Peel-Blots basiert auf biologischen Parametern der Probe und muss ebenfalls bewertet werden, sobald ein 3D-Kryo-EM-Modell verfügbar ist. Die biologische Bedeutung von Kontakten und die potenzielle Flexibilität von Kontaktregionen werden bei dieser Bewertung besonders wichtig sei...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
600-mesh grids	SPI	2060-C-XA
Anti-capillary forceps	Ted Pella	510-5
Carbon to coat mica
Cryo-EM			Cryo-EM grids may be screened at 120 kV or 200 kV.  High-resolution data is collected at 300 kV.
Dumpont #5 forceps	Ted Pella	5622
Grid box for cryo-EM storage	Ted Pella	160-40
Kim Wipes
Liquid nitrogen
Mica	Ted Pella	56	The mica is carbon-coated and cut into squares that are slighlty larger than a TEM grid.  The carbon thickness may require optimization to avoid thin carbon that breaks easily upon multiple peel blots.
Negative stain			1-2% uranyl acetate is suitable for many samples.  Other stains such as phosphotungstic acid can be substituted.
Parafilm
Polystyrene container			Used for vitrifying the peel-blot grid. A polystyrene shipping container can be recycled for this purpose and lined with aluminium foil.
Submicron filter paper	MilliporeSigma	DAWP04700
Transmission electron microscope	JEOL	JEM-1400	Any TEM operated at an accelerating voltage of 80-120 kV will be suitable for screening of negatively stained grids.
Trehalose			Prepare 4% trehalose solution.
Whatman #4 filter paper	MilliporeSigma	WHA1004150	This corresponds to the 20-25 μm pore size filter paper in the protocol.