Optimierung der durchflusszytometrischen Sortierparameter für die Hochdurchsatzisolierung und Aufreinigung kleiner extrazellulärer Vesikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet eine schnelle und größenspezifische Isolationsmethode für kleine extrazelluläre Vesikel, indem die Größe der Luftsprühdüse, der Mantelflüssigkeitsdruck, der Probenflussdruck, die Spannung, die Verstärkung und die Auslöseschwellenparameter optimiert werden.

Zusammenfassung

Kleine extrazelluläre Vesikel (sEV) können aus allen Zelltypen freigesetzt werden und Proteine, DNA und RNA tragen. Signalmoleküle dienen als Indikatoren für den physiologischen und pathologischen Zustand einer Zelle. Es gibt jedoch keine Standardmethode für die sEV-Isolierung, die nachgeschaltete Biomarker-Identifizierungs- und Arzneimittelinterventionsstudien verhindert. In diesem Artikel stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Isolierung und Reinigung von 50-200 nm sEV durch einen Durchflusszellensortierer zur Verfügung. Zu diesem Zweck wurden eine 50-μm-Düse und ein Mantelflüssigkeitsdruck von 80 psi gewählt, um eine gute Sortierrate und einen stabilen Seitenstrom zu erzielen. Polystyrol-Mikrokugeln in Standardgröße wurden verwendet, um Populationen von 100-, 200- und 300-nm-Partikeln zu lokalisieren. Durch eine zusätzliche Optimierung der Auslöseschwelle für Spannung, Verstärkung und Vorwärtsstreuung (FSC) konnte das sEV-Signal vom Hintergrundrauschen getrennt werden. Diese Optimierungen bieten einen Bereich kritischer Sortiereinstellungen, der es ermöglicht, eine repräsentative Population von sEV nur mit FSC vs. Side Scatter (SSC) zu erhalten. Die auf Durchflusszytometrie basierende Isolationsmethode ermöglicht nicht nur eine Hochdurchsatzanalyse, sondern auch eine synchrone Klassifizierung oder Proteomanalyse von sEV basierend auf der Biomarkerexpression, was zahlreiche nachgelagerte Forschungsanwendungen eröffnet.

Einleitung

Eine Zelle setzt extrazelluläre Vesikel (EVs) unterschiedlicher Größe frei, die zu Signalmolekülen und Membraneinschlüssen führen, die für die interzelluläre Kommunikation wichtig sind¹. EVs unterschiedlicher Größe spielen auch unterschiedliche biologische Rollen, wobei 50-200 nm sEV in der Lage sind, RNA, DNA und Proteine präzise an die richtige extrazelluläre Stelle zu verteilen. Die sEV hilft auch bei der Bestimmung ihrer Sekretionsmechanismen, die nicht nur die Regulierung normaler physiologischer Prozesse wie Immunüberwachung, Stammzellerhaltung, Blutgerinnung und Gewebereparatur umfassen, sondern auch die Pathologie, die verschiedenen Krankheiten wie Tumorprogression und Metastasierung zugrunde liegt ^2,3. Eine effektive Isolierung und Analyse von sEV ist entscheidend für die Identifizierung von Biomarkern und die Entwicklung zukünftiger medikamentöser Interventionen.

Mit kontinuierlicher Forschung zur klinischen Anwendung von sEV haben die Isolationsmethoden von sEV höhere Anforderungen gestellt. Aufgrund der Heterogenität von sEV in Größe, Quelle und Gehalt sowie ihrer Ähnlichkeit mit anderen EVs in Bezug auf physikalisch-chemische und biochemische Eigenschaften gibt es keine Standardmethode für die sEV-Isolierung ^4,5. Derzeit sind Ultrazentrifugation, Größenausschlusschromatographie (SEC), Polymerfällung und Immunaffinitätserfassung die gebräuchlichsten sEV-Isolationsmethoden⁶. Die Ultrazentrifugation ist nach wie vor der Goldstandard für die sEV-Isolierung in der Forschung, obwohl sie zeitaufwändig ist, was zu einer geringen Reinheit mit einer breiten Größenverteilung von 40-500 nm und einer signifikanten mechanischen Schädigung des sEV nach Langzeitzentrifugation führt ^7,8,9. Die Polymerfällung, bei der üblicherweise Polyethylenglykol (PEG) verwendet wird, weist eine inakzeptable Reinheit für die anschließende Funktionsanalyse mit gleichzeitiger Ausfällung extrazellulärer Proteinaggregate und Polymerkontamination^{auf 10,11}. Immunaffinitäts-Capture-basierte Methoden erfordern teure Antikörper mit unterschiedlicher Spezifität sowie Probleme mit geringem Verarbeitungsvolumen und Ausbeuten^12,13,14. Die Partikelgröße ist einer der Hauptindikatoren zur Bewertung der Reinheit von isoliertem sEV. Obwohl die Reinheit von sEV nach wie vor ein unerreichbares Ziel ist, entfernt SEC eine beträchtliche Menge an Medienkomponenten, und die mit der SEC-Methode extrahierten sEV-Partikel liegen hauptsächlich im Bereich von 50-200 nm¹⁵. Die bestehenden Techniken weisen einige Nachteile auf, darunter Zeitaufwand, geringe Reinheit, geringe Ausbeute, schlechte Reproduzierbarkeit, geringer Probendurchsatz und potenzielle Schädigung von sEV, was sie mit der klinischen Anwendung unvereinbar macht¹⁶. Daher ist eine schnelle, kostengünstige und größenspezifische sEV-Isolationsmethode, die auf verschiedene Biofluide anwendbar ist, ein wesentlicher Bedarf in verschiedenen Forschungs- und klinischen Situationen.

In der Durchflusszytometrie werden einzelne Partikel multiparametrisch mit hohem Durchsatz analysiert und Teilmengen aussortiert¹⁷. Aufgrund der Heterogenität von EVs wäre eine durchflusszytometrische Einzelpartikelmessung ideal, die zur Untersuchung von EVs nach den Paradigmen der Zellanalyse verwendet wurde, wobei Lichtstreu- und Fluoreszenzmarkierungen verwendet wurden, um physiologische Merkmale und Proteinkomponenten zu identifizieren^18,19,20. Nichtsdestotrotz wird die konventionelle Durchflusszytometrie durch die geringe Größe von sEV und die geringe Häufigkeit von Oberflächenbiomarkern herausgefordert. Die Sensitivität der Durchflusszytometrie könnte verbessert werden, indem die Detektionsparameter optimiert werden, um Hintergrundrauschen und sEV zu unterscheiden, unabhängig davon, ob Vorwärtsstreuung (FSC), Seitenstreuung (SSC) oder Fluoreszenzschwellen-Auslöseparameter¹⁹ verwendet werden.

Mit dem vorliegenden Protokoll wurden hochauflösende durchflusszytometrische Sortiereinstellungen unter Verwendung von fluoreszierenden Kügelchen als Standard optimiert. Durch die Auswahl der richtigen Düsengröße, des Mantelflüssigkeitsdrucks, des Schwellenwert-Auslöseparameters und der Spannungen, die die Streulichtintensität steuern, konnten wir eine bestimmte Teilmenge von sEV aus einem komplexen Gemisch isolieren.

Protokoll

1. Zellkultur

1. Bereiten Sie ein Nährmedium aus Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) vor, das mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt wird. Die menschliche Bauchspeicheldrüsenkrebszelle PANC-1 wird in einem 75^cm2 Kulturkolben mit einer Dichte von 1 x 10⁶ Zellen/ml kultiviert. Inkubation der Kultur bei 37 °C mit 5% CO₂.
2. Subkultur der Zellen, wenn die Zelldichte unter mikroskopischer Beobachtung 75%-80% erreicht. Entfernen Sie das Medium und spülen Sie es 2x mit 3-5 ml Phosphatpufferkochsalzlösung (PBS; 0,01 M, pH 7,2-7,4) ab.
3. Verwerfen Sie die Lösung, fügen Sie 1-2 ml Trypsin-EDTA-Lösung hinzu und lassen Sie die Zellen ablösen, bis sie rund und im Medium unter dem Mikroskop suspendiert sind. Fügen Sie frisches Medium hinzu, saugen Sie es ab und verteilen Sie es in 75 cm 2-Kulturflaschen mit 15 ml Nährmedium. Verwenden Sie ein Teilkultivierungsverhältnis von 1:2 bis 1:4 (empfohlen).
   HINWEIS: Alle Vorgänge werden in einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt, um eine Kontamination der Zellen zu vermeiden.

2. Sammlung von Kulturmedien

1. Inkubation der Zellen für 48 h bei 37 °C mit 5% CO₂. Der Zellüberstand (90 ml) wird in zwei 50-ml-Zentrifugenröhrchen aufgefangen und bei 300 x g 10 min bei 4 °C zentrifugiert.
2. Der Überstand wird in neue sterile Röhrchen überführt und nacheinander bei 2.000 x g für 20 min, 10 000 x g für 30 min und 12.000 x g für 70 min bei 4 °C zentrifugiert.
3. Entfernen Sie den Überstand und spülen Sie das Pellet mit 10 ml PBS durch vorsichtiges Pipettieren aus. Zentrifugieren Sie bei 12.000 x g für 70 min bei 4 °C erneut und resuspendieren Sie das Pellet in 10 ml PBS-Puffer, um eine Mischung aus EVs zu erhalten.
4. Führen Sie eine Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) durch, um das EV-Gemisch zu quantifizieren und zu dimensionieren. Führen Sie die NTA-Analyse gemäß dem Referenzhandbuch für den Gerätebetrieb und der Referenz²¹ durch.

3. Sortierung der Zellen

1. Führen Sie den Standard-Startvorgang des Durchflusszellensortierers durch. Schalten Sie das Gerät ein, indem Sie die Starttaste drücken. Klicken Sie auf die Schaltfläche Laserleistung auf dem Bedienfeld des Lasers . Drücken Sie die Taste "Tanks wechseln " im Untermenü des intelligenten Probenehmers, um die Fluidik unter Druck zu setzen.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Fäkalientank leer und der Manteltank voll ist, bevor Sie ihn in Betrieb nehmen.
2. Verwenden Sie eine ultraschallgereinigte 50-μm-Jet-in-Air-Düse und installieren Sie sie auf der Düsenbaugruppe. Stellen Sie den Druck auf 80 psi für die Mantelflüssigkeit und 80,3 psi für den Probenfluss an der Druckkonsole ein.
3. Drücken Sie die Taste Start Sheath Flow , um den Mantelstrom zu starten. Klicken Sie im Untermenü des Smart Samplers auf die Schaltfläche "Bubble ", um die Blase automatisch für 10 Minuten zu entleeren und dann auszuschalten.
   HINWEIS: Für die Zellsortierung erfordern unterschiedliche Größen von Luftsprühdüsen unterschiedliche Mantelflüssigkeitsdrücke, um die Stabilität des Flüssigkeitsflusses aufrechtzuerhalten. Bei diesem Verfahren wurde eine Düse von 50 μm verwendet, und nur ein Mantelflüssigkeitsdruck größer oder gleich 80 psi konnte stabile Seitenströme erzeugen. Die Druckdifferenz zwischen dem Probenstrom und der Mantelflüssigkeit bestimmt die Ladegeschwindigkeit der Sortierung. Unter den Einstellbedingungen des Verfahrens (die Druckdifferenz zwischen dem Probenstrom und der Mantelflüssigkeit beträgt 0,3 bis 0,6 psi) war der Flüssigkeitsfluss relativ stabil, und die Ladegeschwindigkeit ermöglichte es, die Sortiereffizienz von 50 % auf 80 % für eine Druckdifferenz von weniger als 0,3 bis 0,6 psi zu erhöhen.
4. Richten Sie den Strom aus und bestimmen Sie den Laserpunkt. Schalten Sie das Licht der Beleuchtungskammer ein, um den Strom über die Nadellöcher zu sehen. Passen Sie die Mikrometer nach oben und unten, links und rechts sowie vorne und hinten an, um den Stream auf der Lochblende zu zentrieren und den Stream zu fokussieren.
5. Wählen Sie die Registerkarte Laser- und Stream-Abfangen aus. Drücken Sie die grüne Pfeiltaste kontinuierlich, wenn Sie dazu aufgefordert werden, um den Kalibrierungsprozess für den Laserabschnitt und die Düsenausrichtung abzuschließen.
6. Greifen Sie auf den Bildschirm für die Feinlaserausrichtung zu. Wählen Sie den Kanal 640-722/44 (H) als Parameter für die X-Achse und den Kanal 405-448/59 (H) als Parameter für die Y-Achse. Drücken Sie den Triggerparameter-Selektor und wählen Sie den SSC-Parameter des 488-nm-Lasers. Öffnen Sie alle Laser-Shutter.
   HINWEIS: Die gewählten Parameter für die X- und Y-Achse hängen von der Laserkonfiguration des Systems ab. Andere Parameter sind zulässig, wenn das System nicht über einen 640-nm- oder 405-nm-Laser verfügt. Die besten Ergebnisse erzielen Sie, wenn Sie Laser mit dem größten räumlichen Abstand auf dem Lochstreifen auswählen (ohne den 355-nm-Laser).
7. Verdünnen Sie die regenbogenfluoreszierenden Partikel, indem Sie einen Tropfen in 1 ml doppelt destilliertes Wasser geben, um eine Endkonzentration von 1 x 10^{6 Kügelchen} pro ml zu erreichen. Öffnen Sie die Tür der Probenkammer und laden Sie ein Röhrchen mit den vorbereiteten fluoreszierenden Regenbogenpartikeln.
8. Drücken Sie die Taste Start Sample . Passen Sie die Auf- und Ab-Mikrometer an, um die Fluoreszenzintensität zu optimieren und jedes Signal so intensiv wie möglich zu gestalten. Drücken Sie die Taste Start Quality Control (QC) auf dem Touchscreen-Bedienfeld, um die Qualitätskontrolle automatisch durchzuführen.
9. Führen Sie eine Drop-Verzögerung durch. Rufen Sie den Sortier-Setup-Bildschirm auf und wählen Sie die Schaltfläche für die Drop-Verzögerung. Klicken Sie auf die Schaltfläche IntelliSort-Initialisierung . Das Instrument passt automatisch die Frequenz und Amplitude der Tröpfchenschwingung an, um die Tropfenverzögerung von 25 ± 5 zu erhalten und den Abbruchpunkt des Tropfens klar visualisieren zu können. Drücken Sie die Schaltfläche Pflegen .
10. Wählen Sie Tube als Sortierausgabetyp aus. Legen Sie einen 15-ml-Röhrchenhalter in die Sortierkammer. Schalten Sie die Plattenspannung ein und stellen Sie die Plattenspannung auf ca. 4000 V ein.
11. Aktivieren Sie das Testmuster, indem Sie auf die Schaltfläche Stream-Setup klicken. Stellen Sie den Schieberegler für die Ladephase und den Schieberegler für die Ablenkung ein, um sicherzustellen, dass das Bild des Stroms mit dem Sammelrohr ausgerichtet ist. Wählen Sie die Schaltfläche Häkchen aus.
12. Melden Sie sich bei der Summit-Workstation auf dem Computer an. Erstellen Sie ein neues Protokoll über das Hauptmenü Datei. Erstellen Sie ein Punktdiagramm, indem Sie in der Systemsteuerung der Summit-Software die Registerkarte Histogramm auswählen.
13. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Achsen des neuen Punktdiagramms im Arbeitsbereich, und wählen Sie FSC als Parameter für die X-Achse und SSC als Parameter für die Y-Achse aus. Stellen Sie FSC und SSC in logarithmischer Form dar.
14. Wählen Sie die Registerkarte "Erfassung" und suchen Sie den Bereich " Erfassungsparameter". Aktivieren Sie alle Signale im Untermenü der Parameter aktivieren. Wählen Sie FSC als Triggerparameter und legen Sie den Schwellenwert auf 0,01 fest. Stellen Sie die Spannung und Verstärkung von FSC und SSC auf 250 und 0,6 ein, um sicherzustellen, dass Ereignisse innerhalb des FSC- und SSC-Diagramms und der Populationen getrennt sind.
    HINWEIS: Die Einstellung des Schwellenwerts entspricht der Einstellung der Partikelgröße, die durch Durchflusszytometrie nachgewiesen werden kann. Je größer der Schwellenwert ist, desto größer sind die detektierten Partikel, und die kleinen Partikel werden durch den Schwellenwert abgeschnitten und können nicht erkannt werden. Bei dieser Methode wird der Schwellenwert auf 0,01 festgelegt, sodass alle Partikel, die größer als elektronisches Rauschen sind, erkannt werden können.

4. Isolierung von sEV

1. Die fluoreszierenden Polystyrol-Mikrokugeln werden auf Suspensionen von 100 nm, 200 nm und 300 nm verdünnt. 1 μl Mikrokugeln zu 1 ml doppelt destilliertem Wasser geben.
2. Laden Sie die Mikrokugelaufhängung nacheinander. Wählen Sie im Erfassungsmenü der Summit-Software die Option Start aus, um 20.000 Ereignisse aufzuzeichnen.
   HINWEIS: Die Anzahl der Ereignisse ist optional. Es werden nicht weniger als 5.000 Ereignisse empfohlen, um die statistische Signifikanz zu erreichen.
3. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das FSC- vs. SSC-Punktdiagramm, um Rechtecke zu erstellen, und ziehen Sie, um die Größe und Positionierung der Bereiche des elektronischen Rauschens und der 100-nm-Mikrosphärenpopulation zu ändern. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Regionen, um sie in R7 bzw. R4 umzubenennen. Wiederholen Sie die obigen Schritte, um die 200-nm- und 300-nm-Mikrokugeln nacheinander mit Rechtecken einzurahmen und sie in R5 bzw. R6 umzubenennen.
4. Bestimmen Sie schließlich den Sortierbereich von 50 bis 200 nm basierend auf dem elektronischen Rauschen und der Position von 200 nm-Partikeln, die als R8 definiert sind.
   HINWEIS: Die untere Nachweisgrenze von 50 nm liegt knapp über dem elektronischen Rauschen des Durchflusszellensortierers. Der Bereich zwischen dem Rauschen und der 200-nm-Mikrosphärenpopulation kann daher als zwischen 50-200 nm definiert werden.
5. Bearbeiten Sie Sortierentscheidungen im Bereich Sortierlogik und Statistik. Doppelklicken Sie auf das leere Feld des linken Streams (L1). Wählen Sie den Bereich mit dem Namen R8 aus, um die Sortierlogik zu erstellen. Wählen Sie den Abbruchmodus der Reinheit und wählen Sie eine Tröpfchenhülle von 1 Tropfen für den L1-Stream.
6. Laden Sie eine 500-μl-Probe des EV-Gemisches aus Schritt 2.3. Drücken Sie die Start-Taste unter dem Erfassungsmenü in Summit, um Daten zu erfassen, und drücken Sie dann Start im Sortiermenü, um 50-200 nm sEV in einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen zu sammeln.
   HINWEIS: Eine sterile Umgebung ist notwendig, um die Kontamination während eines Verfahrens zu minimieren.
7. Beobachten Sie das Vorhandensein von sEV durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und überprüfen Sie die Partikelgröße von sEV mit NTA. Führen Sie eine Western-Blot-Analyse (WB) durch, um die Expression der CD9-, CD63- und CD81-Marker weiter zu bestätigen¹⁸.

Ergebnisse

Das Flussdiagramm für das experimentelle Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt. Bei diesem Verfahren wurden Polystyrol-Mikrokugeln in Standardgröße als Referenzstandards für die Partikelgrößenverteilung verwendet. Unter der spezifischen instrumentellen Parameterbedingung konnte das Partikelsignal mit Hilfe der logarithmischen Form klar vom Hintergrundrauschen im FSC- vs. SSC-Diagramm unterschieden werden. Gating-Strategien sind in Abbildung 2 dargestell...

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt eine optimierte Methode zur Isolierung und Aufreinigung von sEV mit der spezifizierten Partikelgröße von 50-200 nm unter Verwendung eines Durchflusszellensortierers, der von NTA validiert wurde. Die Methode löste das Engpassproblem, sEV mit einheitlicher Partikelgröße und hoher Reinheit zu erhalten, und verhinderte Interferenzen durch nicht verwandte biologische Moleküle, die in großformatige EVs^{eingewickelt sind 22}. Schnelle Hochdurchsatzanalysen sind mit der Du...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuge tube	Beckman Coulter	344058
Culture flasks	Corning	430641
Dulbecco’s modified eagle medium	Corning Cellgro	10-013-CV
Fetal bovine serum	SUER	SUER050QY
Flow cell sorter	Beckman Coulter	Moflo Astrios EQ
Human pancreatic cancer cell, PANC-1	NA	NA	PANC-1 cells were donated by Professor Weijun Yang, College of Life Sciences, Zhejiang University
Laser particle size and zeta potential analyzer	Malvern	Zetasizer Nano ZS 90
Phosphate buffer saline	Gibco	C20012500BT
Polystyrene fluorescent microspheres	Beckman Coulter	6602336
Transmission electron microscopy	JEOL	JEM-1200EX
Trypsin-EDTA solution	Gibco	1713949
Ultra rainbow fluorescent particles	Beckman Coulter	B28479
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima-L80XP
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	SW32TI