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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier wird eine einfach zu befolgende Methode zur Kultivierung primärer retinaler Netzhaut-Pigmentepithelzellen in vitro vorgestellt.

Zusammenfassung

Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine Monoschicht aus polarisierten pigmentierten Epithelzellen, die sich zwischen Aderhaut und Neuroretina in der Netzhaut befindet. Mehrere Funktionen, einschließlich Phagozytose, Nährstoff- / Metabolitentransport, Vitamin-A-Stoffwechsel usw., werden vom RPE täglich durchgeführt. RPE-Zellen sind terminale differenzierte Epithelzellen mit geringer oder keiner Regenerationsfähigkeit. Der Verlust von RPE-Zellen führt zu mehreren Augenerkrankungen, die zu Sehstörungen führen, wie z. B. altersbedingte Makuladegeneration. Daher ist die Etablierung eines In-vitro-Kulturmodells von primären RPE-Zellen, das dem RPE in vivo ähnlicher ist als Zelllinien, entscheidend für die charakteristischen und mechanistischen Untersuchungen von RPE-Zellen. In Anbetracht der Tatsache, dass die Quelle menschlicher Augäpfel begrenzt ist, erstellen wir ein Protokoll zur Kultivierung primärer porciner RPE-Zellen. Durch die Verwendung dieses Protokolls können RPE-Zellen leicht von erwachsenen Augäpfeln von Schweinen getrennt werden. Anschließend heften sich diese dissoziierten Zellen an Kulturschalen / -inserts, vermehren sich zu einer konfluenten Monoschicht und stellen die Schlüsselmerkmale des Epithelgewebes in vivo innerhalb von 2 Wochen schnell wieder her. Mittels qRT-PCR wird gezeigt, dass primäre porcine RPE-Zellen mehrere Signaturgene in vergleichbaren Konzentrationen mit nativem RPE-Gewebe exprimieren, während die Expression der meisten dieser Gene in menschlichen RPE-ähnlichen Zellen, ARPE-19, verloren geht bzw. stark reduziert ist. Darüber hinaus zeigt die Immunfluoreszenzfärbung die Verteilung von Tight Junction-, Gewebepolaritäts- und Zytoskelettproteinen sowie das Vorhandensein von RPE65, einer Isomerase, die für den Vitamin-A-Stoffwechsel entscheidend ist, in kultivierten Primärzellen. Insgesamt haben wir einen einfach zu befolgenden Ansatz entwickelt, um primäre porcine RPE-Zellen mit hoher Reinheit und nativen RPE-Eigenschaften zu kultivieren, der als gutes Modell dienen könnte, um die RPE-Physiologie zu verstehen, Zelltoxizitäten zu untersuchen und Medikamentenscreenings zu erleichtern.

Einleitung

Das retinale Pigmentepithel (RPE) befindet sich zwischen Photorezeptoren und Choriokapillaris in der äußeren Schicht der Netzhaut1 und hat mehrere Funktionen, einschließlich der Bildung der Blut-Retina-Schranke, des Transports und Austauschs von Nährstoffen und retinalen Metaboliten, des Recyclings von Vitamin A zur Aufrechterhaltung eines normalen Sehzyklus sowie der Phagozytose und Beseitigung der abgestoßenen äußeren Photorezeptorsegmente (POSs)2,3 . Da POSs eine ständige Selbsterneuerung erfordern, um das Sehen zu erzeugen, müssen die RPE-Zellen kontinuierlich abgelöste POSs verschlingen, um die retinale Homöostaseaufrechtzuerhalten 4. Daher führt eine RPE-Dysfunktion zu vielen erblindenden Augenerkrankungen, wie z.B. altersbedingte Makuladegeneration (AMD)4, Retinitis pigmentosa (RP)5, Lebersche kongenitale Amaurose6, diabetische Retinopathie7 usw. Bis heute ist die genaue Pathogenese der meisten dieser Krankheiten schwer fassbar. Infolgedessen wird die RPE-Zellkultur etabliert, um die RPE-Zellbiologie, pathologische Veränderungen und zugrunde liegende Mechanismen zu untersuchen.

Als einfachstes Modell zur Untersuchung der Zellbiologie wurde bereits in den 1920er Jahren mit der Kultivierung von RPE-Zellen begonnen8. Obwohl ARPE-19 als RPE-Zellen weit verbreitet ist, geben der Verlust der Pigmentierung, die Morphologie des Kopfsteinpflasters und insbesondere die Barrierefunktionen in dieser Zelllinie Anlass zur Sorge9. Im Vergleich dazu bietet die Kultur primärer humaner RPE-Zellen ein realistischeres Szenario für physiologische und pathologische Studien9. Die relativ begrenzte Verfügbarkeit schränkt jedoch ihre Nutzung ein und es gibt immer ethische Fragen. Darüber hinaus verwendeten mehrere Gruppen Mausmodelle, um RPE-Zellen zu kultivieren. Die Größe des Mausauges ist jedoch klein, und eine einzelne Kultur erfordert normalerweise viele Mäuse, was nicht praktisch ist9. In jüngster Zeit haben Wissenschaftler neue Methoden entwickelt, um menschliche embryonale Stammzellen oder induzierte pluripotente Stammzellen zur Gewinnung von RPE-Zellen zu verwenden. Obwohl diese Technik ein besonderes Potenzial für die Behandlung von erblichen RPE-Störungen hat, ist sie zeitaufwendig und benötigt in der Regel mehrere Monate, um reife RPE-Zellen zu erzeugen10. Um diese Probleme zu überwinden, stellen wir hier ein einfach zu befolgendes Protokoll vor, um hochreine RPE-Zellen routinemäßig im Labor zu isolieren und zu kultivieren. Unter geeigneten Kulturbedingungen können diese Zellen typische RPE-Funktionen aufweisen und typische RPE-Morphologien aufweisen. Daher kann diese Kulturmethode ein gutes Modell liefern, um die RPE-Physiologie zu verstehen, die Zytotoxizität zu untersuchen, pathologische Mechanismen verwandter Augenerkrankungen zu untersuchen und Medikamentenscreenings durchzuführen.

Protokoll

Die Verwendung von Versuchstieren entsprach den Vorschriften der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) und wurde von der Ethikkommission für experimentelles Tiermanagement der Universität Xiamen genehmigt.

1. Herstellung von experimentellen chirurgischen Geräten, Gewebeverdauungsenzym und Zellkulturpuffer

  1. Bereiten Sie die experimentellen chirurgischen Geräte vor, indem Sie am Tag vor der Augapfeldissektion zwei Paar ophthalmochirurgische Scheren und Pinzetten reinigen und autoklavieren und anschließend die Box mit chirurgischen Geräten in einem allgemeinen Protokollofen bei 65 °C über Nacht trocknen.
  2. Aufbereitung von Nährmedien.
    1. Bereiten Sie DMEM/Basismedien vor, ergänzt mit 10 % (v/v) fötalem Rinderserum, 2 mM L-Glutamin und 1 % (v/v) Penicillin (100 E/ml) und Streptomycin (100 E/ml).
    2. Bereiten Sie DMEM/F12-Medien vor, die mit 1% (v/v) FBS und 1% (v/v) Penicillin (100 U/ml) und Streptomycin (100 U/ml) ergänzt sind.
    3. Bereiten Sie MEM-Nic 11 vor, indem Sie MEM alpha mit 2 mM L-Glutamin, 1% FBS, 1% (v/v) Penicillin (100 U/ml) und Streptomycin (100 U/ml), 0,1 mM NEAA, 1% (v/v)N1-Ergänzung, Taurin (0,25 mg/ml), Hydrocortison (20 ng/ml), Trijod-Thyronin (0,013 ng/ml) und 10 mM Nicotinamid ergänzen.
      HINWEIS: Um die Lebensfähigkeit und Proliferation der Zellen zu verbessern, kann der Prozentsatz von FBS auf 20% erhöht werden, um Verdauungsenzyme zu neutralisieren und die dissoziierten Zellen zu säen. Für die langfristige Zellkultur kann der Prozentsatz von FBS auf bis zu 1% gesenkt werden12.
  3. Das Gewebeverdauungsenzym aliquot (0,25 % (w/v) Trypsin/EDTA-Lösung, ergänzt mit 0,91 mM EDTA, im Folgenden als Trypsin/EDTA-Lösung bezeichnet) während des Experiments auftauen.
    HINWEIS: Frische Trypsin/EDTA-Lösung sollte jedes Mal verwendet werden, um optimale Ergebnisse zu erzielen. Aliquot 10 ml frische Trypsin/EDTA-Lösung in jedes 15 ml sterile Zentrifugenröhrchen geben und die Aliquots bis zur Verwendung bei -20 °C im Kühlschrank einfrieren.
  4. Sezierlösung.
    1. Sterilisieren Sie 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) (pH 7,2), ergänzt mit 2% (v/v) Penicillin (100 U/ml) und Streptomycin (100 U/ml), indem Sie die Lösung durch eine 0,22 μm Spritzenvorsatzfiltereinheit filtrieren.
  5. Beschichten Sie die Kulturplatten und Transwell-Einsätze.
    1. Waschen Sie die Vertiefungen und Transwell-Einsätze mit 1x PBS. Entfernen Sie das PBS mit einer Pipette aus Vertiefungen und Transwells und geben Sie dann 1 ml frisches 1x PBS in die untere Kammer und 600 μl 10 μg/ml Lamininlösung in die obere Kammer.
    2. Die Platten/Transwell-Einsätze werden über Nacht bei 37 °C und 5 %CO2 im Zellkulturbrutschrank inkubiert. Entfernen Sie die Lamininlösung aus der oberen Kammer und waschen Sie zweimal mit 1 ml kaltem 1x PBS, bevor Sie die Zellen aussäen.

2. Dissektion von RPE-Zellen des Augapfels von Schweinen

  1. Vorbereitung der Instrumente.
    1. Reinigen Sie die Laminar-Flow-Haube mit 75% Ethanol und UV-Licht. Bereiten Sie drei sterile 50-ml-Zentrifugenröhrchen mit ~25 mL 75%igem Ethanol, drei sterile 50-ml-Zentrifugenröhrchen mit ~25 mL 1x PBS und drei sterile 10-cm-Zellkulturschalen mit ~15 mL 1x PBS vor.
      HINWEIS: Diese Einstellungen werden normalerweise für das Sezieren von vier Schweineaugäpfeln verwendet. Bitte vergrößern Sie, wenn mehr Augäpfel verwendet werden. Um die Lebensfähigkeit der Zelle zu verbessern, 1x PBS-Puffer auf Eis für mindestens 30 min vorkühlen. Sowohl 75% Ethanol als auch UV-Licht sind notwendig, um sicherzustellen, dass experimentelle Instrumente und Zellen nicht kontaminiert werden. Schalten Sie die UV-Lampe im Voraus ein, um den gesamten Operationstisch für mindestens 15 Minuten zu sterilisieren.
  2. Reinigen Sie die Augäpfel des Schweins.
    1. Holen Sie sich frische Augäpfel aus einem Schlachthof und halten Sie sie bis zur Sezierung auf Eis. Tränken Sie vier Schweineaugäpfel in ~ 15 ml 75% Ethanol in einer 10 cm großen Petrischale und schneiden Sie mit einer Schere und einer Pinzette das restliche Bindegewebe und die Muskeln ab.
      HINWEIS: Entfernen Sie so viel Gewebe wie möglich von außerhalb der Sklera, um Kontaminationen zu reduzieren. Schneiden Sie den Sehnerv zu diesem Zeitpunkt nicht durch, um den Transfer der Augäpfel während der Dekontamination und des Waschvorgangs zu erleichtern. Nach diesem Schritt sollten alle Verfahren in einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden.
  3. Die Augäpfel des Schweins werden dekontaminiert, indem vier Augäpfel des Schweins nacheinander in drei sterilen 50-ml-Zentrifugenröhrchen, die mit 75% Ethanol gefüllt sind, eingeweicht und gewaschen werden. Jeder Augapfel wird für mindestens 5 min in jedes Röhrchen getaucht. Als nächstes waschen Sie die Augäpfel des Schweins nacheinander in drei sterilen 50-ml-Zentrifugenröhrchen, die mit 1x PBS gefüllt sind. Waschen Sie jeden Augapfel mindestens 5 Minuten lang in jeder Tube (Abbildung 1A). Drehen Sie die Schläuche jede Minute um, um die Augäpfel gründlich zu waschen.
  4. Dissektion von Augäpfeln bei Schweinen.
    1. Bewegen Sie die vier Augäpfel des Schweins in eine 10 cm große sterile Zellkulturschale mit 1x PBS. Schneiden Sie die äußere Oberfläche jedes Augapfels erneut ab, um den Sehnerv und kleine Trümmer zu entfernen (Abbildung 1B). Verwenden Sie eine Schere, um einen kleinen Schnitt am Schnittpunkt von Limbus und Sklera zu machen, und entfernen Sie dann die Hornhaut, die Iris, die Linse, den Glaskörper und die neurale Netzhaut (für detaillierte Strukturen dieser Gewebe siehe Abbildung 1).
    2. Übertragen Sie den RPE-Aderhaut-Sklera-Komplex in eine neue 10 cm große Zellkulturschale und machen Sie vier Schnitte, um die Augenmuschel in Form eines vierblättrigen Kleeblatts zu glätten (Abbildung 1C).
  5. Führen Sie den Aufschluss der Trypsin/EDTA-Lösung durch, indem Sie die vier RPE-Aderhaut-Sklera-Komplexe in eine neue 10-cm-Schale geben. Gießen Sie 20 ml frische Trypsin/EDTA-Lösung, um die RPE-Aderhaut-Sklera-Komplexe zu verschmelzen, und geben Sie die Schale für ~30 min in den Zellkultur-Inkubator bei 37 °C.
    HINWEIS: Verwenden Sie frische Trypsin/EDTA-Lösung, um die RPE-Zellen zu dissoziieren. Der Zeitpunkt der Verdauung von Trypsin/EDTA-Lösung ist sorgfältig zu kontrollieren, da eine längere Inkubationszeit (mehr als 30 Minuten) die Kontamination anderer Zelltypen erhöhen kann.

3. Isolierung und Kultur von RPE-Zellen des Augapfels bei Schweinen

  1. RPE-Dissoziation.
    1. Nehmen Sie die Schale nach 30 Minuten Inkubation mit Trypsin/EDTA-Lösung aus dem Inkubator und geben Sie 20 ml vorgewärmte Nährmedien (mit 10% FBS) in die Schale, um die Trypsin/EDTA-Lösung zu neutralisieren.
      HINWEIS: In diesem Schritt werden nur DMEM/Basic-Medien verwendet. Wenn Zellen Konfluenz erreichen, können je nach Versuchsbedingungen drei Kulturmedien verwendet werden: DMEM/Basismedien, DMEM/F12-Medien und MEM-Nic-Medien.
    2. Verwenden Sie eine 5-ml-Transferpipette, um die RPE-Zellen durch vorsichtiges Pipettieren mehrmals zu dissoziieren. Die Zellsuspensionen werden in 15-ml-Zentrifugenröhrchen gesammelt. Verwenden Sie weitere 10 ml frisches Nährmedium (10% FBS), um die RPE-Aderhaut-Sklera-Komplexe auf der Schale zu waschen, indem Sie vorsichtig pipettieren, um so viele RPE-Zellen wie möglich zu erhalten.
      HINWEIS: Trituieren Sie die Zellen nicht zu stark. Stellen Sie sicher, dass die Pipette mit einer Geschwindigkeit von ca. 3 ml/s gefüllt und entleert wird. Vermeiden Sie ein Aufblasen der Zellsuspension.
  2. Sammeln Sie RPE-Zellen, indem Sie die Röhrchen bei 200 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Saugen Sie den Überstand mit einer Pipette ab und fügen Sie weitere 5 ml Nährmedium (10% FBS) hinzu, um die Zellen zu resuspendieren, und zentrifugieren Sie weitere 5 Minuten lang bei 200 x g . Dekantieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen mit 12 ml Nährmedien.
    HINWEIS: Lassen Sie beim Absaugen des Überstands etwa 1 ml Medium stehen, um das Aufbrechen von Zellklumpen zu vermeiden.
  3. Aussaat von RPE-Zellen.
    1. Säen Sie ~ 1-2 x 105 Zellen / Vertiefung in 12-Well-Kulturplatten oder Transwell-Einsätze. Üblicherweise werden etwa 1,5 x 106 RPE-Zellen aus vier Schweineaugäpfeln gewonnen. Wechseln Sie die Nährmedien alle 2 Tage und reduzieren Sie die Serumkonzentration auf 1%, wenn die Zellen die Oberfläche der Vertiefungen/Inserts vollständig bedecken.
      HINWEIS: Bewegen Sie die Zellkulturschale nicht zu häufig, bevor sich die Zellen an der Kulturschale / den Einsätzen anheften.
  4. Wechseln Sie die Nährmedien alle 2 Tage, bis die Zellen geerntet sind.
    HINWEIS: Die Konzentration von FBS kann reduziert werden, nachdem die Zellen die Konfluenz erreicht haben, und die Zellen können bis zu mehreren Monaten kultiviert werden, um eine vollständige Differenzierung und Reifung zu ermöglichen.

4. Charakterisierung primärer porciner RPE-Zellen

  1. Kulturieren Sie die Zellen am Zusammenfluss für 1 oder 2 Wochen und ernten Sie dann die Zellen für die weitere Analyse.
  2. Erntezellen für die quantitative real-time PCR (qRT-PCR) Analyse.
    1. Entfernen Sie die Nährmedien, waschen Sie die Zellen mit 1 ml kaltem 1x PBS und geben Sie dann 500 μL RNA-Extraktionslösung in jede Vertiefung, um Zelllysat aus etwa 1 x 106 Zellen zu sammeln.
    2. Extrakt mRNA13; Aus jeder Probe werden ca. 4 μg RNA extrahiert. Verwenden Sie 100 ng mRNA, um eine reverse Transkriptiondurchzuführen 14; Verdünnen Sie die cDNA um das 40-fache für die quantitative Echtzeit-PCR-Analyse. Primer sind in Tabelle 1 aufgeführt.
  3. Ernten Sie Zellen für die Immunfluoreszenzfärbung.
    1. Entfernen Sie das Nährmedium, waschen Sie die Zellen mit 1 ml kaltem 1x PBS und fügen Sie dann 500 μL 4% (w/v) Paraformaldehyd in 1x PBS hinzu, um die Zellen (ca. 1 x 106 Zellen / Well) für 30 min bei Raumtemperatur zu fixieren. Anschließend werden die Zellen zweimal mit 1x PBS gewaschen und eine Immunfluoreszenzfärbung mit primären Antikörpern (1:100 in 1x PBS ergänzt mit 1% (w/v) Rinderserumalbumin) bei 4 °C über Nacht und sekundären Antikörpern (1:200 in 1x PBS ergänzt mit 1% (w/v) Rinderserumalbumin) bei Raumtemperatur für 2 h gemäß Online-Protokollen15 durchgeführt.
    2. Die Immunfluoreszenzbilder werden mit einem konfokalen Mikroskop nach dem Online-Handbuch16 aufgenommen.
  4. Ernten Sie Zellen für die Western-Blot-Analyse.
    1. Entfernen Sie die Nährmedien, waschen Sie die Zellen zweimal mit kaltem 1x PBS und geben Sie dann 80 μL RIPA-Puffer (mit 1x Protease-Inhibitor) in jede Vertiefung und kratzen Sie mit Zellabstreifern etwa 1 x 106 Zellen von den Schalen/Einsätzen.
    2. Sammeln Sie das Zelllysat aus jeder Vertiefung / jedem Einsatz in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Kochen Sie die Zelllysate für 10 Minuten und messen Sie dann die Proteinkonzentrationen mit BCA-Kits. Die Proteinkonzentration jeder Probe beträgt etwa 2 mg/ml. Verwenden Sie 25 μg Proteine jeder Probe für die Western-Blot-Analyse gemäß den Online-Protokollen17.
    3. Bei Western Blot werden die Membranen in 5 ml primärer Antikörperlösung (1:1.000 Verdünnung der primären Antikörper in 1x TBST-Lösung, ergänzt mit 5% (w/v) Rinderserumalbumin) bei 4 °C über Nacht auf einem rotierenden Mehrzweckschüttler inkubiert.
    4. Anschließend wird die Membran mit etwa 15 ml sekundärer Anti-Kaninchen- oder Anti-Maus-Sekundärantikörperlösung (1:5.000 Verdünnung von Sekundärantikörpern in 1x TBST-Lösung, ergänzt mit 5% (w/v) fettfreier Milch) bei Raumtemperatur für 2 h auf einem Orbitalschüttler entsprechend der Quelle des verwendeten primären Antikörpers inkubiert.
  5. Messung des transepithelialen Widerstandes (TER).
    1. Waschen Sie die Essstäbchenelektroden nacheinander mit 70% Ethanol und sterilem 1x PBS. Legen Sie dann das kürzere Ende der Elektrode in die obere Kammer und das längere Ende in die untere Kammer der Transwell-Einsätze und klicken Sie auf den Knopf am Epithelvoltmeter für die Messungen. Notieren Sie die TER-Messungen jedes Bohrlochs in dreifacher Ausfertigung.

Ergebnisse

Die primären porcinen RPE-Zellen (pRPE) wurden in DMEM/Basismedien mit 10% FBS kultiviert, und die Zellmorphologie unter dem Lichtmikroskop wurde 2 Tage (Abbildung 2A), 6 Tage (Abbildung 2B) und 10 Tage (Abbildung 2C) nach der Aussaat fotografiert. Nach 1 Woche wurde eine konfluente Monoschicht von pigmentierten pRPE-Zellen mit Kopfsteinpflaster-Morphologien beobachtet.

Um die primären pRPE-Zellen besse...

Diskussion

Hier wurde ein detailliertes und optimiertes Protokoll für die Isolierung, Kultur und Charakterisierung von RPE-Zellen aus Augäpfeln von Schweinen beschrieben, das ein gutes Modell für die In-vitro-Charakterisierung von RPE-Zellen und RPE-bezogene Störungsstudien erzeugt. Methoden zur Isolierung des RPE aus den Augen von Menschen, Mäusen und Ratten wurden bereitsbeschrieben 23,24,25. In einigen Laboratorien ist es ...

Offenlegungen

Alle Autoren gaben an, dass es keine Interessenkonflikte gibt.

Alle Autoren erklären, dass keine finanziellen Interessenkonflikte im Zusammenhang stehen.

Danksagungen

Die Autoren möchten allen Tieren, die ihre Zellen in diese Studie einbringen, ihre Dankbarkeit und ihren Respekt entgegenbringen. Diese Studie wurde zum Teil durch Zuschüsse des National Key R&D Program of China (2019YFA0111200, Yi Liao & Yuan Gao und Grant No. 2018YFA0107301, Wei Li) unterstützt. Die Autoren danken Jingru Huang und Xiang You vom Central Lab, School of Medicine, Xiamen University für die technische Unterstützung bei der konfokalen Bildgebung.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
ARPE-19 cellsCCTCCGDC0323
Bovine serum albuminYeasen36101ES60
Confocal microscopyZeissLSM 880 with Airyscan
ChemiDoc TouchBio-Rad1708370
Cell scraperSangonF619301
10 cm culture dishNEST121621EH01
12-well culture plateNEST29821075P
DMEM F12 MediumGibcoC11330500BT
DMEM basic MediumGibcoC11995500BT
EVOM2World Precision InstrumentsEVOM2For TER measurement
Fetal bovine serumExCell BioFSP500
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488ThermoFisher Scientific A-11034
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594ThermoFisher ScientificA-11012
Goat anti Mouse IgG (H/L):HRPBio-Rad0300-0108P
Goat anti Rabbit IgG (H/L):HRPBio-Rad5196-2504
hydrocortisoneMCEHY-N0583/CS-2226
Hoechst 33342 solution (20 mM)ThermoFisher Scientific62249
LightCycler 96 InstrumentRoche5815916001
LiothyronineMCEHY-A0070A/CS-4141
lamininSigma-AldrichL2020-1MG
MEM(1X)+GlutaMAX MediumGibco10566-016
MEM NEAA(100X)Gibco11140-050
Millex-GP syringe filter unitMilliporeSLGPR33RB
N1Sigma-AldrichSLCF4683
NcmECL UltraNew Cell&Molecular BiotechP10300
Non-fat Powdered MilkSolarbioD8340
NicotinamideSparkJadeSJ-MV0061
Na+-K+ ATPase antibodyAbcamab76020Recognize both human and porcine proteins
PAGE Gel Fast Preparation Kit(10%)EpizymePG112
primary Human RPE cells --Generous gift from Shoubi Wang lab 
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific23225
PrismGraphPad by Dotmaticsversion 8.0
Protease Inhibitor CocktailsAPExBIOK1024
PRE65 antibodyProteintech17939-1-APRecognize both human and porcine proteins
PEDF antibodySanta Cruz Biotechnologysc-390172Recognize both human and porcine proteins
100 x penicillin/streptomycin Biological Industries03-031-1BCS
Phosphate buffered saline (PBS)RARBIORA-9005
ReverTra Ace qPCR RT Master MixToyoboFSQ-201
RIPA bufferThermoFisher Scientific 89900
15 mL sterile centrifuge tubesNEST601052
50 mL sterile centrifuge tubesNEST602052
0.25% Trypsin-EDTAGibco25200-056
TaurineDamas-beta107-35-7
TrizolThermo-Fisher 15596026RNA extraction solution
TB Green Fast qPCR MixTakaraRR430A
12-well transwell insertsLabselect14212
VEGF antibodyProteintech19003-1-APRecognize both human and porcine proteins
VEGF ELISA kitNovusbioVAL106
ZO-1 antibodyABclonalA0659Recognize both human and porcine proteins

Referenzen

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