Sezieren der zellautonomen Funktion des fragilen X-mentalen Retardierungsproteins in einem auditorischen Schaltkreis durch In-Ovo-Elektroporation

Zusammenfassung

Mit Hilfe der In-Ovo-Elektroporation entwickelten wir eine Methode, um das auditorische Innenohr und den Cochlea-Kern in Hühnerembryonen selektiv zu transfizieren, um einen zellgruppenspezifischen Knockdown des fragilen X-Mentalretardationsproteins während diskreter Perioden des Schaltkreisaufbaus zu erreichen.

Zusammenfassung

Fragile X mental retardation protein (FMRP) ist ein mRNA-bindendes Protein, das die lokale Proteintranslation reguliert. FMRP-Verlust oder -Dysfunktion führt zu aberranten neuronalen und synaptischen Aktivitäten beim fragilen X-Syndrom (FXS), das durch geistige Behinderung, sensorische Anomalien und soziale Kommunikationsprobleme gekennzeichnet ist. Studien zur FMRP-Funktion und FXS-Pathogenese wurden hauptsächlich mit Fmr1-Knockout (das Gen, das FMRP kodiert) bei transgenen Tieren durchgeführt. Hier berichten wir über eine in vivo Methode zur Bestimmung der zellautonomen Funktion von FMRP während der Zeit des Schaltkreisaufbaus und der synaptischen Bildung mit Hühnerembryonen. Diese Methode verwendet die phasen-, orts- und richtungsspezifische Elektroporation eines medikamenteninduzierbaren Vektorsystems, das Fmr1-kleine Haarnadel-RNA (shRNA) und einen EGFP-Reporter enthält. Mit dieser Methode erreichten wir einen selektiven FMRP-Knockdown im auditorischen Ganglion (AG) und in einem seiner Hirnstammziele, dem Nucleus magnocellularis (NM), wodurch eine komponentenspezifische Manipulation innerhalb des AG-NM-Schaltkreises ermöglicht wurde. Darüber hinaus ermöglicht das Mosaikmuster der Transfektion Kontrollen innerhalb des Tieres und benachbarte Neuron/Faser-Vergleiche für eine erhöhte Zuverlässigkeit und Empfindlichkeit bei der Datenanalyse. Das induzierbare Vektorsystem bietet eine zeitliche Kontrolle des Beginns der Genbearbeitung, um akkumulierende Entwicklungseffekte zu minimieren. Die Kombination dieser Strategien bietet ein innovatives Werkzeug, um die zellautonome Funktion von FMRP in der synaptischen und Schaltungsentwicklung zu analysieren.

Einleitung

Das Fragile-X-Syndrom (FXS) ist eine neurologische Entwicklungsstörung, die durch geistige Behinderung, sensorische Anomalien und autistisches Verhalten gekennzeichnet ist. In den meisten Fällen wird FXS durch einen globalen Verlust des fragilen X-Mentalretardierungsproteins (FMRP; kodiert durch das Fmr1-Gen) ab frühen embryonalen Stadien¹ verursacht. FMRP ist ein RNA-bindendes Protein, das normalerweise in den meisten Neuronen und Gliazellen im Gehirn sowie in Sinnesorganen^{exprimiert wird 2,3,4}. In Säugetiergehirnen ist FMRP wahrscheinlich mit Hunderten von mRNAs assoziiert, die Proteine kodieren, die für verschiedene neuronale Aktivitäten wichtig sind⁵. Studien an konventionellen Fmr1-Knockout-Tieren zeigten, dass die FMRP-Expression besonders wichtig für den Aufbau und die Plastizität der synaptischen Neurotransmission ist⁶. Mehrere bedingte und mosaikartige Knockout-Modelle haben weiter gezeigt, dass FMRP-Aktionen und -Signale zwischen Gehirnregionen, Zelltypen und synaptischen Stellen während mehrerer Entwicklungsereignisse variieren, einschließlich axonaler Projektion, dendritischer Musterung und synaptischer Plastizität 7,8,9,10,11,12,13,14 . Die akute Funktion von FMRP bei der Regulierung der synaptischen Übertragung wurde durch intrazelluläre Verabreichung von inhibitorischen FMRP-Antikörpern oder FMRP selbst in Gehirnschnitten oder kultivierten Neuronen untersucht^15,16,17,18. Diese Methoden bieten jedoch nicht die Möglichkeit, FMRP-Fehlausdrucksfolgen während der Entwicklung zu verfolgen. Daher ist die Entwicklung von In-vivo-Methoden zur Untersuchung der zellautonomen Funktionen von FMRP von großem Bedarf und soll dazu beitragen, festzustellen, ob die berichteten Anomalien bei FXS-Patienten direkte Folgen des FMRP-Verlusts in den zugehörigen Neuronen und Schaltkreisen oder sekundäre Konsequenzen sind, die sich aus netzwerkweiten Veränderungen während der Entwicklung ergeben¹⁹.

Der auditorische Hirnstamm von Hühnerembryonen bietet ein einzigartig vorteilhaftes Modell für eingehende funktionelle Analysen der FMRP-Regulation in der Schaltkreis- und Synapsenentwicklung. Der einfache Zugang zu embryonalen Hühnergehirnen und die etablierte Elektroporationstechnik zur genetischen Manipulation haben wesentlich zu unserem Verständnis der Gehirnentwicklung in frühen embryonalen Stadien beigetragen. In einer kürzlich veröffentlichten Studie wurde diese Technik mit fortschrittlichen molekularen Werkzeugen kombiniert, die eine zeitliche Kontrolle der FMRP-Fehlexpression ermöglichen^20,21. Hier wird die Methodik weiterentwickelt, um selektive Manipulationen von präsynaptischen und postsynaptischen Neuronen getrennt voneinander zu induzieren. Diese Methode wurde im auditorischen Hirnstammkreislauf entwickelt. Das akustische Signal wird von Haarzellen im auditorischen Innenohr detektiert und dann an das Hörganglion (AG; bei Säugetieren auch Spiralganglion genannt) weitergeleitet. Bipolare Neuronen in der AG innervieren Haarzellen mit ihren peripheren Fortsätzen und senden wiederum eine zentrale Projektion (den Hörnerv) zum Hirnstamm, wo sie in zwei primären Cochlea-Kernen, dem Nucleus magnocellularis (NM) und dem Nucleus angularis (NA), enden. Neuronen in der NM sind strukturell und funktionell vergleichbar mit den kugelförmigen buschigen Zellen des anteroventralen Cochlea-Kerns von Säugetieren. Innerhalb der NM synapsieren Hörnervenfasern (ANFs) auf den Somata von NM-Neuronen über den großen Endbulb der Held-Terminals²². Während der Entwicklung entstehen NM-Neuronen aus den Rhombomeren 5 und 6 (r5/6) im Hinterhirn²³, während AG-Neuronen von Neuroblasten abgeleitet werden, die sich in der Otozyste²⁴ befinden. Hier beschreiben wir das Verfahren zur selektiven Knockdown-FMRP-Expression in den präsynaptischen AG-Neuronen und in den postsynaptischen NM-Neuronen getrennt.

Protokoll

Eier und Hühnerembryonen wurden mit Sorgfalt und Respekt in Übereinstimmung mit den Tierprotokollen behandelt, die vom Animal Care and Use Committee der Jinan University genehmigt wurden.

1. Ei- und Plasmidzubereitung

1. Ei-Zubereitung
   1. Frisch befruchtete Hühnereier (Gallus gallus) von der South China Agricultural University beziehen und vor der Inkubation bei 16 °C lagern. Um eine optimale Lebensfähigkeit zu erzielen, legen Sie alle Eier innerhalb einer Woche nach der Ankunft zur Inkubation.
   2. Die Eier horizontal platzieren und bei 38 °C für 46-48 h bis Hamburger und Hamilton (HH) Stadium 12²⁵ für die Neuralrohrtransfektion oder für 54-56 h bis HH13 für die Otozystentransfektion inkubieren. Da der Tierpol des Eies leichter ist als der Pflanzenpol, positioniert die horizontale Platzierung den Embryo auf der Oberseite des Eies für eine einfache Manipulation. Seien Sie vorsichtig, um das Ei in diesem und allen folgenden Schritten horizontal zu halten.
   3. Die Position des Embryos erscheint als dunkler Bereich auf der Eierschale, wenn Licht vom Boden des Eies mit einer Taschenlampe geworfen wird. Verwenden Sie in den gewünschten HH-Stadien diese Taschenlampenmethode, um die Position des Embryos auf der Eierschale mit Bleistift zu markieren.
   4. Wischen Sie die Eier mit Gaze ab, die 75% Ethanol enthält. Bohren Sie mit der Scherenspitze ein Loch in das spitze Ende der Eier und entfernen Sie 2 ml Albumin mit einer 18-G-Nadelspritze. Stellen Sie sicher, dass das Loch nur groß genug ist, um das Einführen der Nadel zu ermöglichen. Wischen Sie auslaufendes Albumin mit Gaze ab und verschließen Sie das Loch mit durchsichtigem Klebeband.
   5. Um Risse zu minimieren und herabfallende Schalenablagerungen während des Fensters zu verhindern, bedecken Sie die Oberseite der Eier mit klarem Klebeband und zentrieren Sie sich auf den mit Bleistift markierten dunklen Bereich.
2. Plasmid-DNA-Extraktion
   1. Klonen Sie Hühner Fmr1 shRNA mit einem Transposon-basierten Tet-on-System, wie zuvor beschrieben²⁰. Dieses System enthält drei Plasmide: pCAGGS-T2TP, pT2K-CAGGS-rtTA-M2 und pT2K-BI-TRE-EGFP-Fmr1 shRNA, die ein medikamenteninduzierbares Vektorsystem bereitstellen, durch das die Expression von Fmr1 shRNA und EGFP nach der Transfektion zum Schweigen gebracht wird und durch Doxycyclin (Dox) -Induktion eingeschaltet werden kann.
      HINWEIS: Diese Plasmide sind derzeit nicht in einem Repository verfügbar. Die Autoren erklären sich damit einverstanden, die Plasmide auf angemessene Anfrage zur Verfügung zu stellen.
   2. Extrahieren Sie Plasmid-DNAs mit einem endotoxinfreien Präparationskit gemäß den Anweisungen des Herstellers und fallen Sie durch Zugabe von 1/15 Volumen 7,5 M Natriumacetat und 1 Volumen von 100% Isopropanol aus.
   3. Plasmide bei -20 °C über Nacht ausfällen und bei 13.000 x g für 10 min zentrifugieren. Das Pellet wird mit dem im Kit enthaltenen Tris-EDTA-Puffer auf eine Endkonzentration von 4-5 μg/μL gelöst. Plasmide können bei -20 °C für 12 Monate ohne verminderte Transfektionseffizienz gelagert werden.
   4. Mischen Sie am Tag der Elektroporation 2 μL jedes Plasmids gründlich in einem sterilen Zentrifugenröhrchen mit einer Pipettenspitze. Das resultierende 6 μL Volumen der Plasmidmischung reicht aus, um drei Dutzend Eier zu elektropolieren. Um das Plasmid während der Elektroporation sichtbar zu machen, fügen Sie 1 μL 0,1% schnelles Grün (hergestellt in sterilem_ddH2O) für jeweils 6 μL DNA-Mischung²⁶ hinzu, wodurch die Plasmidmischung blau wird.

2. In ovo Elektroporation

1. Eizellfenster und Embryonenidentifizierung
   1. Am Tag der Elektroporation die Eier aus dem Inkubator entfernen, jeweils ein Dutzend Eier. Eier länger als 1 Stunde aus ihrem Inkubator fernzuhalten, führt zu Entwicklungsschwankungen und verringert die Lebensfähigkeit.
   2. Wischen Sie alle Operationswerkzeuge mit Gaze ab, die 75% Ethanol enthält.
   3. Legen Sie jedes Ei in einen speziell angefertigten Schaumstoffhalter. Wischen Sie den mit Klebeband bedeckten Bereich mit 75% Ethanol ab und schneiden Sie mit einer kleinen Schere ein Fenster (1-2 cm²) um den Umfang der Bleistiftmarkierung herum (Abbildung 1A). Halten Sie beim Schneiden die Schere flach, um den darunter liegenden Embryo nicht zu beschädigen.
   4. Legen Sie das Fensterei unter ein Stereomikroskop mit einem 10-fachen Okular und 2-fachem Zoom und identifizieren Sie den Embryo. Passen Sie den Winkel und die Helligkeit der Lichtquelle für eine bessere Visualisierung an.
      HINWEIS: Es erfordert Übung und Erfahrung, um den Embryo zu visualisieren und das Neuralrohr in diesem Stadium zu identifizieren.
      1. Für Anfänger verwenden Sie die folgende optionale Tinteninjektion, um die Identifizierung des Embryos zu erleichtern. Bereiten Sie 10% ige indische Tintenlösung in 0,01 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und Autoklav im Voraus vor. Füllen Sie eine 1-ml-Spritze mit der Tintenlösung und passen Sie dann eine 27G-Nadel an. Biegen Sie die Nadel mit einer Pinzette in einen Winkel von 45°.
      2. Unter dem Mikroskop vorsichtig vom Rand des Opazakas stechen und die Nadel unter den Embryo einführen. Injizieren Sie ~ 50 μL Tinte, die unter dem Bereich pellucida zur Visualisierung des Embryos diffundiert. Die Tinte bildet einen dunklen Hintergrund für eine klare Visualisierung des Embryos.
         HINWEIS: Stoßen Sie die Luft vor dem Einführen und Einspritzen aus der Spritze aus. Wenn Sie in der Visualisierung geschult sind, vermeiden Sie den Schritt der Tinteninjektion, da er die Überlebensrate verringert.
2. Neuralrohrinjektion und Elektroporation
   HINWEIS: Dieses Verfahren wird bei HH12 durchgeführt, um NM-Neuronen im Hirnstamm zu transfizieren.
   1. Glaskapillaren (~1 mm Durchmesser und 100 mm lang) mit einem Pipettenzieher in Pipetten ziehen. Öffnen Sie unter einem Seziermikroskop vorsichtig die Spitze der Kapillarnadel mit einer Pinzette auf einen Durchmesser von 10-20 μm. Lagern Sie die Pipetten (normalerweise 5-10 auf einmal) bis zur Verwendung in einer Aufbewahrungsbox.
   2. Füllen Sie eine Kapillarpipette mit 0,5-1 μL der Plasmidmischung, indem Sie Unterdruck durch einen Gummischlauch am Ende der Pipette anlegen. Dies kann durch eine Spritze oder Luftpumpe erreicht werden.
   3. Legen Sie das Ei unter das Mikroskop, so dass der Embryo vertikal mit dem Schwanz in Ihrer Nähe ausgerichtet ist (oder horizontal zum Injizieren von Kapillarpipetten mit einem dreiachsigen Manipulator). Halten Sie die Kapillarpipette mit einer Hand oder mit dem dreiachsigen Manipulator und fahren Sie die Spitze der Pipette in Kopf-an-Kopf-Richtung zum r5/6.
      HINWEIS: Der vordere Hinterhirnbereich ist r1 und jede nachfolgende Ausbuchtung entlang des Neuralrohrs ist ein individuelles Rhombomer. R5/6 befindet sich auf der gleichen anteroposterioren Ebene wie die Otozyste, die eine leicht erkennbare becherartige Struktur darstellt (Abbildung 1B-C).
   4. Stecken Sie die Spitze vorsichtig durch die Vitellinmembran und in das dorsale Neuralrohr und ziehen Sie dann die Pipette ein wenig zurück, so dass sich die Spitze im Lumen des Neuralrohrs befindet. Das Plasmidgemisch wird durch Anlegen von Luftdruck injiziert, bis das getönte Plasmid vollständig in r5/6 diffundiert und sich in r3 und r4 erstreckt.
      HINWEIS: Es ist nicht notwendig, einen Schlitz auf der Vitelline-Membran für die Injektion zu machen.
   5. Überprüfen Sie, ob eine erfolgreiche Injektion vorliegt, die erreicht wird, wenn die blaue Plasmidlösung schnell durch das Neuralrohr diffundiert, ohne auszulaufen (Abbildung 1B-C). Wenn es zu Undichtigkeiten kommt, verblasst das Blau schnell.
   6. Setzen Sie unmittelbar nach der Injektion eine bipolare Platinelektrode auf beiden Seiten des Neuralrohrs ein (Abbildung 1D). Liefern Sie zwei Impulse von 12 V und 50 ms Dauer mit einem Elektroporator. Beobachten Sie Luftblasen an den Enden der bipolaren Elektrode, mit mehr auf der negativen Seite.
   7. Überprüfen Sie die erfolgreiche Elektroporation, die erreicht wird, wenn die getönte Plasmidmischung in das Neuralrohrgewebe in der Nähe der positiven Seite der Elektrode gelangt. Entfernen Sie nach der Elektroporation vorsichtig die bipolare Elektrode.
   8. Decken Sie das Fenster auf der Eierschale mit einem Stück transparenter Folie ab, die in 2 Quadrate vorgeschnitten und mit 75% Ethanol besprüht wird. Legen Sie das Ei zurück in den Inkubator.
   9. Reinigen Sie die bipolare Elektrode, indem Sie 10-20 Impulse von 12 V und 50 ms Dauer in Kochsalzlösung abgeben, bevor Sie mit dem nächsten Ei fortfahren.
3. Otozysteninjektion und Elektroporation
   HINWEIS: Dieses Verfahren wird bei HH13 zur Transfizierung von Haarzellen und AG-Neuronen im Innenohr durchgeführt.
   1. Bei HH13 (das ist ~embryonaler Tag 2,5) hat sich der Embryo so gedreht, dass die rechte Seite des Kopfes nach oben zeigt. Legen Sie das Ei unter das Mikroskop, so dass der Embryo vertikal ist, mit dem Schwanz in Ihrer Nähe. Halten Sie die Kapillarpipette fest, und stoßen Sie die rechte Otozyste vorsichtig in dorsolaterale Richtung (Abbildung 2A).
      HINWEIS: In diesem Stadium erscheint die Otozyste als kleine kreisförmige Struktur auf der Oberseite des Körpers auf der gleichen anteroposterioren Ebene wie r5/6.
   2. Das Plasmidgemisch wird mit Luftdruck injiziert, bis die Otozyste mit blauer Lösung²⁷ gefüllt ist. Überprüfen Sie eine erfolgreiche Injektion, die erreicht wird, wenn die blaue Plasmidmischung in der Otozyste eingeschlossen ist und nicht austritt.
   3. Setzen Sie unmittelbar nach der Injektion die bipolare Elektrode auf die Otozyste, wie in Abbildung 2B dargestellt. Positionieren Sie die positive und negative Seite vor bzw. hinter der Otozyste. Liefern Sie zwei Impulse von 12 V und 50 ms Dauer mit dem Elektroporator.
   4. Überprüfen Sie die erfolgreiche Elektroporation, die erreicht wird, wenn die blaue Plasmidmischung in das Gewebe der Otozyste in der Nähe der positiven Seite der Elektrode eindringt. Entfernen Sie nach der Elektroporation vorsichtig die bipolare Elektrode. Decken Sie das Fenster auf der Eierschale mit einer transparenten Folie ab und geben Sie das Ei in den Inkubator zurück.

3. Verabreichung von Dox zur Einleitung und Aufrechterhaltung der Plasmidtranskription

1. Herstellung der Dox-Lösung
   1. Messen Sie 100 mg Dox-Pulver unter einer chemischen Haube und lösen Sie es in 100 ml sterilem PBS auf, um eine 1 mg / ml Arbeitslösung herzustellen. Filtern Sie die Lösung mit einem 0,22-μm-Filter und lagern Sie 1 mL Aliquots bei -20 °C. Vor Licht schützen^20,28.
2. Verabreichung von Dox
   1. Für die Geneditierung in voller Stärke tauen Sie 24 h vor dem gewünschten Alter einen Dox aliquot auf Eis auf. Geben Sie 50 μL Dox direkt auf die Chorioallantoische Membran des Eies mit einer Spritze, die in den transparenten Film eindringt. Verschließen Sie das Nadelloch nach der Injektion mit transparenter Folie oder Klebeband.
   2. Um den Knockdown-Effekt aufrechtzuerhalten, verabreichen Sie Dox jeden zweiten Tag, bis die Gewebeentnahme im gewünschten Entwicklungsstadium erfolgt.

4. Gewebedissektion und -schnitte

1. Hirnstamm
   1. Bei Embryonen im embryonalen Stadium 3 (E3) und E6 öffnen Sie die Eierschale und schneiden Sie die zugehörige Membran mit einer Schere ab. Löffeln Sie den Embryo aus und tauchen Sie ihn in 4% Paraformaldehyd (PFA) in 0,1 M Phosphatpuffer.
   2. Für E9-Embryonen öffnen Sie die Eierschale, enthaupten Sie den Embryo mit einer Schere und übertragen Sie den Kopf auf eine mit PBS gefüllte Silikonbodenplatte. Stecken Sie den Kopf durch die Augenhöhlen und schneiden Sie die Oberseite des Schädels auseinander. Legen Sie die Pinzette vorsichtig von beiden Seiten unter das Gehirn und heben Sie das gesamte Gehirn mit den Schultern der Pinzette vom Schädel an. Tauchen Sie das Gehirn in 4% PFA.
   3. Für E15- und E19-Embryonen öffnen Sie die Eierschale, enthaupten Sie den Embryo mit einer Schere und legen Sie den Kopf auf eine mit PBS gefüllte Silikonbodenplatte. Schneiden Sie die Haut oben auf dem Kopf auf, um den Schädel freizulegen.
   4. Mit einem Rasiermesser senkrecht durch den Schädel schneiden, um das Vorderhirn und das Schwanzhirn zu trennen. Tauchen Sie den Schwanzblock in PBS, entfernen Sie die Oberseite des Schädels und nehmen Sie dann das Gehirn vom Schädel.
   5. Stecken Sie das Gehirn durch den Sehlappen und trennen Sie das Kleinhirn und den Hirnstamm. Achten Sie darauf, den auditorischen Hirnstamm, der sich direkt unter dem Kleinhirn befindet, nicht zu beschädigen. Entfernen Sie so viel Dura wie möglich aus dem Hirnstamm und tauchen Sie es dann in 4% PFA ein.
   6. Halten Sie Embryonen und Hirngewebe über Nacht in 4% PFA bei 4 °C, mit Ausnahme von E19-Hirnstämmen, die 24 h lang unter den gleichen Bedingungen aufbewahrt werden sollten.
   7. Nach der Fixierung dehydrieren Sie das Gewebe in PBS, das 30% Saccharose enthält, bis es sich absetzt, was je nach Alter normalerweise 1-3 Tage dauert.
   8. Schneiden Sie den Hirnstamm (E15 und E19) auf 30 μm in der koronalen Ebene mit einem gleitenden Mikrotom. Sammeln Sie Abschnitte in PBS und lagern Sie sie bei 4 °C vor der Immunfärbung.
   9. Für E3- und E6-Embryonen und E9-Hirnstämme Schnitt bei 50 μm quer. Abschnitte in PBS sammeln und bei 4 °C lagern. Montieren Sie die Abschnitte vor der Immunfärbung auf gelatinebeschichteten Objektträgern. Das Sammeln dickerer Abschnitte für diese Altersgruppen erleichtert die Handhabung des Gewebes.
2. Gehörgang
   1. Nach der Entfernung der Hirnstängel von E9-, E15- und E19-Embryonen ist der Gehörgang, der in das Schläfenbein eingebettet ist, unter dem Schädel liegend leicht identifizierbar und das Schläfenbein ist leicht vom umgebenden Schädel zu trennen. Bei E9-Embryonen fixieren Sie das gesamte Schläfenbein in 4% PFA. Bei älteren Embryonen entfernen Sie die knöcherne Struktur des Schläfenbeins, um den Gehörgang zu isolieren und den Gehörgang in 4% PFA zu fixieren.
   2. Halten Sie alle Schläfenknochen und Gehörgänge über Nacht in 4% PFA bei 4 °C, bevor Sie das Gewebe einbetten.
   3. Führen Sie die Gewebeeinbettung wie beschrieben durch. Bereiten Sie die Einbettungslösung wie folgt vor: 10% Gelatine (von Rinderhaut) in kaltem Wasser einweichen, bis das Gelatinegranulat aufquillt und sich absetzt (ca. 30 min). Die Mischung auf ~50 °C erhitzen, um die Gelatine aufzulösen, 20% Saccharose in die Gelatinelösung geben und umrühren, um sich aufzulösen. Lagern Sie die Gelatine-Saccharose-Lösung bis zu einem Monat bei 4 °C.
   4. Zur Anwendung die Gelatine-Saccharose-Lösung bei 37 °C erwärmen. Die Schläfenknochen/Gehörgänge in der warmen Gelatine-Saccharose-Lösung auf einer 96-Well-Platte bei 37 °C einweichen, bis sie sich absetzen, normalerweise 30-60 min.
   5. Legen Sie den Boden der Vertiefungen einer 12-Well-Platte mit einem Streifen transparenter Folie aus. Fügen Sie eine Schicht warme Gelatine-Saccharose-Lösung hinzu und warten Sie, bis sie erstarrt. Übertragen Sie einen Schläfenknochen / Gehörgang zu jedem Brunnen.
   6. Implantieren Sie das Gewebe mit einer zweiten Schicht warmer Gelatine-Saccharose-Lösung. Stellen Sie die Position des Gewebes so ein, dass es sich in der Mitte des Gels befindet und der Gehörgang horizontal ausgerichtet ist. Stellen Sie die Platte vorsichtig in einen 4 °C warmen Kühlschrank und warten Sie, bis das Gel fest ist.
   7. Ziehen Sie den transparenten Filmstreifen, um den Gelgewebeblock aus dem Vertiefung zu bewegen. Schneiden Sie zusätzliches Gel in einen quadratischen Block und schneiden Sie eine Ecke des Blocks ab, um die Ausrichtung zu identifizieren. Den Gelatineblock mit einem Stück Folie umwickeln, auf Trockeneis einfrieren und dann bei -80 °C bis zum Schneiden lagern.
   8. Schneiden Sie den Block in 20 μm Länge entlang der Länge des Gehörgangs mit einem Kryostaten. Montieren Sie die Schnitte direkt auf gelatinebeschichteten Objektträgern. Lagern Sie die Objektträger vor der Immunfärbung bei -80 °C.
   9. Vor der Immunfärbung tauchen Sie die Objektträger für 5 min in vorgewärmtes PBS (45 °C), um die Gelatine aufzulösen, und waschen Sie die Objektträger dann 3x bei Raumtemperatur PBS, um Restgelatine zu entfernen.

5. Immunfärbung und mikroskopische Bildgebung

HINWEIS: Es werden zwei Arten der Immunfärbung durchgeführt, je nachdem, ob Abschnitte auf Objektträgern montiert oder in PBS frei schwebend sind.

1. Immunfärbung auf Objektträgern
   1. Waschen Sie die Objektträger 3x für jeweils 10 min mit PBS. Umkreisen Sie den Bereich, der die Abschnitte enthält, mit einem Ölstift, um zu verhindern, dass während der Färbung Flüssigkeit austritt. Die Abschnitte mit einer Blocklösung abdecken, die 5% normales Ziegenserum in PBS enthält, und 30 min bei Raumtemperatur inkubieren.
   2. Verdünnen Sie die primären Antikörper (für die verwendete Endkonzentration siehe Tabelle der Materialien) in PBS, das 0,3% TritonX-100 und 5% normales Ziegenserum enthält. Entfernen Sie die blockierende Lösung und bedecken Sie dann die Abschnitte mit der primären Antikörperlösung. Die Objektträger bei 4 °C über Nacht in einer Box mit einer Schicht destilliertem Wasser am Boden inkubieren.
   3. Spülen Sie die Objektträger 3x für 10 min mit PBS. Tragen Sie fluoreszierende sekundäre Antikörper, verdünnt bei 1:500 in PBS, das 0,3% TritonX-100 enthält, auf Objektträger auf. Die Objektträger bei Raumtemperatur 4 h lichtgeschützt inkubieren.
   4. Waschen Sie die Dias 3x mit PBS. Lassen Sie vorsichtig zwei Tropfen Montagemedium auf die Objektträger fallen und decken Sie die Abschnitte mit Deckgläsern ab. Achten Sie darauf, keine Luftblasen zwischen Deckglas und Objektträger zu erzeugen.
2. Immunfärbung für Ganzmount-Embryonen und freischwebende Abschnitte
   1. Waschen Sie die Embryonen/Schnitte mit PBS 3x für jeweils 10 min in einer Well-Platte. Verdünnen Sie die primären Antikörper in PBS, das 0,3% TritonX-100 und 5% normales Ziegenserum enthält, in Zentrifugalröhrchen. Jeder Embryo/Abschnitt wird mit einem Glashaken in ein Röhrchen überführt und auf einem Shaker bei 60 U/min über Nacht bei 4 °C inkubiert.
   2. Embryonen/Schnitte 3x mit PBS für jeweils 10 min in einer Vertiefungsplatte waschen. Jeder Embryo/Abschnitt wird in ein dunkles Zentrifugalröhrchen gegeben, das mit fluoreszierender sekundärer Antikörperlösung gefüllt ist, und bei Raumtemperatur für 4 h auf dem Shaker inkubiert.
   3. Waschen Sie die Embryonen/Schnitte 3x mit PBS in einer Well-Platte. Verwenden Sie einen Pinsel, um die Schnitte auf gelatinebeschichteten Objektträgern in einer 15-cm-Schale mit PBS zu montieren. Nachdem die Objektträger leicht getrocknet sind (~5 min), tragen Sie zwei Tropfen Montagemedium auf und legen Sie ein Deckglas. Achten Sie darauf, keine Luftblasen zwischen Deckglas und Objektträger zu erzeugen. Bewahren Sie das gesamte Mount-Gewebe für die Bildgebung in PBS auf.
3. Bildgebung
   1. Stellen Sie sich das gesamte Gewebe in PBS in einer Schale mit einem Silikonboden vor, der Kohlenstoffpulver enthält, das einen schwarzen Hintergrund bietet. Erfassen und verarbeiten Sie Bilder mit einem kommerziellen Bildverarbeitungs-Softwarepaket von Olympus, wie zuvor^{beschrieben 29}.
   2. Bilden Sie die Abschnitte auf den Objektträgern mit einem konfokalen Mikroskop ab, wie zuvor beschrieben²⁰. Stellen Sie die Schnitte auf einer einzigen Fokusebene mit 10x-, 20x- und 63x-Objektiven vor. Nehmen Sie alle Bilder desselben Tieres mit denselben Parametern auf. Achten Sie darauf, die Laserpegel- und Bilderfassungseinstellungen anzupassen, um eine Signalsättigung zu vermeiden.
   3. Führen Sie die Bildverarbeitung mit der Fidschi-Software durch. Zur Veranschaulichung können Sie Helligkeit, Kontrast und Gamma des Bildes mit einer professionellen Bildbearbeitungssoftware anpassen.

Ergebnisse

Durch die Durchführung der Ovo-Elektroporation an verschiedenen Stellen und in verschiedenen Entwicklungsstadien erreichten wir einen selektiven FMRP-Knockdown entweder in der auditiven Peripherie oder im auditorischen Hirnstamm.

FMRP-Knockdown in NM
Kleine Haarnadel-RNA (shRNA) gegen das Huhn Fmr1 wurde entworfen und in das Tet-On-Vektorsystem kloniert, wie zuvor beschrieben²⁰. Der Aufbau für die In-Ovo-Elektroporation ...

Diskussion

Um die zellautonome Funktion von FMRP zu bestimmen, ist es notwendig, seine Expression in einzelnen Zellgruppen oder Zelltypen zu manipulieren. Da eine der Hauptfunktionen von FMRP darin besteht, die synaptische Bildung und Plastizität zu regulieren, ist die selektive Manipulation jeder synaptischen Komponente eines bestimmten Schaltkreises Voraussetzung für ein vollständiges Verständnis des FMRP-Mechanismus in der synaptischen Kommunikation. Unter Verwendung der Ovo-Elektro...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Egg incubation
16 °C refrigerator	MAGAT		Used for fertilized egg storage.
Egg incubator	SHANGHAI BOXUN	GZX-9240MBE
Fertilized eggs	Farm of South China Agricultural University		Eggs must be used in one week for optimal viability.
Plasmid preparation
Centrifuge	Sigma	10016
Fast green	Solarbio	G1661	Make 0.1% working solution in distilled water and autoclave.
Plasmid Maxi-prep kit	QIAGEN	12162	Dissolve plasmid DNA in Tris-EDTA (TE) buffer; endotoxin-free preparation kit
Sodium Acetate	Sigma-Aldrich	S2889	Make 7.5M working solution in nuclase-free water.
Electroporation and Doxycycline Administration
Electroporator	BTX	ECM399
1 mL / 5 mL Syringe	GUANGZHOU KANGFULAI
Dissecting microscope	CNOPTEC	SZM-42
Doxcycline	Sigma-Aldrich	D9891	Use fresh aliquots for each dose and store at -20 °C.
Glass capillary	BEIBOBOMEI	RD0910	0.9-1.1 mm*100 mm
Laboratory parafilm	PARAFILM	PM996	transparent film
Pipette puller	CHENGDU INSTRUMENT FACTORY	WD-2	Pulling condition: 500 °C for 15 s
Platinum elctrodes	Home made		0.5 mm diameter, 1.5 mm interval.
Rubber tube	Sigma-Aldrich	A5177
Tissue Dissection and Fixation
Forceps	RWD	F11020-11	Tip size: 0.05*0.01 mm
Other surgery tools	RWD
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127	Freshly made 4% PFA solution in phosphate-buffered saline can be stored in 4 °C for up to 1 week.
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	DOW	01673921	For black background plates, food-grade carbon powder is applied.
Sectioning
Cryostat	LEICA	CM1850
Gelatin	Sigma-Aldrich	G9391	From bovine skin.
Sliding microtome	LEICA	SM2010
Immunostaining
Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse	Abcam	ab150113	1:500 dilution, RRID: AB_2576208
Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit	Abcam	ab150078	1:500 dilution, RRID: AB_2722519
DAPI	Abcam	ab285390	1: 1000 dilution
Fluoromount-G mounting medium	Southern Biotech	Sb-0100-01
FMRP antibody	Y. Wang, Florida State University	#8263	1:1000 dilution, RRID: AB_2861242
Islet-1 antibody	DSHB	39.3F7	1:100 dilution, RRID: AB_1157901
Netwell plate	Corning	3478
Neurofilament antibody	Sigma-Aldrich	N4142	1:1000 dilution, RRID: AB_477272
Parvalbumin antibody	Sigma-Aldrich	P3088	1:10000 dilution, RRID: AB_477329
SNAP25 antibody	Abcam	ab66066	1:1000 dilution, RRID: AB_2192052
Imaging
Adobe photoshop	ADOBE		image editing software
Confocal microscope	LEICA	SP8
Fluorescent stereomicroscope	OLYMPUS	MVX10
Olympus Image-Pro Plus 7.0	OlYMPUS		commercial image processing software package