Zellfreie Proteinsynthese aus Exonuklease-defizienten Zellextrakten unter Verwendung linearer DNA-Vorlagen

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll zur Herstellung und Pufferkalibrierung von Zellextrakten aus Exonuklease-V-Knockout-Stämmen von Escherichia coli BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD und ΔrecB) vorgestellt. Dies ist ein schneller, einfacher und direkter Ansatz für die Expression in zellfreien Proteinsynthesesystemen mit linearen DNA-Vorlagen.

Zusammenfassung

Die zellfreie Proteinsynthese (CFPS) ist in letzter Zeit aufgrund ihrer zahlreichen Vorteile im Bereich der synthetischen Biologie sehr populär geworden. Die Verwendung linearer DNA-Templates für CFPS wird es der Technologie ermöglichen, ihr volles Potenzial auszuschöpfen und die experimentelle Zeit zu verkürzen, indem die Schritte des Klonens, der Transformation und der Plasmidextraktion eliminiert werden. Lineare DNA kann schnell und einfach durch PCR amplifiziert werden, um hohe Konzentrationen der Vorlage zu erhalten, wodurch eine mögliche In-vivo-Expressionstoxizität vermieden wird. Lineare DNA-Templates werden jedoch durch Exonukleasen, die natürlicherweise in den Zellextrakten vorhanden sind, schnell abgebaut. Es gibt mehrere Strategien, die vorgeschlagen wurden, um dieses Problem anzugehen, wie die Zugabe von Nukleaseinhibitoren oder die chemische Modifikation linearer DNA-Enden zum Schutz. Alle diese Strategien kosten zusätzliche Zeit und Ressourcen und müssen noch plasmidnahe Proteinexpressionswerte erreichen. Ein detailliertes Protokoll für eine alternative Strategie zur Verwendung linearer DNA-Templates für CFPS wird hier vorgestellt. Durch die Verwendung von Zellextrakten aus Exonuklease-defizienten Knockout-Zellen bleiben lineare DNA-Templates intakt, ohne dass Endmodifikationen erforderlich sind. Wir stellen die Herstellungsschritte von Zelllysat aus Escherichia coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD Stamm durch Ultraschalllyse und Pufferkalibrierung für Mg-Glutamat (Mg-glu) und K-Glutamat (K-glu) speziell für lineare DNA vor. Diese Methode ist in der Lage, Proteinexpressionsniveaus zu erreichen, die mit denen von Plasmid-DNA in E. coli CFPS vergleichbar sind.

Einleitung

Zellfreie Proteinsynthesesysteme (CFPS) werden zunehmend als schnelle, einfache und effiziente Methode für die Biosensortechnik, die dezentrale Herstellung und das Prototyping genetischer Schaltkreise eingesetzt¹. Aufgrund ihres großen Potenzials werden CFPS-Systeme regelmäßig im Bereich der synthetischen Biologie eingesetzt. Bisher sind CFPS-Systeme jedoch auf zirkuläre Plasmide angewiesen, die das volle Potenzial der Technologie einschränken können. Die Herstellung von Plasmid-DNA hängt von vielen zeitaufwändigen Schritten während der Klonierung und großen Mengen an DNA-Isolierung ab. Auf der anderen Seite kann die PCR-Amplifikation aus einem Plasmid oder einer synthetisierten DNA-Vorlage verwendet werden, um CFPS-Templates einfach innerhalb weniger Stunden herzustellen ^2,3. Daher bietet die Anwendung von linearer DNA eine vielversprechende Lösung für CFPS. Lineare DNA wird jedoch schnell durch Exonukleasen abgebaut, die natürlicherweise in zellulären Extrakten vorkommen⁴. Es gibt Lösungen, die dieses Problem angehen, wie die Verwendung des λ-Phagen-GamS-Proteins⁵ oder DNA, die Chi-Stellen⁶ enthält, als Schutzmittel oder der direkte Schutz der linearen DNA durch chemische Modifikation ihrer Enden 2,7,8,9. Alle diese Methoden erfordern Ergänzungen des Zellextrakts, die kostspielig und zeitaufwendig sind. Es ist seit langem bekannt, dass der Exonuklease-V-Komplex (RecBCD) lineare DNA in^Zelllysaten abbaut4. Kürzlich haben wir gezeigt, dass lineare DNA in Lysaten aus Zellen, die für Exonuklease-Gene (recBCD) ausgeschaltet wurden, viel besser geschützt werden ^kann10.

In diesem Protokoll werden Schritte zur Herstellung zellfreier Lysate aus dem E. coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD-Stamm durch Ultraschalllyse detailliert beschrieben. Die Beschallungslyse ist eine gängige und erschwingliche Technik, die von mehreren Labors eingesetzt^{wird 11,12}. Die aus diesem Stamm hergestellten Extrakte benötigen keine zusätzliche Komponente oder DNA-Vorlagenmodifikation, um die Expression aus linearen DNA-Templates zu unterstützen. Die Methode beruht auf dem wesentlichen Schritt der Pufferoptimierung für Zellextrakte speziell für die lineare DNA-Expression aus nativen E. coli-Promotoren. Es hat sich gezeigt, dass diese spezifische Pufferoptimierung für die lineare DNA-Expression der Schlüssel für native σ70-Promotoren ist, um eine hohe Proteinproduktion ohne GamS-Protein- oder Chi-DNA-Supplementierung zu erzielen und sogar die Reinigung der PCR-Produkte zu vermeiden¹⁰. Es wurde festgestellt, dass die optimale Konzentration von Mg-glu für die lineare DNA-Expression ähnlich der für Plasmid-DNA ist. Die optimale Konzentration von K-glu zeigte jedoch einen wesentlichen Unterschied zwischen linearer und Plasmid-DNA, wahrscheinlich aufgrund eines transkriptionsbezogenen Mechanismus¹⁰. Die Funktionalität von Proteinen, die mit dieser Methode exprimiert werden, wurde für verschiedene Anwendungen nachgewiesen, wie z.B. das schnelle Screening von Zehengriffschaltern und die Aktivitätsbewertung von Enzymvarianten¹⁰.

Dieses Protokoll bietet eine einfache, effiziente und kostengünstige Lösung für die Verwendung linearer DNA-Templates in zellfreien E. coli-Systemen durch einfache Verwendung mutierter ΔrecBCD-Zellextrakte und spezifischer Kalibrierung für lineare DNA als Vorlage.

Protokoll

1. Medien- und Pufferaufbereitung

1. Herstellung von 2xYT+P Medium (fest und flüssig)
   1. Bereiten Sie flüssige und feste Medien wie in Tabelle 1 beschrieben vor und sterilisieren Sie sie anschließend durch Autoklavieren.
      HINWEIS: Dieses Protokoll erfordert eine 2xYT+P-Agarplatte mit Chloramphenicol (10 μg/ml). Das Volumen des flüssigen Mediums ist proportional zum Volumen des benötigten Lysats. Hier wird ein Startvolumen von 5 L flüssigem 2xYT+P Medium verwendet. Das Volumen kann jedoch nach Bedarf angepasst werden, da 1 L der Zellkultur 2 bis 3 ml des endgültigen Zelllysats ergibt.
2. Herstellung von Chloramphenicol (34 mg/ml)
   1. Wiegen Sie 0,34 g Chloramphenicol, fügen Sie Ethanol zu 10 ml hinzu und lösen Sie sich durch Mischen auf. Aliquot jeweils 1 ml in mehrere Röhrchen geben und bei -20 °C lagern, um es später zu verwenden.
3. Vorbereitung des S30A-Puffers
   1. Bereiten Sie den S30A-Puffer gemäß Tabelle 2 vor, wobei 2 l dieses Puffers angestrebt werden.
      HINWEIS: Auch hier ist das Volumen dieses Puffers proportional zum Volumen des benötigten Lysats.
   2. Stellen Sie vor dem Autoklavieren den pH-Wert des Puffers mit Eisessig auf 7,7 ein.
   3. Autoklavieren Sie den Puffer.
   4. Halten Sie diesen Puffer nach dem Autoklavieren bei 4 °C.
   5. Vor Gebrauch fügen Sie dem S30A-Puffer DVB-T (gefiltert durch einen 0,22-μm-Membranfilter) hinzu, um eine Endkonzentration von 2 mM (2 ml 1 M DTT bis 1 L S30A-Puffer) zu erreichen.
      HINWEIS: Auch hier ist das Volumen dieses Puffers proportional zum Volumen des benötigten Lysats.
4. Vorbereitung der Energielösung
   HINWEIS: Diese Energielösung basiert auf dem Sun et al. Paper^{13 (14x} Stammkonzentration). Tabelle 3 gibt einen Überblick über die Komponenten, die für die Herstellung des Energielösungsbestands benötigt werden, mit Katalognummern für alle in diesem Protokoll verwendeten Chemikalien.
   1. Die Stammlösungen gemäß Tabelle 3 vorbereiten und auf Eis halten.
   2. Kalibrieren Sie den pH-Wert wie gewünscht für die angegebenen Komponenten, entweder mit Tris-Puffer 2 M (60,57 g Tris-Base in einem 250-ml-Volumen sterilem Wasser) oder KOH 15% (15 g KOH in einem 100-ml-Volumen sterilem Wasser), wie in Tabelle 3 angegeben.
   3. In einem 15-ml-Röhrchen wird das Volumen jeder Komponente in der in Tabelle 3 angegebenen Reihenfolge addiert.
   4. Aliquot die Energielösung, 150 μL pro Röhrchen.
   5. Schockfrostaliquots auf Trockeneis einfrieren und bei -80 °C lagern.
5. Herstellung von Aminosäure (AA) -Lösung
   HINWEIS: Die Aminosäurelösung wird mit dem RTS Amino Acid Sampler Kit hergestellt. Jede der 20 Aminosäuren ist in diesem Kit als 1,5 ml Volumen bei 168 mM enthalten, mit Ausnahme von Leucin, das bei 140 mM liegt. Hier ist die vorbereitete Stammlösung 4x konzentriert und nicht die erforderliche Arbeitslösung. Die Endkonzentration der Aminosäurelösung beträgt 6 mM für alle Aminosäuren, mit Ausnahme von Leucin, das bei 5 mM liegt.
   1. Die 20 Aminosäureröhrchen durch Wirbeln auftauen und bei 37 °C inkubieren, bis sie vollständig aufgelöst sind.
      HINWEIS: Cys lösen sich möglicherweise nicht vollständig auf.
   2. In einem 50-ml-Röhrchen werden 12 ml steriles Wasser und jeweils 1,5 ml Aminosäuren in der in Tabelle 4 angegebenen Reihenfolge hinzugefügt.
   3. Wirbeln, bis die Lösung ziemlich klar ist, gegebenenfalls bei 37 °C inkubieren.
      HINWEIS: Cys lösen sich möglicherweise nicht vollständig auf.
   4. Aliquot 500 μL der Aminosäurelösung pro Röhrchen auf Eis.
   5. Die Aliquots auf Trockeneis schockgefrieren und bei -80 °C lagern.
6. Vorbereitung von Lösungen für die Pufferkalibrierung
   1. Bereiten Sie die Stammlösung für Mg-glu (100 mM) und K-glu (3 M) wie in Tabelle 5 angegeben vor. Aus diesen Beständen wird eine serielle Verdünnung (in 1 ml Volumen) für Mg-glu (0 bis 20 mM) und K-glu (20 bis 300 mM) vorgenommen, wie in der Zusatzdatei 1 für Kalibrierschritte angegeben.
      HINWEIS: Diese Bestandskonzentrationen gelten für den Kalibrierungsschritt und müssen möglicherweise beim Einrichten des endgültigen Experiments geändert werden. Die höchsten Konzentrationen der für dieses Protokoll getesteten Bestände betragen 1 M bzw. 4,5 M für Mg-glu bzw. K-glu.
7. Herstellung des PEG8000-Lösungsvorrats
   1. Bereiten Sie 50 ml einer 40%igen PEG8000-Lösung vor (20 g PEG8000 in einem 50-ml-Volumen sterilen Wassers).

2. Zellkultur und Lysatpräparation (4-tägiger Versuch)

1. Tag 1
   1. Streifenstamm BL21 Rosetta2 ΔrecBCD (Tabelle 6) von -80 °C Glycerinvorrat auf eine 2xYT+P Agarplatte, die 10 μg/ml Chloramphenicol enthält. Alternativ kann auch BL21 Rosetta2 ΔrecB (Tabelle 6) verwendet werden¹⁰.
   2. Über Nacht bei 37 °C inkubieren.
2. Tag 2
   1. Beimpfen Sie eine einzelne Kolonie aus der obigen Agarplatte in 10 ml 2xYT + P, ergänzt mit 10 μg / ml Chloramphenicol.
   2. Über Nacht bei 37 °C unter Schütteln von 200 U/min inkubieren.
3. Tag 3
   1. Machen Sie eine Subkultur, indem Sie die Übernachtkultur 100 Mal in 4 L frisches 2xYT + P-Medium mit 10 μg / ml Chloramphenicol verdünnen.
      HINWEIS: Zum Beispiel werden 40 mL der Nachtkultur in 3960 ml frische Medien gegeben. Nach der Verdünnung wird das 4-L-Medium in 4 Kolben (5 L Volumen) aufgeteilt, so dass jeder Kolben 1 L enthält.
   2. Inkubieren Sie bei 37 °C, 200 U/min für etwa 3 bis 4 h Wachstum, um einen OD₆₀₀ von 1,5-2,0 zu erreichen. Die Kultur wird um das 4-fache verdünnt, wenn OD₆₀₀ > 0,8 gemessen wird.
      HINWEIS: Die genaue Inkubationszeit kann je nach Stamm, anfänglichem Inokulum, Laborutensilien und den verwendeten Instrumenten variieren. Die ΔrecB/ΔrecBCD-Knockout-Stämme weisen Wachstumsraten auf, die mit denen der BL21 Rosetta2-Elternstämme vergleichbar sind (ergänzende Abbildung 1).
   3. Legen Sie die Kultur auf Eis.
   4. Die Zellen bei 5.000 x g für 12 min bei 4 °C herunterdrehen und dann den Überstand durch Dekantieren verwerfen.
   5. Resuspendieren Sie die Zellpellets in 800 mL gekühltem S30A + DTT.
      HINWEIS: Das Volumen von S30A+DTT ist 5x geringer als das ursprüngliche Zellkulturvolumen. Zum Beispiel für ein Startvolumen von 1 L der Zellkultur Zellpellets in 200 ml S30A + DTT resuspendieren. Es wird auch empfohlen, diesen Schritt in einem Kühlraum bei 4 °C durchzuführen und alle Materialien auf Eis zu halten.
   6. Die Zellen bei 5.000 x g für 12 min bei 4 °C herunterdrehen und dann den Überstand durch Dekantieren verwerfen.
   7. Wiederholen Sie die Schritte 2.3.5 und 2.3.6.
   8. Zellpellets in 160 mL gekühltem S30A+DTT resuspendieren.
      HINWEIS: Dieses Mal ist das Volumen von S30A + DTT 25x geringer als das ursprüngliche Zellkulturvolumen. Zum Beispiel für ein Startvolumen von 1 L der Zellkultur resuspendieren Zellpellets in 40 ml S30A + DTT. Auch hier wird empfohlen, diesen Schritt in einem Kühlraum bei 4 °C durchzuführen, um die Materialien auf Eis zu halten.
   9. Die Zellen werden in gekühlte und vorgewogene 50-ml-Röhrchen überführt.
   10. Die Zellen bei 2.000 x g für 8 min bei 4 °C herunterdrehen und dann den Überstand durch Dekantieren verwerfen.
   11. Die Zellen bei 2.000 x g für 4 min bei 4 °C herunterdrehen und dann den verbleibenden Überstand vorsichtig mit einer Pipette entfernen.
   12. Messen Sie das Gewicht des Röhrchens erneut, um das Gewicht des Zellpellets zu berechnen.
   13. Halten Sie die Zellpellets bei -80 °C.
4. Tag 4
   1. Nehmen Sie die Zellpellets von -80 °C und tauen Sie sie 1-2 h auf Eis auf.
   2. Resuspendieren Sie die Zellpellets in 0,9 ml S30A + DTT-Puffer pro Gramm des Gewichts der Pellets. Pipettieren Sie langsam, um die Zellen zu resuspendieren, und vermeiden Sie den oberen Schaum so weit wie möglich, falls vorhanden.
   3. 1 ml Aliquots der resuspendierten Zellen in 1,5 ml Mikroröhrchen geben und auf Eis oder einem vorgekühlten kalten Block bei 4 °C aufbewahren (es ist vorzuziehen, Metallblöcke zu verwenden).
      HINWEIS: Wenn das letzte Aliquot viel weniger als 1 ml beträgt, ist es besser, es zu verwerfen, als ein suboptimales Volumen zu beschallen. Das optimale Volumen (1 ml) für die Beschallung wurde für diesen Aufbau (Röhre, Sonikator und Sonde) bestimmt und kann für einen anderen variieren.
   4. Beschallen Sie jede Röhre in einem Sonikator (3 mm Sonde, Frequenz 20 kHz) mit einem Setup von 20% Amplitude für drei Zyklen (30 s Beschallung, 1 min Pause).
      HINWEIS: Die Gesamtenergie, die über die drei Zyklen geliefert wurde, betrug ~ 266 Joule (~ 80-110 Joule pro Zyklus). Halten Sie die Schläuche während dieses Schritts auf dem kalten Block, der von Eis umgeben ist. Wechseln Sie zwischen zwei kalten Blöcken, um eine Überhitzung der Sonde zu vermeiden (der Standby-Kaltblock wird auch auf Eis kalt gehalten). Beide kalten Blöcke wurden am Tag vor der Beschallung im Kühlschrank vorgekühlt.
   5. Das Lysat bei 12.000 x g für 10 min bei 4 °C herunterschleudern.
   6. Sammeln Sie den Überstand (Zelllysat) mit einer Pipette und übertragen Sie ihn in ein 50-ml-Röhrchen.
   7. Inkubieren Sie das Zelllysat bei 37 °C bei 200 U/min Rühren für 80 min.
   8. Das Lysat bei 12.000 x g für 10 min bei 4 °C herunterschleudern.
   9. Sammeln Sie den Überstand und die aliquoten jeweils 30 μL in vorgekühlten 1,5-ml-Mikroröhrchen, während alle Röhrchen auf Eis gehalten werden.
   10. Die Lysataliquots auf Trockeneis schockgefrieren und bei -80 °C lagern.

3. Zellfreie Pufferkalibrierung für lineare DNA

HINWEIS: Der zellfreie Puffer wurde für optimale Mg-glu- und K-glu-Konzentrationen kalibriert, wie in Sun et ^al.13 beschrieben. Für die Kalibrierungsschritte wird die Zusatzdatei 1 benötigt. Die Reaktionen wurden auf ein Endvolumen von jeweils 10,5 μL eingestellt. Die Extrakte wurden unter Verwendung von 1 nM linearer (siehe Abschnitt 4 unten) oder Plasmid-DNA kalibriert. Die Experimente können am selben Tag durchgeführt werden, an dem die Puffer vorbereitet werden, oder die vorbereiteten Puffer können bei -80 °C eingefroren werden, um das Experiment an einem anderen Tag durchzuführen. Für alle Kalibrierschritte wurde jede Komponente auf Eis aufgetaut, bevor sie gemischt und in eine 384-Well-Platte pipettiert wurde.

1. Bereiten Sie einen Master Mix gemäß der Registerkarte "Puffervorbereitung" in der Excel-Datei Ergänzungsdatei 1 vor, der Folgendes enthält: (a) Zellextrakt (33% des gesamten Reaktionsvolumens), (b) Reporter-DNA (als lineare und/oder Plasmid-DNA) auf eine Endkonzentration von 1 nM, (c) zellfreien Puffer (PEG8000, AA-Lösung und Energielösung) und (d) K-Glu auf eine Endkonzentration von 80 mM.
2. Für ein Reaktionsvolumen von 10,5 μL nehmen Sie 1,05 μL (10% Gesamtreaktion) verschiedener Konzentrationen von Mg-glu 10x konzentrierten Vorräten (Endkonzentrationsbereiche: 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 und 20 mM) und fügen 9,45 μL (90% Gesamtreaktion) des Master Mix hinzu. Vorsichtig mischen.
   HINWEIS: Verwenden Sie PCR-Acht-Streifen-Röhrchen, um die Verdünnungen vorzubereiten und mit einer Mehrkanalpipette zu mischen. Bei Bedarf kann ein anderer Bereich von Mg-Glu-Konzentrationen verwendet werden.
3. Pipettieren Sie 10 μL der oben genannten Reaktionen in eine 384-Well-Quadratboden-Mikroplatte, bedecken Sie sie mit einer Klebeplattendichtung und messen Sie die Genexpression als Fluoreszenzausgabe. Aufzeichnung von Fluoreszenzdaten mit einem Plattenleser (Bsp: 485 nm; Em: 528 nm) in regelmäßigen Abständen (z.B. 5 min) für 8 h Inkubation bei 30 °C mit kontinuierlichem Orbitalschütteln bei 307 cpm.
   HINWEIS: Drehen Sie bei Bedarf die 384-Well-Mikroplatte (<2.500 x g, 1 min, Raumtemperatur) herunter, bevor Sie mit der Datenerfassung beginnen. Endpunktmessungen wurden verwendet, um die GFP-Expression in den verschiedenen Pufferzusammensetzungen zu vergleichen. Die Fluoreszenzwerte können zum Plotten in standardisierte Einheiten umgerechnet werden (siehe unten).
4. Identifizieren Sie die Mg-Glu-Konzentration, die am Endpunkt den höchsten Fluoreszenzwert ergibt.
   HINWEIS: Wenn Sie sich über die optimale Mg-Glu-Konzentration nicht sicher sind, wiederholen Sie Schritt 3.2 mit unterschiedlicheren Konzentrationsbereichen.
5. Fahren Sie mit der optimierten Mg-Glu-Konzentration für einen Konzentrationsbereich (20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220 und 240 mM) mit der K-Glu-Kalibrierung fort, wobei dieselben Volumina verwendet werden, die in Schritt 3.2 angegeben sind. Führen Sie das Experiment durch und ermitteln Sie den höchsten Fluoreszenzwert aus den getesteten K-Glu-Konzentrationen. Dies zeigt die optimale Pufferzusammensetzung für Mg-Glu und K-Glu für dieses Lysat an.
   HINWEIS: Wenn Sie sich über die optimale K-Glu-Konzentration nicht sicher sind, wiederholen Sie den Schritt mit unterschiedlicheren Konzentrationsbereichen.
6. Sobald die Mg-Glu- und K-Glu-Werte ermittelt sind, werden die Stoffrohre der optimierten Pufferzusammensetzung entsprechend dem erhaltenen Chargenvolumen vorbereitet. Verwenden Sie die Registerkarte "Puffervorbereitung" in der Zusatzdatei 1, um die Anzahl der benötigten Pufferröhrchen zu berechnen, aliquot 38 μL pro Röhrchen und bei -80 °C zu lagern.

4. Lineare DNA-Präparation

HINWEIS: Für die Lysatkalibrierung wird das Plasmid P70a-deGFP verwendet. Dieses Plasmid wurde in E. coli KL740 cl857+ (Tabelle 6) für Miniprep mit dem Plasmid Miniprep Kit oder maxiprep mit dem Plasmid Maxiprep Kit beibehalten. Lineare DNA-Fragmente, die als Expressionsschablonen in den zellfreien Reaktionen verwendet wurden, wurden mittels der in Tabelle 7 und Tabelle 8 aufgeführten Primer und Templates amplifiziert.

1. PCR-Amplifikation aus dem Plasmid P70a-deGFP unter Verwendung von DNA-Polymerase mit Oligo-Primern, die in Tabelle 7 aufgeführt sind. Stellen Sie die PCR-Reaktionen in einem Volumen von 50 μL gemäß dem Protokoll des Herstellers mit dem Thermocycler-Programm ein: [98 °C für 2 min; 40 Zyklen x (98 °C für 30 s → 66 °C für 30 s → 72 °C für 60 s); 72 °C für 10 min; 4 °C für ∞].
2. Die Template-DNA wird in den PCR-Reaktionen durch Zugabe von 1 μL DpnI-Restriktionsenzym pro 50 μL PCR-Reaktion verdaut und bei 37 °C für 1 h inkubiert. Als nächstes reinigen Sie die PCR-Reaktion mit einem PCR & DNA-Cleanup-Kit und eluieren in nukleasefreiem Wasser.
3. Überprüfen Sie die PCR-Produkte vor der Anwendung auf einem 1%igen Agarosegel (1x TAE).
4. Quantifizieren Sie die gereinigten PCR-Produkte (oder die Plasmidpräparate) mit Nanodrop (ND-1.000).
   HINWEIS: Bei Verwendung einer DNA-Polymerase/eines DNA-Puffers, die direkt mit der nachgeschalteten zellfreien Reaktion kompatibel ist, kann der Reinigungsschritt (Schritt 2) vollständig übersprungen und die Konzentration der ungereinigten DNA stattdessen durch einen fluorometrischen Assay mit DNA-bindendem Farbstoff gemessen werden (siehe Batista et ^al.10).

5. Experimentelle Ausführung

HINWEIS: Zusätzlich zur Verwendung der Zusatzdatei 1 zur Kalibrierung des Pufferlagers für jede vorbereitete Lysatcharge (oben) wird empfohlen, die Registerkarte "Reaktionsvorbereitung" in der Datei zu verwenden, um die nachfolgenden zellfreien Reaktionen einzurichten. Wie bisher wird das Volumen der Reaktionen auf 10,5 μL pro Reaktion festgelegt, von denen schließlich nur 10 μL zur Datenerfassung in die 384-Well-Platte pipettiert werden. Hier werden 5 nM jeder Vorlage für den zellfreien Ausdruck verwendet. Es ist wichtig, beim Pipettieren der Reaktionen konsistent zu sein - verwenden Sie die gleiche Pipette und die Art der Spitzen. Dosieren Sie vorsichtig, um zu vermeiden, dass Blasen im Brunnen oder Flüssigkeit an den Wänden des Bohrlochs haftet. Bei Bedarf die Platte herunterdrehen (<2.500 x g, 1 min, Raumtemperatur).

1. Berechnen Sie die zu pipettierenden Volumina, indem Sie die pro Probe benötigten Probenbeschreibungen und Replikate in die Registerkarte "Reaktionsvorbereitung" der Zusatzdatei 1 eingeben.
   HINWEIS: Wenn ein anderes Reaktionsvolumen als 10,5 μL erforderlich ist, kann dies auch in die Zusatzdatei 1 eingegeben werden. Die Datei berechnet die Anzahl der Röhrchen mit zuvor optimierten Puffervorräten und die Zellextraktröhrchen, die auf Eis aufgetaut werden sollen.
2. Markieren Sie ein 1,5-ml-Mikroröhrchen für die optimale Master-Mix-Zubereitung (getrennt für lineare und Plasmid-DNA), fügen Sie die richtigen Volumina des Puffers und des Lysats hinzu und mischen Sie vorsichtig.
   HINWEIS: Aufgrund von Unterschieden in den optimalen K-Glu-Konzentrationen in ihren Puffern sollten Kopien der Registerkarte "Reaktionsvorbereitung" erstellt werden, um sie getrennt für lineare und Plasmid-DNA zu verwenden.
3. Pipettieren Sie zuerst die DNA-Proben, gefolgt von nukleasefreiem Wasser und schließlich dem Optimal Master Mix (MM) aus Schritt 5.2. Mischen Sie die zellfreie Reaktion vorsichtig mit der Pipette, kurz bevor Sie sie in den Plattenleser geben und vermeiden Sie Blasen.
   HINWEIS: Verwenden Sie ein PCR-Acht-Streifen-Röhrchen, um das Reaktionsvolumen für eine zusätzliche Replikation zu mischen. Wenn beispielsweise technische Triplikate beabsichtigt sind, bereiten Sie eine Mischung für vier Reaktionen vor und lassen Sie ein Totvolumen im Röhrchen, um Pipettierfehler beim Hinzufügen der Proben zur Platte zu reduzieren.
4. Richten Sie die Reaktionen im Plattenleser ein (Ex 485 nm; Em 528 nm). Kinetische Läufe zeichneten Fluoreszenzdaten in regelmäßigen Abständen (z. B. 5 min) für 8 Stunden Inkubation bei 30 °C auf, mit kontinuierlichem Orbitalschütteln bei 307 cpm.
   HINWEIS: Endpunktmessungen wurden als 8-Stunden-Zeitpunkt angegeben. Die gesammelten Fluoreszenzwerte sind in beliebigen Einheiten (u.u.), können aber für die Darstellung in standardisierte Einheiten umgerechnet werden (siehe unten).

6. Relative Quantifizierung von FITC und GFP

HINWEIS: Die GFP-Expression wird vom Plattenleser in beliebigen Fluoreszenzeinheiten (u.u.) exportiert. Es wird jedoch empfohlen, standardisierte Maßeinheiten zu verwenden, um Fluoreszenzwerte zwischen verschiedenen Einstellungen (Chargen, Geräte, Benutzer und Laboratorien) zu vergleichen. Hier werden detaillierte Schritte zur Umrechnung der Fluoreszenzwerte (u.u.) in FITC-äquivalente und eGFP (μM) Werte unter Verwendung von Standardkurven von NIST-FITC und rekombinantem eGFP vorgestellt. Lagern Sie NIST-FITC-Stammlösung bei 4 °C und lagern Sie rekombinante eGFP bei -20 °C. Stellen Sie sicher, dass die Stammlösung und die seriellen Verdünnungen vor Licht geschützt sind. Bei der Lieferung wird empfohlen, das rekombinante eGFP in kleinere Volumina zu aliquotieren, um mehrere Gefrier-Tau-Zyklen zu vermeiden.

1. Eine Lösung von 100 mM Natriumborat, pH 9,5, vorbereiten und bei Raumtemperatur oder bei 4 °C lagern.
2. Bereiten Sie 12 Verdünnungen (je 70 μL) für die Standardkurve 2x pro Schritt (50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,562, 0,781, 0,390, 0,195, 0,097, 0,048 und 0 μM) NIST-rückführbaren FITC-Standards aus dem 50-μM-Bestand unter Verwendung der Natriumboratlösung vor. Bereiten Sie die Verdünnungsreihe in dreifacher Ausfertigung vor.
3. Ähnlich wie in Schritt 6.2 werden serielle Verdünnungen (jeweils 70 μL) aus dem rekombinanten eGFP unter Verwendung der Natriumboratlösung (1.2, 0.3, 0.075, 0.0188, 0.0047, 0.0012, 0.,0003, 0.,00007 und 0 μM) hergestellt. Berücksichtigen Sie für die Molaritätsberechnung die volle Größe des Proteins (28 kDa) und die Konzentration des gereinigten eGFP (1 g / L). Bereiten Sie die Verdünnungsreihe in dreifacher Ausfertigung vor.
4. Man gibt 20 μL jeder Verdünnung (jeweils neun Vertiefungen = drei Verdünnungen der Serie x drei technische Replikate) in eine Mikroplatte mit quadratischem Boden mit 384 Vertiefungen, die von einer Klebeplattendichtung bedeckt ist, und inkubiert sie zur Messung in einem Plattenleser.
   HINWEIS: Hier wurden die Einstellungen verwendet: Erregung: 485/20, Emission: 528/20, mit Verstärkung 50. Zusätzliche Wellenlängen-/Verstärkungskombinationen können jedoch auch zur Kalibrierung für andere fluoreszierende Moleküle und/oder Verstärkungseinstellungen verwendet werden. Um den Umrechnungsfaktor zu berechnen, sind die gleichen Wellenlängen- und Verstärkungseinstellungen erforderlich, um die GFP-Fluoreszenzdaten aus den zellfreien Experimenten und den Standardkurvendaten zu erfassen.
5. Verwenden Sie den linearen Signalbereich (hier z. B. [FITC] ≤ 0,781 μM), um die Steigung [y = ax und^R2] für jede Bedingung anzupassen.
   HINWEIS: Das Sortiment kann für verschiedene Maschinen und verwendete Standardlösungen unterschiedlich sein.
6. Speichern Sie die Daten für die FITC- und eGFP-Kalibrierung, um relative Messungen für das Labor zu berechnen, indem Sie dem Beispiel in Tabelle 9 folgen. Teilen Sie die in Fluoreszenz-Arbiträreinheiten (a.u.) erhaltenen Werte durch den Kurvensteigungswert "a" (y = ax), um die GFP-Produktion in Form von FITC oder eGFP zu schätzen.

Ergebnisse

Repräsentative Ergebnisse sind hier nach Kalibrierung des Lysats für optimale Mg-Glutamat- und K-Glutamat-Spiegel getrennt für lineare und Plasmid-DNA dargestellt (Abbildung 1). Die optimale Mg-Glutamat-Konzentration ist bei Δ recB- undΔ-recBCD-Extrakten bei 8 mM ähnlich (Abbildung 1B). Die optimale K-Glutamatkonzentration für Plasmid-DNA beträgt jedoch 140 mM, während die optimale K-Glutamat-Konzentration für lineare DNA für denselb...

Diskussion

Hier zeigen wir, dass Zelllysat, hergestellt aus E. coli BL21 Rosetta2 mit einem genomischen Knockout für recB - oder recBCD-Operon , eine hohe Proteinexpression aus linearen DNA-Vorlagen unterstützt. Dieses Protokoll erarbeitet ein schrittweises Lysat-Kalibrierungsverfahren speziell für lineare DNA-Templates (Abbildung 2), ein kritischer Schritt, der zur hohen Expression von σ70-Promotoren in linearer DNA führt und plasmidnahe Konzentrationen für äquimolare...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-YT Broth	Invitrogen	22712020
1.5 mL Safe-Lock tubes	Eppendorf	30120086	1.5 mL microtube
384-well square-bottom microplate	Thermo Scientific Nunc	142761
3PGA (D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium)	Sigma-Aldrich	P8877
adhesive plate seal	Thermo Scientific Nunc	232701
Agar	Invitrogen	30391023
ATP (Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate)	Sigma-Aldrich	A8937
BL21 Rosetta2	Merck Millipore	71402
BL21 Rosetta2 ΔrecB	Addgene	176582
BL21 Rosetta2 ΔrecBCD	Addgene	176583
cAMP (Adenosine 3' 5'-cyclic monophosphate)	Sigma-Aldrich	A9501
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378
CoA (Coenzyme A hydrate)	Sigma-Aldrich	C4282
Corning 15 mL PP Centrifuge Tubes, Rack Packed with CentriStar Cap, Sterile	Corning	430790	15 mL tube
Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes, Conical Bottom with CentriStar Cap, Sterile	Corning	430828	50 mL tube
CTP (Cytidine 5'-triphosphate, disodium salt hydrate)	Alfa Aesar	J62238
DpnI	NEB	R0176S
DTT (DL-Dithiothreitol)	Sigma-Aldrich	D0632
Folinic acid (solid folinic acid calcium salt)	Sigma-Aldrich	F7878
GTP (Guanosine 5?-Triphosphate,  Disodium Salt)	Sigma-Aldrich	371701
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
K phosphate dibasic (K2HPO4)	Carl Roth	231-834-5
K phosphate monobasic (H2KO4P)	Sigma-Aldrich	P5655
K-glutamate	Alfa Aesar	A17232
Mg-glutamate	Sigma-Aldrich	49605
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone	Merck Millipore	SLGP033RB	membrane filter 0.22 µm
Monarch PCR & DNA Cleanup Kit	NEB	T1030S	PCR & DNA cleanup Kit
Monarch Plasmid Miniprep Kit	NEB	T1010S	Plasmid Miniprep Kit
NAD (B-nicotinamide adenine dinucleotide hydrate)	Sigma-Aldrich	N6522
NIST-traceable FITC standard	Invitrogen	F36915	NIST-FITC
NucleoBond Xtra Maxi kit	Macherey-Nagel	740414.1	Plasmid Maxiprep Kit
PEG 8000	Sigma-Aldrich	89510
plate reader	Biotek	Synergy HTX
Purified Recombinant EGFP Protein	Chromotek	egfp-250	recombinant eGFP
Q5 High-Fidelity 2X Master Mix	NEB	M0492S	DNA polymerase
Q5 High-Fidelity 2X Master Mix	New England Biolabs	M0492L	DNA polymerase
Qubit dsDNA BR Assay Kit	Thermo	Q32850	fluorometric assay with DNA-binding dye
RTS Amino Acid Sampler	biotechrabbit	BR1401801
Spermidine	Sigma-Aldrich	85558
Sterile water			Purified water from the Millipore RiOs 8 system, sterilized by autoclaving.
Tris base	Life Science products Cytiva	17-1321-01
tRNA	Roche	10109550001
Ultrasonic processor Vibra cell VC-505	SONICS	VC505	sonicator
UTP Na3 (Uridine 5'- triphosphate, trisodium salt hydrate)	Acros Organics	226310010
Water, nuclease-free	Thermo	R0581	nuclease-free water