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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier berichten wir über ein Protokoll zur Quantifizierung und Differenzierung von myokardialen B-Lymphozyten basierend auf ihrer Lage im intravaskulären oder endothelialen Raum mittels Durchflusszytometrie.

Zusammenfassung

Eine wachsende Zahl von Beweisen zeigt, dass B-Lymphozyten eine wichtige Rolle im Zusammenhang mit der Myokardphysiologie und der myokardialen Anpassung an Verletzungen spielen. In der Literatur gibt es jedoch widersprüchliche Daten zur Prävalenz von Myokard-B-Zellen. Es wurde berichtet, dass B-Zellen sowohl zu den am häufigsten vorkommenden Immunzellen im Nagetierherz gehören als auch vorhanden sind, jedoch mit einer deutlich geringeren Prävalenz als myeloische Zellen oder ziemlich selten sind. In ähnlicher Weise haben mehrere Gruppen beschrieben, dass die Anzahl der myokardialen B-Zellen nach akuter ischämischer Myokardverletzung zunimmt, aber eine Gruppe berichtete über keine Veränderungen in der Anzahl der B-Zellen des verletzten Myokards. Die Implementierung einer gemeinsamen, reproduzierbaren Methode zur Beurteilung der Prävalenz von myokardialen B-Zellen ist entscheidend, um die Beobachtungen verschiedener Forschungsgruppen zu harmonisieren und so die Weiterentwicklung der Untersuchung von B-Zell-Myokardinteraktionen zu fördern. Basierend auf unseren Erfahrungen stammen die scheinbar gegensätzlichen Beobachtungen, die in der Literatur berichtet werden, wahrscheinlich auf die Tatsache, dass murine myokardiale B-Zellen meist intravaskulär und mit dem mikrovaskulären Endothel verbunden sind. Daher ist die Anzahl der B-Zellen, die aus einem murinen Herzen gewonnen werden, äußerst empfindlich gegenüber den Perfusionsbedingungen, die zur Reinigung des Organs verwendet werden, und von der verwendeten Verdauungsmethode. Hier berichten wir über ein optimiertes Protokoll, das diese beiden kritischen Variablen auf spezifische Weise berücksichtigt. Dieses Protokoll ermöglicht eine reproduzierbare, auf Durchflusszytometrie basierende Analyse der Anzahl der murinen myokardialen B-Zellen und ermöglicht es den Forschern, extravaskuläre vs. intravaskuläre myokardiale B-Zellen zu unterscheiden.

Einleitung

B-Lymphozyten sind hochspezialisierte Immunzellen, die sowohl bei der adaptiven als auch bei der angeborenen Immunantwort eine wichtige Rolle spielen1. Es gibt zwei Hauptpopulationen von B-Zellen: eine kleinere Population von B1-Zellen, die hauptsächlich während des embryonalen Lebens produziert werden, und eine überwiegende Population von B2-Zellen, die im Erwachsenenalter im Knochenmark produziert werden1. Nach der Reifung im Knochenmark wandern B-Zellen zu primären und sekundären lymphatischen Organen. Von dort aus zirkulieren sie kontinuierlich zwischen lymphatischen Organen, die sich durch Blutgefäße und Lymphgefäße bewegen2. B-Zellen exprimieren auf ihrer Oberfläche spezifische Antikörper, die als Rezeptoren fungieren. Wenn B-Zellen auf ein Antigen treffen, das an ihren Rezeptor bindet, kann ein aktivierendes Signal ausgelöst werden. Aktivierte B-Zellen wandern entweder in das Gewebe, in dem das Antigen gefunden wurde, oder kehren ins Knochenmark zurück, wo sie zu Antikörper produzierenden Plasmazellen heranreifenkönnen 3,4.

In jüngster Zeit wurde erkannt, dass das Herz eine beträchtliche Population von B-Zellen beherbergt. Studien an Nagetieren haben gezeigt, dass B-Zellen das Herz früh während der Embryonalentwicklung besiedeln5 und dass myokardiale B-Zellen meist intravaskuläre, naive B2-Zellen sind, die am Endothel6,7 haften, mit einem kleinen Prozentsatz von B1-Zellen7. Es gibt noch viele Bereiche der Unsicherheit, aber die verfügbaren Daten deuten darauf hin, dass B-Zellen sowohl im naiven Herzen als auch im Zusammenhang mit der myokardialen Anpassung an Verletzungen eine wichtige Rolle spielen.

Studien am naiven murinen Herzen haben gezeigt, dass myokardiale B-Zellen zu Beginn der Studie hauptsächlich im intravaskulären Raum lokalisiert sind und an das Endothel gebunden sind (>95% der murinen kardialen B-Zellen befanden sich im intravaskulären Raum). Es wurde festgestellt, dass diese B-Zellen andere Genexpressionsmuster aufweisen als zirkulierende B-Zellen, die aus dem peripheren Blut isoliert wurden. Die Analyse naiver Herzen von B-Zell-defizienten Tieren und syngenen Kontrollen ergab, dass Tiere ohne B-Zellen kleinere Herzen und eine höhere Ejektionsfraktion hatten6. All diese Beweise deuten darauf hin, dass B-Zellen das Myokardwachstum und/oder die Myokardfunktion modulieren könnten und dass nicht nur interstitielle, sondern auch intravaskuläre B-Zellen für solche Beobachtungen verantwortlich sein könnten. Es wurde auch festgestellt, dass B-Zellen den Phänotyp von myokardialen residenten Makrophagen modulieren8.

Mehrere Studien haben gezeigt, dass B-Zellen eine wichtige Rolle im Zusammenhang mit der myokardialen Anpassung an Verletzungenspielen 8,9,10,11,12,13. B-Zellen reichern sich vorübergehend im verletzten Herzen an, wahrscheinlich durch einen CXCL13-CXCR5-abhängigen Mechanismus11,13. Von dort aus fördern B-Zellen den nachteiligen kardialen Umbau durch mehrere Mechanismen, zu denen auch die Zytokin-vermittelte Monozytenrekrutierung 9,12 gehört. Darüber hinaus können B-Zellen Antikörper gegen Herzproteine produzieren, die die Ausdehnung von Herzschäden und nachteiligen kardialen Umbau durch mehrere Mechanismen fördern können 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . B-Zellen können durch die Sekretion von IL-1010 auch schützende Wirkungen auf das verletzte Herz ausüben.

Da die Zahl der Gruppen, die die Rolle von B-Zellen im naiven und verletzten Herzen untersuchen, wächst, wird es immer wichtiger, gemeinsame Protokolle zu definieren, um myokardiale B-Zellen richtig zu quantifizieren und zu bewerten und so Inkonsistenzen zu vermeiden, die bereits in der Literatur aufgetreten sind. Bisher wurde berichtet, dass B-Zellen eine der häufigsten Immunzellen im Nagetierherz sind7 und in einer deutlich geringeren Prävalenz als myeloische Zellen vorhanden sind 26,27 oder ziemlich selten 28. In ähnlicher Weise haben mehrere Gruppen beschrieben, dass die Anzahl der myokardialen B-Zellen nach akuter ischämischer Myokardverletzung zunimmt 7,9,13, aber eine Gruppe berichtete über keine Veränderungen in der Anzahl der B-Zellen des verletzten Myokards29. Studien an kardialen Immunzellen geben selten Details über die Durchblutungsbedingungen und es gibt keinen Konsens über die Verdauungsbedingungen. Da im Nagetierherz ein großer Teil der B-Zellen intravaskulär ist und die Extraktion von Immunzellen aus dem Myokard stark von der verwendeten Verdauungsmethode abhängt, könnten die in der Literatur berichteten Unterschiede auf Unterschiede in der Organdurchblutung und der Gewebeverdauung zurückzuführen sein.

Hier wird eine detaillierte Methode zur Durchflusszytometrie-basierten Quantifizierung von murinen myokardialen B-Zellen vorgestellt, die die Ausbeute der B-Zell-Erholung durch Optimierung der Perfusions- und Verdauungsbedingungen maximiert und die Unterscheidung von intravaskulären vs. extravaskulären myokardialen B-Zellen ermöglicht6. Dieses Protokoll ist eine Anpassung und Optimierung anderer ähnlicher Protokolle, die zwischen intravaskulären und interstitiellen Immunzellen unterscheiden 28,30,31.

In diesem Protokoll standardisieren wir die Myokardperfusion, um B-Zellen zu eliminieren, die im intravaskulären Raum schwimmen, ohne biologisch relevante B-Zellen zu entfernen, die am mikrovaskulären Endothel haften. Aufbauend auf früheren Protokollen, die die Verwendung der intravenösen Injektion von Antikörpern zur Unterscheidung von intravaskulären von interstitiellen Immunzellenbeschrieben haben 32, und unter Ausnutzung der Tatsache, dass B-Zellen den Oberflächenmarker B22033 exprimieren, zeigen wir, wie intravaskuläre vs. extravaskuläre myokardiale B-Zellen durch intravaskuläre Injektion eines B220-spezifischen Antikörpers unmittelbar vor der Tiertötung und Herzperfusion unterschieden werden können. Dieses Protokoll ist relevant für die Forschung eines jeden Wissenschaftlers, der daran interessiert ist, die Analyse von Myokard-B-Zellen im naiven und verletzten Herzen einzubeziehen. Die breite Implementierung dieses Protokolls wird Inkonsistenzen zwischen den Forschungsgruppen reduzieren, die Analyse von Veränderungen in den intravaskulären und extravaskulären myokardialen B-Zell-Pools ermöglichen und somit den Fortschritt der Entdeckungen auf dem Gebiet der kardialen Immunologie unterstützen.

Zusammenfassend stellt das Protokoll einen optimierten Workflow dar, um myokardiale B-Zellen mittels Durchflusszytometrie zu quantifizieren und zu analysieren und gleichzeitig zwischen Zellen im extravaskulären Raum und im intravaskulären Raum zu unterscheiden.

Protokoll

Alle in diesem Manuskript beschriebenen Experimente wurden mit Genehmigung der IACUC an der Johns Hopkins University School of Medicine durchgeführt.

1. Vorbereitungen

  1. Bereiten Sie den FACS-Puffer vor, wie in Tabelle 1 beschrieben.
  2. Stellen Sie sicher, dass genügend CO2 vorhanden ist, um die Tiere einzuschläfern.
  3. Bereiten Sie den Sezierraum vor (platzieren Sie das Tischpad und legen Sie das Klebeband und die Sezierwerkzeuge in die Nähe).
  4. Beschriften Sie die 15-ml-Röhrchen, geben Sie 3 ml HBSS mit Kalzium und Magnesium in jedes Röhrchen (siehe Materialtabelle) und legen Sie sie auf Eis (ein Röhrchen pro Herz und ein zusätzliches Röhrchen für die Referenzgruppe/Durchflusszytometrie-Kontrollen). Füllen Sie auch die kleinen (35 mm) Petrischalen mit HBSS.
  5. Schalten Sie den temperierten Schüttler ein, stellen Sie ihn auf 37 °C ein und kühlen Sie die Zentrifuge auf 4 °C vor.
  6. Bereiten Sie die Spritzenpumpe vor und stellen Sie die Durchflussrate auf 3 ml/min ein. Füllen Sie eine 20-ml-Spritze mit HBSS, füllen Sie die Röhrchenleitung mit Puffer und entfernen Sie alle Blasen.

2. Intravaskuläre B-Zell-Färbung (in vivo)

  1. Wiegen Sie eine 12 Wochen alte männliche Maus des Stammes C57BL/6J. Laden Sie eine 3/10 cc Insulinspritze mit 100 μL der B220-Antikörperverdünnung (1:10, in PBS). Decken Sie die Spritze mit Alufolie ab, um den Inhalt vor Licht zu schützen.
  2. Betäuben Sie eine Maus.
    1. Tragen Sie eine intraperitoneale Injektion von 2% 2,2,2-Tribromethanol mit einer Dosis von 400 mg / kg auf und warten Sie 10-20 min.
      HINWEIS: Überwachen Sie die Atmung und Bewegung der Maus. Sobald sich die Maus nicht mehr bewegt, stimulieren Sie den Schmerz, indem Sie den Zeh kneifen. Das Fehlen eines Entzugsreflexes weist auf eine ausreichende Anästhesie hin.
    2. Wenn innerhalb von 20 Minuten keine ausreichende Anästhesie erreicht wird, kann eine zusätzliche Narkosedosis von 100 mg/kg verabreicht werden, und alle 5 Minuten sollte eine Beurteilung der Mauskinetik, des Entzugsreflexes und der Atmung erfolgen.
  3. Legen Sie die Maus auf den Labortisch auf eine zur Seite geneigte Bankunterlage, ziehen Sie vorsichtig die Haut des Rückens herunter und drücken Sie den Körper leicht gegen die Bank, damit das Auge hervorsteht.
  4. Injizieren Sie den verdünnten B220-Antikörper aus Schritt 2.1 durch retroorbitale Injektion.
    1. Führen Sie die Spritze in einem Winkel von 45° von der sagittalen Ebene des Mauskopfes in das Auge ein. Injizieren Sie die Lösung langsam. Wenn Widerstand zu spüren ist, entfernen Sie die Spritze und treten Sie wieder ein. Warten Sie 2 Min.
      HINWEIS: Eine verlängerte Inkubationszeit würde die Fähigkeit gefährden, intravaskuläre vs. extravaskuläre B-Zellen zu unterscheiden, da sie dem injizierten Antikörper Zeit geben würde, außerhalb des Gefäßsystems zu diffundieren.
  5. Euthanasieren Sie die Maus gemäß den IACUC-Vorschriften.
    1. Öffnen Sie den CO2 -Durchfluss in die Euthanasiekammer mit einer Geschwindigkeit von 0,5 l / min oder der empfohlenen Durchflussrate basierend auf der Größe Ihrer Kammer.
    2. Legen Sie die Maus für die empfohlene Zeit in die Kammer und stellen Sie sicher, dass sie nicht mehr atmet. Entfernen Sie es und führen Sie eine Gebärmutterhalsluxation als sekundäre Methode der Euthanasie durch.
    3. Sobald die Maus eingeschläfert ist, fahren Sie sofort mit der Organentnahme und Perfusion fort.

3. Herz-Kollektion

  1. Brustöffnung.
    1. Halten Sie die Haut der Maus mit einer Pinzette im Oberbauchbereich. Machen Sie mit einer Schere eine 2 mm große Öffnung in der Haut und ziehen Sie die Haut mit der Pinzette ab, um die Faszienschicht, eine glänzende durchscheinende Schicht, der Brust und des Bauches freizulegen. Schneiden Sie am Epigastrium durch die Faszie und das Peritoneum, um die Bauchdecke zu öffnen und den Xiphoid-Prozess zu enthüllen. Klemmen Sie den Xiphoid-Prozess mit einer hämostatischen Pinzette.
    2. Machen Sie mit der Schere einen vertikalen Schnitt durch die Brustwand auf Höhe der mittleren Schlüsselbeinlinie auf jeder Seite und heben Sie die vordere Brustwand an, um den Mediastinuminhalt freizulegen, wobei Sie hämostatische Pinzetten als Gewicht verwenden, um die Öffnung aufrechtzuerhalten.
  2. Herzdurchblutung und -extraktion.
    1. Entfernen Sie mit einer Pinzette Fett oder Thymusgewebe, das das Herz umgibt.
    2. Halten Sie die Aorta sicher von hinten mit einer Pinzette. Führen Sie die Spritzennadel (25 G) in die Herzspitze ein. Durchblutung mit 3 ml HBSS mit einer Rate von 3 ml/min.
      HINWEIS: Überwachen Sie die Perfusion. Die Leber sollte sich füllen und Blut in den Herzkranzgefäßen sollte vollständig entfernt werden. Die Verwendung einer Spritzenpumpe, die auf 1 ml / Minute kalibriert ist, wird empfohlen, um einen gleichmäßigen Durchfluss aufrechtzuerhalten.
    3. Schneiden Sie die Aorta mit einer Schere auf und nehmen Sie das Herz heraus. Waschen Sie das Herz in der Petrischale mit HBSS, um das restliche Blut zu entfernen. Entfernen Sie mit Schere und Pinzette Fett, Bindegewebe und Thymusdrüse und trocknen Sie das Herz. Wiegen Sie das isolierte Herz und notieren Sie das Gewicht in Milligramm. Das Herz bei Raumtemperatur mit einer Klinge in kleine Stücke (1-2 mm) zerkleinern.
      HINWEIS: Erwachsene Mäuseherzen können zwischen 0,090 und 0,210 mg wiegen.
    4. Messen Sie die Masse des Herzgewebes und geben Sie 60 mg des zu verdauenden Herzhackfleisches in ein 15-ml-Röhrchen mit 3 ml HBSS. Das verbleibende Herzgewebe wird aufbewahrt und in ein Röhrchen mit der Aufschrift "Referenzkontrollgewebe" gegeben. Dies wird für die Kompensationskontrolle von Lebend-Tot-Signal und Autofluoreszenz verwendet.

4. Herzverdauung und Zellfärbung

  1. Geben Sie Enzyme in jedes Röhrchen, das Hackfleisch enthält (siehe Tabelle 1). Geben Sie 0,5 μL/mg DNase 1 (300 Einheiten für 60 mg Herzgewebe), 0,5 μL/mg Kollagenase II (625 Einheiten für 60 mg Herzgewebe) und 0,2 μL/mg Hyaluronidase (50 Einheiten für 60 mg Herzgewebe) in das Röhrchen.
  2. Die Aufschlussreaktion für 30 min bei 300 U/min in den Shaker geben. Stellen Sie das Rüttelgestell auf ca. 25° Neigung ein.
  3. In jedes der 15 ml Reaktionsröhrchen werden jeweils 7 ml HBSS gegeben und bei 250 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert, wobei die Beschleunigung und das Bremsen auf mäßig oder langsam eingestellt sind. Dekantieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie jedes Pellet in 5 ml ACK-Lysepuffer, um rote Blutkörperchen zu entfernen. Im ACK-Lysepuffer 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  4. Geben Sie 10 ml PBS in jedes Röhrchen, mischen Sie es und filtrieren Sie es dann in ein 50-ml-Röhrchen mit einem 40-μm-Sieb. Stellen Sie sicher, dass sich alle Ablagerungen in der Filterkammer befinden. Zertrümmern Sie alle Schmutzpartikel auf dem Filter mit einem Spritzenkolben, bis er vollständig in der Filterkammer suspendiert ist.
  5. Fügen Sie PBS durch den Filter hinzu, bis das Volumen 25 ml pro Herz erreicht. Dadurch können die suspendierten Zellen den Filter passieren. Geben Sie weitere 25 ml PBS in das Kontrollgeweberöhrchen der Referenz und teilen Sie das Volumen in verschiedene Röhrchen (jeweils 25 ml) auf. Beschriften Sie eine der Röhrchen mit "Unbefleckt" und die andere mit "Lebend-tot". Zentrifuge bei 250 x g für 5 min bei 4 °C.
    HINWEIS: Bereiten Sie an dieser Stelle die Verdünnung für den Lebendfleck vor (Verdünnung: 1:500 in 1x PBS).
  6. Dekantieren Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Pellet im ungefärbten Röhrchen in 100 μL PBS und jedes der anderen Pellets in 100 μL der Lebend-Tot-Fleck-Verdünnung. 30 min im Dunkeln auf Eis brüten und den Eiskübel mit Aluminiumfolie abdecken.
  7. Fügen Sie jeder Probe 500 μL FACS-Puffer hinzu und geben Sie sie durch einen 40-μm-Filter in ein markiertes FACS-Röhrchen. Die FACS-Röhrchen werden bei 250 x g 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Verwerfen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie das Pellet in 500 μL FACS-Puffer.
  8. Geben Sie 50 μl Fc-Blockierungslösung (siehe Tabelle 1) in jedes Röhrchen, mit Ausnahme der Röhrchen "Ungefärbt" und "Lebend-tot". Mischen und 5 Minuten inkubieren.
  9. 50 μl Antikörpermischungslösung (siehe Tabelle 1) in jedes Röhrchen geben, mit Ausnahme der Röhrchen "Ungefärbt" und "Lebendtot", und 30 Minuten im Dunkeln inkubieren, wobei der Eiskübel mit Aluminiumfolie bedeckt ist.
  10. 2 ml FACS-Puffer in jedes Röhrchen geben und bei 250 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie ihn in 300-500 μL FACS-Puffer.

5. Durchflusszytometrie

  1. Richten Sie die Einstellungen für die Gerätesteuerung ein.
    HINWEIS: In diesem Protokoll wird die Probe mit einem Cytek Aurora Durchflusszytometer mit 4 Lasern analysiert. Ein weiteres geeignetes Durchflusszytometer könnte verwendet werden, um die interessierenden Marker zu detektieren.
    1. Öffnen Sie die Instrumentensteuerungssoftware (siehe Materialtabelle). Wählen Sie oben im Fenster die Registerkarte Akquisition und klicken Sie auf Neu +. Ein Fenster mit dem Namen "Neues Experiment erstellen " wird angezeigt.
    2. Geben Sie im Abschnitt Bibliothek im Feld Zu filternde Eingabe die Zeichenfolge PE, PerCP-Cy5.5, BV421, Alexa Fluor 700 und Zombie Aqua ein, und klicken Sie nach der Eingabe auf Hinzufügen . Die Namen der Fluorophore sollten rechts zu sehen sein. Klicken Sie dann auf Weiter , um zur Registerkarte Gruppe zu gelangen.
    3. Klicken Sie auf der Registerkarte Gruppe auf das Symbol mit einer Röhre, um das Herz für die Analyse hinzuzufügen.
    4. Klicken Sie auf die Gruppe + Referenz und ein Fenster wird angezeigt. Wählen Sie in der Spalte "fluoreszierendes Tag" die Option " Zombie Aqua" aus, wählen Sie in der Spalte " Steuerelementtyp" die Option "Zellen" aus, und klicken Sie dann auf "Speichern".
    5. Klicken Sie > Registerkarte "Marken" auf "Weiter ". Es wird eine Tabelle mit den Namen der Fluorophore angezeigt. Geben Sie den entsprechenden Zellmarker in die erste Zeile jeder Fluorophorspalte ein, und geben Sie Folgendes ein: CD45 für PerCP-Cy5.5; CD19 für BV421; CD11b für Alexa Fluor 700; B220 für PE; und lebend tot für Zombie Aqua.
    6. Klicken Sie zweimal auf Weiter , um zur Registerkarte " Erfassung" zu gelangen. Geben Sie im Feld Aufzuzeichnende Ereignisse der Experimentgruppe 10.000.000 und im selben Feld für die Referenzgruppenzeile 200.000 ein. Klicken Sie auf Speichern und öffnen. Die anderen Einstellungen sollten als Standard beibehalten werden, Stoppzeit auf 10.000 und Stopp-Lautstärke auf 3.000.
    7. Klicken Sie unten links auf Instrumentensteuerung. Stellen Sie die Spannung auf FSC-50, SSC-175, SSC-B-175 ein. Wählen Sie dann das Erfassungssteuerelement aus. Wählen Sie für die Option Durchflussrate im Dropdown-Menü die Option Hoch aus.
  2. Erfassen Sie Referenzproben mit einem Zytometer und entmischen Sie sie in der Software.
    1. Ziehen Sie das ungefärbte Herzröhrchen vor und legen Sie es sicher auf den Probeninjektionsanschluss (SIP). Stellen Sie sicher, dass der grüne Indikatorpfeil auf die richtige Probe zeigt, klicken Sie dann in der Erfassungssteuerung der Zytometersoftware auf Start und warten Sie, bis die Ereignisse aufgezeichnet sind. Machen Sie dasselbe für das lebend tot gefärbte Herzgewebe.
    2. Wählen Sie das Menü Unmix und legen Sie die folgenden Steuerelemente fest:
      1. Aktivieren Sie die Kontrollkästchen für PE, PerCP-Cy5.5, BV421 und Alexa Fluor 700 in der Spalte aus der Bibliothek. Stellen Sie sicher, dass Zombie Aqua in derselben Spalte deaktiviert ist. Aktivieren Sie unten die Option Autofluoreszenz als Fluoreszenz-Tag.
      2. Klicken Sie auf Weiter , um mit der Registerkarte Positive/Negative Populationen identifizieren fortzufahren. Auf dieser Registerkarte wird ein Diagramm von FSC-A vs. SSC-B-A angezeigt. Klicken Sie auf die Punkte des Polygons und ziehen Sie sie, um einen Bereich zwischen 1,0 m und 4,0 m auf der FSC-A-Achse und zwischen 0,2 m und 3,0 m auf der SSC-B-A-Achse auszuwählen.
      3. Im nächsten Diagramm rechts wird V5-A auf der X-Achse angezeigt. Verschieben Sie die Tore, um die Hälfte des Gipfels ganz rechts als positiv und einen Bereich auf der linken Seite des Diagramms als negativ auszuwählen. Wählen Sie im Diagramm mit dem Titel Referenzgruppe - Ungefärbt eine Grundgesamtheit in einem ähnlichen Bereich aus. Dazu muss das Ungefärbte kein Positiv-Negativ eingestellt werden.
  3. Erwerben Sie experimentelle Proben.
    1. Wirbeln Sie das Röhrchen für jedes Röhrchen, das eine Probe für eine einzelne Maus enthält, und legen Sie es sicher auf das SIP. Stellen Sie sicher, dass der grüne Indikatorpfeil auf die richtige Probe zeigt, klicken Sie dann in der Erfassungssteuerung der Zytometersoftware auf Start und warten Sie, bis die Ereignisse aufgezeichnet wurden.
  4. Gating-Strategie.
    1. Wählen Sie die Registerkarte Ungemischtes Standardarbeitsblatt aus. Erstellen Sie ein FSC-A- und SSC-A-Diagramm mit dem Punktdiagramm-Werkzeug oben. Wählen Sie Ereignisse mit mehr als 0,4 M auf der FSC-A-Achse und höher als 0,8 M auf der SSC-A-Achse mit dem Polygon-Auswahlwerkzeug aus. Doppelklicken Sie in diese Auswahl und ein neues Diagramm wird angezeigt.
    2. Klicken Sie im neu erstellten Diagramm mit der rechten Maustaste auf die X-Achsenbeschriftung und wählen Sie AF-A aus. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Beschriftung Y-Achse und wählen Sie Lebend-toter Fleck aus. Klicken Sie oben auf das Rechteckauswahlwerkzeug und wählen Sie alle Ereignisse unter 105 auf der Live-Dead-Achse aus, die dem unteren Live-Dead-Signal entsprechen. Doppelklicken Sie in diese Auswahl und ein neuer Plot wird angezeigt.
    3. Klicken Sie im neuen Diagramm mit der rechten Maustaste, um PerCP-Cy5.5-A für die X-Achse und SSC-A für die Y-Achse auszuwählen. Wählen Sie mit dem Auswahlwerkzeug Rechteck die Ereignisse aus, die auf der PerCP-Cy5.5-A-Achse höher als 104 sind und den positiven CD45-Zellen entsprechen. Doppelklicken Sie auf die Auswahl und ein neues Diagramm wird angezeigt.
    4. Klicken Sie im neuen Diagramm mit der rechten Maustaste, um FSC-A für die X-Achse und FSC-H für die Y-Achse auszuwählen. Wählen Sie mit dem Polygon-Auswahlwerkzeug die Ereignisse aus, die einem Trend folgen, bei dem der FSC-A-Wert und der SSC-A-Wert identisch sind. Damit werden die Zelldubletten entfernt und die Population in der Selektion wird als CD45+-Population bezeichnet. Doppelklicken Sie auf die Auswahl, um ein neues Diagramm mit der CD45+ Bevölkerung anzuzeigen.
    5. Klicken Sie im CD45+-Besetzungsdiagramm mit der rechten Maustaste, um BV421 auf der X-Achse und SSC-A auf der Y-Achse auszuwählen. Wählen Sie mit dem Polygon-Auswahlwerkzeug die Grundgesamtheit rechts auf der BV421-Achse aus. Dies ist die B-Zell-Population. Doppelklicken Sie zweimal auf diese Population, um zwei neue Diagramme mit der B-Zell-Population zu erstellen.
      1. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, um das erste B-Zell-Diagramm mit PE-A auf der X-Achse und BV421-A auf der Y-Achse einzurichten. Die Population auf der rechten Seite entspricht den intravaskulären B-Zellen und die Population auf der linken Seite repräsentiert die interstitiellen B-Zellen. Verwenden Sie das Polygon-Auswahlwerkzeug, um eine Auswahl von beiden zu treffen.
      2. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, um das zweite B-Zell-Diagramm mit Alexa Fluor 700-A auf der X-Achse und SSC-A auf der Y-Achse einzurichten. Die Population auf der linken Seite entspricht den CD11b-Zellen, und die Ereignisse auf der rechten Seite (falls vorhanden) entsprechen den CD11b+-Zellen.
      3. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf jede Auswahl, und klicken Sie dann auf Gate-Eigenschaften. Klicken Sie auf Count und % Parent , um die Größen und Prozentsätze anzuzeigen. Notieren Sie die Anzahl der Ereignisse und Prozentsätze für die weitere Datenanalyse.

Ergebnisse

Sobald die Erfassung abgeschlossen ist und alle Ereignisse erfasst sind, sollten die Daten gemäß der Standard-Durchflusszytometrie analysiert werden. Der Fokus der Analyse variiert je nach individuellem Ziel des jeweiligen Experiments. In diesem Fall wurde die Quantifizierung von intravaskulären und extravaskulären B-Zellen durchgeführt, die als Anzahl der Zellen pro mg Gewebe ausgedrückt wurde.

Bei der Verwendung eines Spektralzytometers wird empfohlen, die Analyse mit einem ersten Gati...

Diskussion

Eine wachsende Zahl von Beweisen deutet darauf hin, dass B-Zellen eine wichtige Rolle im Zusammenhang mit der Myokardphysiologie und dem myokardialen Umbau/der Anpassung an Verletzungen spielen 7,8,9,10,11,12,13,36. Die Durchflusszytometrie ist ein hervorra...

Offenlegungen

Luigi Adamo ist Mitbegründer von i-Cordis, LLC, einem Unternehmen, das sich auf die Entwicklung von immunmodulatorischen Molekülen zur Behandlung von Herzinsuffizienz konzentriert, mit besonderem Interesse an Derivaten des B-Zell-modulierenden Medikaments Pirfenidon. Die übrigen Autoren haben keine Konflikte zu erklären.

Danksagungen

Diese Studie wurde durch die NHLBI-Zuschüsse 5K08HLO145108-03 und 1R01HL160716-01 finanziert, die an Luigi Adamo vergeben wurden.

Das Aurora-Durchflusszytometer, das zur Entwicklung dieser Studie verwendet wurde, wurde vom NIH Grant S10OD026859 finanziert. Wir danken für die Unterstützung des JHU Ross Flow Cytometry Core.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b Antibody101222BioLegend100 µg 200 µL
(CellTreat 29481) Cell Strainer, 40 µm, BlueQBIAP303Southern Labware
0.5 mL Natural Microcentrifuge Tube1605-0000SealRite, USA Scientific
0.9% Sodium Chloride Injection, USP114-055-101Quality Biological0.90%
1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube1615-5500SealRite, USA Scientific
10 µL Graduated TipOne Filter Tips11213810USA Scientific
1000 µL Graduated TipOne Filter Tips11267810USA Scientific
15 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free430052Corning
1-Way Stop Valve, PolycarbonateSVPT951ECT Manufacturing
2,2,2-TribromoethanolT48402Sigma-Aldrich
200 µL Graduated TipOne Filter Tips11208810USA Scientific
3-Way Stop Valve, PolycarbonateSVPT953ECT Manufacturing
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube, 12 x 75 mm style352054Falcon, a Corning Brand
50 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free430290Corning
ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer118-156-101Quality BiologicalOsmolality: 290 + or -5% mOsm/Kg H20
Adapter 4x50ml, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-635810759005Eppendorf
Adapter for 15 mL Centrifuge Tubes, 9 Tubes per Adapter, Conical Bottom for use with Rotor Model A-4-6222638289Eppendorf
Adapter for 15 round-bottom tubes 2.6 – 7 mL, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-6222638246Eppendorf
Aluminum Foil 12 in x 75' Roll .0007UPC 109153Reynolds Wrap
Anesthesia Induction Chamber - MouseRWD-AICMV-100Conduct Science
BD Luer Slip Tip Syringe with attached needle 25 G x 5/8 in., sterile, single use, 1 mL309626BD Becton, Dickinson and Company
Brandzig Ultra-Fine Insulin Syringes 29G 1cc 1/2" 100-PackCMD 2613Brandzig
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD19 Antibody115537BioLegend50 µg/mL
CAPS for Flow Tubes w/strainer mesh 35 µm, Dual position for 12 x 75 mm tubes, sterileT9009Southern Labware
Carbon Dioxide USP E CGA 940 CD USPEAirGas USA
Cole-Parmer Essentials Low-Form Beaker, Glass, 500 mLUX-34502-46Cole-Parmer
Collagenase 2LS004176Sigma-Aldrich
Connector brass chrome plated 1/4" female NPT x 1/4" barbY992611-AGAirGas USA
Cytek Aurora Flow CytometerCytek Biosciences
Diss 1080 Nipple 1/4 BARB CPM-08-12AirGas USA
DNase I - 40,000 UD4527Sigma-Aldrich
Easypet 3 - Electronic Pipette Controller4430000018Eppendorf
Electronic Balance, AX223/E30100606Ohaus Corp.
Eppendorf 5810R centrifuge5810REppendorf
Eppendorf Research plus 1-channel variable pipettesEppendorf
FlowJo 10.8.1BD Becton, Dickinson and Company
GLACIERbrand, triple density Ice Pan (IPAN-3100)Z740287Heathrow Scientific
HBSS (1x) - Ca2+ [+] Mg2+ [+]14025076gibco1x
HyaluronidaseH3506Sigma-Aldrich
Kelly Hemostats, Straight13018-14Fine Science Tools
Luer Slip Syringe sterile, single use, 20 mL302831BD Becton, Dickinson and Company
M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940M1-940-PGAirGas USA
McKesson Underpads, Moderate4033-CS150McKesson
Navigator Multi-Purpose Portable BalanceNV2201Ohaus Corp.
PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-]10010023gibco1x
PE anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody103208BioLegend200 µg/mL
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 Antibody103132BioLegend100 µg 500 uL
Petri dish, Stackable 35 mm x 10 mm Sterile PolystyreneFB0875711YZFisher Scientific
Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02M08-1AirGas USA
Powerful 6 Watt LED Dual Goose-Neck IlluminatorLED-6WAmScope
PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 (0.5 mm x 16 mm)305122BD Becton, Dickinson and Company
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 (RUO)553141BD Becton, Dickinson and Company Biosciences0.5 mg/mL
R 4.1.1The R Foundation
Razor Blades9501250000Accutec Blades Inc
Regulator analytical two stage 0-25 psi delivery CGA320 3500 psi inletY12244A320-AGAirGas USA
Rotor A-4-62, incl. 4 x 250 mL rectangular bucketsRotor A-4-62Eppendorf
Serological pipette, plugged, 10 mL, sterile, non-pyrogenic/endotoxin-free, non-cytotoxic, 1 piece(s)/blister86.1254.001Sarstedt AG & Co KG
Sigma label tapeL8394Sigma-Aldrich
SpectroFlo 3.0.0Cytek Biosciences
Spex VapLock Luer Fitting, PP, Straight, Male Luer Lock x 1/8" Hose Barb; 1/EAMTLL230-6005Spex
Std Wall Lab Tubing, Size S2, Excelon, 1/8" ID x 3/16" OD x 1/32" Wall x 50' LongCG-730-003Excelon Laboratory
Syringe PP/PE without needle, 3 mLZ683566Millipore Sigma
Syringe pump55-1199 (95-240)Harvard Apparatus
Thomas 3-Channel Alarm Timer TM105009371W13Thomas Scientific
Tube Rack, 12 positions, 6 for 5.0 mL and 15 mL tubes and 6 for 25 mL and 50 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable30119835Eppendorf
Tube Rack, 12 positions, for 5.0 mL and 15 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable30119827Eppendorf
TYGON R-3603 Laboratory Tubing, I.D. × O.D. 1/4 in. × 3/8 in.T8913 (Millipore Sigma)Tygon, Saint-Gobain
Vortex-Genie 2SI-0236Scientific Industries, Inc.
VWR Dissecting Forceps with Guide Pin with Curved Tips89259-946Avantor, by VWR
VWR Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4½"82027-578Avantor, by VWR
VWR Incubating Orbital Shaker, Model 3500I12620-946Avantor, by VWR
Zombie Aqua Fixable Viability Kit423102BioLegend

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