Ein fluoreszierender Intravital-Bildgebungsansatz zur Untersuchung der belastungsinduzierten Kalzium-Signaldynamik in Maus-Osteozyten

Zusammenfassung

Der vorliegende Artikel beschreibt die Durchführung eines intravitalen Bildgebungsansatzes zur Beobachtung der mechanisch induzierten Kalziumsignalisierung von eingebetteten Osteozyten in vivo in Echtzeit als Reaktion auf die mechanische Belastung des dritten Mittelfußknochens auf Gewebeebene.

Zusammenfassung

Knochengewebe reagiert äußerst empfindlich auf Unterschiede in der Größe der mechanischen Belastung. Osteozyten, dendritische Zellen, die im gesamten Knochen ein Synzytium bilden, sind für die mechanosensorische Funktion des Knochengewebes verantwortlich. Studien, die Histologie, mathematische Modellierung, Zellkulturen und ex vivo Knochenorgankulturen einsetzen, haben das Verständnis der Osteozyten-Mechanobiologie erheblich vorangetrieben. Die grundlegende Frage, wie Osteozyten auf molekularer Ebene in vivo auf mechanische Informationen reagieren und diese kodieren, ist jedoch nicht gut verstanden. Intrazelluläre Schwankungen der Kalziumkonzentration in Osteozyten bieten ein nützliches Ziel, um mehr über die akuten Mechanotransduktionsmechanismen des Knochens zu erfahren. In dieser Arbeit berichten wir über eine Methode zur Untersuchung der Osteozyten-Mechanobiologie in vivo, bei der ein Mausstamm mit einem fluoreszierend genetisch kodierten Kalziumindikator, der in Osteozyten exprimiert wird, mit einem in vivo Beladungs- und Bildgebungssystem kombiniert wird, um den Osteozyten-Kalziumspiegel während der Belastung direkt zu bestimmen. Dies wird mit einem Dreipunktbiegegerät erreicht, das den dritten Mittelfußknochen lebender Mäuse genau definiert mechanisch belasten und gleichzeitig die fluoreszierend angezeigten Kalziumreaktionen der Osteozyten mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie überwachen kann. Diese Technik ermöglicht die direkte In-vivo-Beobachtung von Osteozyten-Kalzium-Signalereignissen als Reaktion auf die Belastung des gesamten Knochens und ist nützlich bei dem Bestreben, Mechanismen in der Osteozyten-Mechanobiologie aufzudecken.

Einleitung

Die Knochenmatrix ist entsprechend den mechanischen Anforderungen^{organisiert 1,2} und kann sich dynamisch ändern, um den sich ändernden mechanischen Anforderungen Rechnung zu tragen ^3,4,5. Eine bahnbrechende Arbeit über den mechanosensorischen Mechanismus im Knochen wurde vor etwa 30 Jahren als Modellierungsarbeit veröffentlicht ^6,7,8, in der vorgeschlagen wurde, dass Osteozyten, die in den Knochen eingebettet sind, die mechanische Verformung auf Gewebeebene durch Flüssigkeitsbewegung in ihrer lokalen Umgebung wahrnehmen. Dieses Modell wurde experimentell mit in vitro und ex vivo Experimenten validiert, wobei eindeutig gezeigt werden konnte, dass Osteozyten ziemlich mechanosensitiv sind 1,2,3,4,5,6 und auch Zytokine exprimieren, die das Verhalten der knochenbildenden Osteoblasten 7 und Osteoklasten ^8,9,10 steuern^{, 11,12}.

Der Kalzium-Signalweg ist ein ubiquitärer Botenstoff, der sich in der Osteozyten-Mechanobiologie als zentrale Figur und zuverlässiges experimentelles Ziel etabliert hat 13,14,15,16. Der Kalzium-Signalweg hat den Vorteil, dass er in der Zellbiologie umfassend untersucht ist¹⁷, was bedeutet, dass viel über seine nachgelagerten Effekte und die entsprechenden Fluoreszenzwerkzeuge bekannt ist, die für die experimentelle Beobachtung zur Verfügung stehen. In-vitro-Analysen haben die Kalziumsignalgebung als Mittel zur Identifizierung der mechanischen Aktivierung von Osteozyten und zur Charakterisierung des dynamischen Signalverhaltens verwendet ^5,18,19. Bemerkenswert ist, dass die Beobachtung des Calcium-Signalwegs in einer Osteozytenzelllinie einen endgültigen Beweis dafür lieferte, dass die Flüssigkeitsaktivierung an den Integrin-Attachments entlang des Zellprozesses wahrscheinlich die Hauptform der Aktivierung des Flüssigkeitsflusses ist²⁰. Diese Studie ist eine von vielen, die den Nutzen der Kalzium-Signalübertragung zeigen. Es wird zuverlässig mit der mechanischen Aktivierung von Osteozyten induziert und dient somit als potentes Ziel für die Untersuchung der Osteozyten-Mechanobiologie.

Die Mechanotransduktion von Osteozyten in vivo hängt stark von ihrer unmittelbaren Mikroumgebung ab. Matrixbindende Proteine (z. B. Proteoglykane, Integrine) sorgen für funktionelle Bindungen zwischen Osteozytenzellmembranen in einer Anordnung, die für die Flüssigkeitsaktivierung der Zelle entscheidend ist^21,22. Zweidimensionale (2D) In-vitro-Analysen sind zwar hilfreich, aber insofern eingeschränkt, als sie diese kritischen dreidimensionalen (3D) Merkmale nicht berücksichtigen. Ex-vivo-Präparationen des Osteozyten-Kalzium-Signalwegs mittels konfokaler Mikroskopie haben Aufschluss darüber gegeben, wie Osteozyten reagieren, während die umgebende Matrix intakt bleibt^13,16. Es wird jedoch angenommen, dass die Entfernung der Blutversorgung aus den Knochen die Nährstoffe und die Flüssigkeitsdynamik des lakunokanalikulären Systems verändert. Die Untersuchung der Osteozyten-Mechanobiologie erfordert in vivo die Untersuchung des belastungsinduzierten Osteozyten-Signalwegs.

Die In-vivo-Untersuchung von eingebetteten Zellen im Knochen wurde weitgehend durch die Einschränkungen traditioneller bildgebender Verfahren wie Hellfeld- und Konfokalmikroskopie behindert. Osteozyten sind in einer mineralisierten Matrix²³ positioniert, die aus Hydroxylapatit, Kollagen Typ 1 und anderen nicht-kollagenen Proteinen besteht, die die optische Zugänglichkeit²⁴ einschränken und die In-vivo-Untersuchung technisch anspruchsvoll machen. Jüngste Fortschritte in der nichtlinearen Fluoreszenzbildgebung und genetisch kodierten Kalziumreportern bieten jedoch die Möglichkeit, diese Herausforderungen zu meistern.

Hier berichten wir über einen neuartigen Ansatz mit der Möglichkeit, Osteozyten in vivo abzubilden, um die Kalziumsignalübertragung mit einer Auflösung auf zellulärer Ebene zu messen²⁵. Dies wird erreicht, indem ein dynamisch fluoreszierender Marker unter Verwendung eines genetisch kodierten Kalziumindikators zum ersten Mal in Maus-Osteozyten verwendet wird. Mäuse mit DMP1-Cre-getriebener Osteozyten-gezielter Expression von GCaMP6f zeigen sichtbare Fluoreszenz in Osteozyten im gesamten diaphysären Kortex von Mittelfußknochen von Mäusen ^17,26. Wir verwenden ein Drei-Punkt-Biegesystem, um physiologische Dehnungsgrößen zwischen 250 und 2.000 με²⁷ aufzubringen. Diese Technik ermöglicht die In-vivo-Visualisierung der Dynamik der Osteozyten-Kalzium-Signalgebung während der mechanischen Belastung des gesamten Knochens und könnte für jeden nützlich sein, der die Mechanobiologie der Osteozyten verstehen möchte. Diese Methode eignet sich für Forscher, die ihre Arbeit von In-vitro-Analysen auf In-vivo-Anwendungen ausweiten möchten, insbesondere unter Beibehaltung funktioneller molekularer Analysen (d. h. der Untersuchung der zellulären Aktivität über die Kalziumsignalisierung) im Gegensatz zu breit angelegten Phänotypisierungsstudien.

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Protokoll

Alle Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Cornell University genehmigt.

1. Vorbereitung von Materialien und Geräten

1. Entwerfen und bauen Sie die Mittelfußbelastungsvorrichtung für die Verwendung mit einem Overhead-Multiphotonenmikroskop.
   HINWEIS: Einzelheiten zu den Komponentenspezifikationen und zum Betrieb des Geräts sind in der ergänzenden Dokumentation einer früheren Studie^{beschrieben 25}. Kurz gesagt, bestehen die Hauptkomponenten aus einem in Reihe geschalteten Aktuator mit einer Wägezelle und einer Belastungshalterung, einem Wasserbad und einem Drehzapfen. Der Antrieb und die Wägezelle sind kommerziell erhältlich und sollten in der Lage sein, Lasten von bis zu 300 g aufzunehmen. Das Wasserbad, der Drehzapfen und die Lasthalterung sollten aus Titan oder Edelstahl bestehen. Sie können im eigenen Haus oder kommerziell per 3D-Metalldruck hergestellt werden.
2. Kalibrieren Sie die Dehnungsgrößenwerte im Voraus auf die Aktuatorverschiebung für einzelne Mausgruppen (d. h. Geschlecht, Behandlung, Genotyp). Dies geschieht mittels Oberflächendehnungsmapping in einem Verfahren, das in einer früheren Studie^{beschrieben wurde 25}.
3. Verwenden Sie Mäuse mit C57BL/6-Hintergrund im Alter von 16-18 Wochen, die fluoreszierende Kalziumindikatorkonstrukte in den Osteozyten exprimieren. Die gezielte Expression von Osteozyten wird durch Kreuzung von flox-aktivierten GCaMP6f- und Dmp1-Cre-Mäusen erreicht. Die Details der Zuchtstrategien und -anbieter für Gründermäuse werden in einer zuvor veröffentlichten Studie^{beschrieben 25}.
4. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente, die Lasthalterung, das Wasserbad und den Drehpunkt mit einem Autoklaven (57,2 °C, 15 psi, 3-4 min). Desinfizieren Sie Mikroskopobjektive mit 100% Ethanol.
5. Schalten Sie elektronische Komponenten ein, einschließlich Laserquelle, Mikroskop, Wägezelle und Aktuator. Lassen Sie 15-20 Minuten zu, bis sich jede Komponente erwärmt hat, bevor Sie mit der intravitalen Bildgebung beginnen.
   1. Stellen Sie sicher, dass die Komponenten des Aktuators und der Wägezelle im Steuergerät angeschlossen und aktiviert sind. Generieren Sie die Steuerungssoftware mit einer Vielzahl von Plattformen, einschließlich Matlab, LabView und Python, entsprechend den Präferenzen des Benutzers. Der Haupt-Matlab-Code, der in dieser Studie verwendet wird, heißt Actuator_Control_Software_withLoadCell.m (im Ordner Supplementary File 1 der MT3 Loading Device Control Software.zip).
      HINWEIS: Die meisten kommerziell erhältlichen Zwei-Photonen-Mikroskopsysteme werden mit einer robusten Bildgebungssoftware geliefert. Die wichtigsten Merkmale, die für diese Methode erforderlich sind, sind die Fähigkeit, einen Laser auf die geeignete Anregung für GCaMP6f (920 nm) abzustimmen, die Möglichkeit, die Intensität der Laserleistung einzustellen, und eine Zeitreihensammlung mit einer Frequenz von mindestens 6 Hz. Vor dem Experimentieren sollte die Laserverbindung zur Bildgebungssoftware und die geeignete Lichtweganordnung für die Zwei-Photonen-Bildgebung bestätigt werden. Dies wird je nach Imaging-Setup auf unterschiedliche Weise bestätigt. In der Regel gibt es eine Leuchtanzeige.

2. Chirurgie

1. Bereiten Sie ein Operationsstadium vor und sterilisieren Sie die Oberfläche mit 70% Ethanol. Stellen Sie sicher, dass bei allen chirurgischen Eingriffen aseptische Techniken angewendet werden. Halten Sie das für dieses Protokoll erforderliche Maß an Sauberkeit ein, da es sich um ein terminales Verfahren handelt.
2. Betäuben Sie die Maus mit verdampftem Isofluran, gemischt mit medizinischer Luft oder Sauerstoff bei einer Durchflussrate von 1 l/min. Führen Sie die Erstanästhesie in einer Nagetier-Induktionskammer mit 3%-5% Isofluran durch. Halten Sie die Anästhesie bei 1 % bis 2,5 % Isofluran in einem Nasenkonus für chirurgische und intravitale Bildgebungsverfahren.
3. Platzieren Sie ein Heizgerät unter oder neben der Maus, um die homöostatische Körperkerntemperatur aufrechtzuerhalten. Überwachen Sie die Körpertemperatur, die Herzfrequenz und die Sauerstoffsättigung der Maus während der gesamten Operation. Halten Sie die Atemfrequenz zwischen 60-80 Atemzügen pro Minute und halten Sie sie aufrecht, indem Sie die Isofluran-Dosierung anpassen.
4. Platzieren Sie die Maus in Rückenlage. Bestätigen Sie die Narkosetiefe vor dem Schnitt durch ein Zehenkneifen. Identifizieren Sie die Position zwischen dem zweiten und dritten Mittelfußknochen. Machen Sie einen Skalpellschnitt durch die Dermis zwischen dem zweiten und dritten Mittelfußknochen, beginnend am distalen Ende und proximal entlang der Länge der Knochen (~5 mm).
   HINWEIS: Die Mittelfußknochen sind distal zu den Knöchelknochen an der Pfote und folgen direkt proximal zu den distalen Phalangen. Sie bestehen aus den (medialen bis lateralen) Mittelfußknochen I, II, III, IV und V. Der dritte Mittelfußknochen befindet sich in der Mitte des volaren Aspekts der Hinterpfote.
5. Öffnen Sie das Operationsfeld mit einer Pinzette, indem Sie die Haut zu den medialen/lateralen Rändern ziehen. Sezieren Sie die Strecksehnen mit einer geraden Vannas-Schere, um den dritten Mittelfußknochen freizulegen.
6. Setzen Sie den mittleren Drehpunktstift der Mittelfußbelastung unter den dritten Mittelfußknochen ein.
   1. Führen Sie den Stift zunächst in den kleinen Raum am distalen Ende ein, wo der dritte Mittelfußknochen auf den proximalen Fingerknochen trifft, und bewegen Sie den Stift dann proximal, bis er in der Mitte des Schaftes des dritten Mittelfußknochens aufliegt.
   2. Achten Sie besonders darauf, eine direkte Schnittstelle zwischen Knochen und Stift zu gewährleisten, ohne Muskeln und Gesichtsbehandlungen. Dies ist entscheidend für eine stabile Bildgebung während der Ladeprotokolle.
7. Halten Sie den Knöchel mit einer Pinzette fest und legen Sie den Fuß in das mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) gefüllte Wasserbad (8-10 ml) von Dulbecco. Befestigen Sie die Pfote mit der Ladehalterung und verbinden Sie die Halterung mit der Aktuator-/Wägezellenanordnung. Eine abgeschlossene chirurgische Vorbereitung und Anordnung innerhalb des Geräts ist in Abbildung 1 dargestellt.

3. Bildgebung

HINWEIS: Das vollständige Zwei-Photonen-Mikroskopie-Setup, das in diesem Protokoll verwendet wird, besteht aus zwei Softwarepaketen: Chameleon Discovery GUI V2.0.6 für den Laser (Abbildung 2) und ThorImageLS4.0 für das Mikroskop (Abbildung 3). Um ein Bild auf dem Zwei-Photon zu erzeugen, drücken Sie Live (Abbildung 3, blaue Wiedergabetaste). Wenn Sie ein Experiment durchführen, um ein Image zu erstellen und Daten zu speichern, drücken Sie auf Capture (Abbildung 3, die Registerkarte oben neben Capture Setup). Diese sind spezifisch für die Ausrüstung und die Anbieter, die in diesem Experiment verwendet werden, aber viele Alternativen mit den notwendigen Spezifikationen, die in diesem Protokoll zu finden sind (Anregungswellenlängen, sichtbare Fenstergröße, Bilderfassungsrate usw.), würden ebenfalls funktionieren.

1. Nehmen Sie die Einrichtung des Ladegeräts sehr vorsichtig mit der Maus auf und platzieren Sie sie auf der Mikroskopplattform.
2. Beginnen Sie mit einem Objektiv mit geringer Vergrößerung im Epifluoreszenzmodus (Abbildung 3, Dropdown-Menü oben mit der Auswahl Multiphoton oder Fluoreszenz-Setup), um die mittlere Diaphyse des Knochens zu lokalisieren und zu zentrieren.
3. Nachdem Sie einen interessierenden Bereich lokalisiert haben, wechseln Sie zu einer höheren Wasserimmersionsobjektivvergrößerung (20x-40x) und schalten Sie die Optik auf Zwei-Photonen-Optik um (Abbildung 3, Dropdown-Menü oben mit der Auswahl Multiphoton oder Fluoreszenz-Setup).
   HINWEIS: Die empfohlene Sichtfeldgröße beträgt mindestens 250 μm x 250 μm für die zelluläre Aktivität und kann je nach Bildgebungssystem entweder mit optischem oder digitalem Zoom erreicht werden.
   1. Die geeignete Mindestpixeldichte beträgt 512 Pixel x 512 Pixel. Um die Pixeldichte einzustellen, verwenden Sie die Einstellungen für die Galvo-/Resonanzbereichssteuerung (Abbildung 3).
   2. Vermeiden Sie bei der Ermittlung des ROI Photobleaching, indem Sie die Leistung mit der Option Power Control reduzieren (Abbildung 3) und die PMT-Verstärkung in den Einstellungen für die Galvo-/Resonanzscannersteuerung erhöhen (Abbildung 3).
   3. Identifizieren Sie die Oberfläche des Knochens im Zwei-Photonen-Modus, indem Sie im grünen Kanal nach der Autofluoreszenz des fibrösen Periosts suchen, der einen Bandpassfilter verwendet, der bei 525 nm zentriert ist.
      HINWEIS: Die Autofluoreszenz ist am besten bei der Anregungswellenlänge bei 1.000 nm sichtbar, ist aber auch bei 920 nm Anregung verfügbar (Abbildung 3, Multiphotonen-Lasersteuerung). Dieser Orientierungspunkt ist wichtig für die Bestimmung der relativen Tiefe des ROI in die Mittelfußrinde bei der Beobachtung von Osteozyten. Es ist zu beachten, dass bei Zeitreihenexperimenten die genaue Tiefe der abgebildeten Ebene nicht aufgezeichnet wird, obwohl sie tendenziell zwischen 15 und 30 μm liegt. Werden exakte Tiefenmessungen gewünscht, müsste ein Z-Stack gemacht werden.
4. Führen Sie einen Testbelastungsschub durch, um sicherzustellen, dass die chirurgische Vorbereitung und Positionierung innerhalb der Belastungsvorrichtung effektiv waren, um ein stabiles ROI-Feld (d. h. keine Verschiebung der Z-Ebene) zu erreichen. Führen Sie kurz einen Ladezyklus durch, um die Stabilität der chirurgischen Vorbereitung zu beurteilen. Führen Sie das Laden durch, indem Sie den Abschnitt Switch on Servo and Move im Matlab-Code ausführen.
   1. Wenden Sie eine kleine Taraladung an. Stellen Sie sicher, dass die entsprechenden Protokolle zur Belastung von Haversine-Wellen im Voraus vorbereitet werden. Die entsprechenden Belastungsparameter, die während der Kalibrierung ermittelt wurden, sind in Abschnitt 1.2 einzufügen. Führen Sie das Laden durch, indem Sie den Abschnitt Switch on Servo and Move im Matlab-Code ausführen.
   2. Wenn es eine sichtbare Bewegung der Zellen auf dem Bildschirm gibt, die durch eine Mikrobewegung des Knochens als Reaktion auf Belastung oder Atmung entsteht, wählen Sie einen anderen ROI entlang der y- oder z-Richtung, um sicherzustellen, dass er sich direkt über dem mittleren Drehpunkt befindet. Wenn die Bewegung anhält, passen Sie die chirurgische Position des Stifts manuell unter dem dritten Mittelfußknochen an.
      HINWEIS: Ein guter Bereich of Interest (ROI) ist ein Bereich, bei dem sich die Zellen nicht in die Ebene/den Fokus hinein und aus ihr heraus bewegen. Die Bewegung in x- und y-Richtung kann für die Nachbearbeitung mit dem Template-Matching-Plugin auf ImageJ angepasst werden.
5. Führen Sie eine Z-Stack- oder T-Serien-Bildgebung mit Belastung entsprechend dem Versuchsdesign durch, um morphometrische bzw. dynamische lastinduzierte Signalereignisse aufzuzeichnen.
   1. Stellen Sie die Anregungswellenlänge für den Fluoreszenzindikator ein (z. B. 920 nm für GCaMP6f). Verwenden Sie für den Z-Stapel eine ausreichend niedrige Auflösung, um Merkmale der Osteozyten zu erfassen, z. B. Schritte von 0,25 bis 1 μm. Verwenden Sie für die t-Serie die Einstellungen, um mindestens das 6-fache der Laderate abzutasten. Bei einer Laderate von 1 Hz stellt die Bildgebung mit 6 Bildern pro Sekunde (FPS) die minimal geeignete Erfassungsrate dar (Abbildung 3, Galvo-/Resonanzscanner-Steuerung).
   2. Erfassen Sie für das Laden und Live-Imaging bei jedem Durchgang nicht geladene Basisdaten. In dieser Studie werden 60 s ungeladene Bildgebung, gefolgt von 60 s Belastung und Bildgebung, bevorzugt. Gestalten Sie die Lade- und Bildgebungsprotokolle entsprechend. Um Daten zu erfassen, drücken Sie auf Capture (Abbildung 3, Registerkarte oben neben Capture Setup).
      1. Die Refraktärzeit für eine vollständige Kalziumsignalantwort in Knochenzellen wird auf etwa 15 min geschätzt²⁸. Warten Sie mindestens so lange zwischen sequenziellen Ladevorgängen, wenn Sie dynamische Signalisierungsdaten sammeln.
      2. Lassen Sie das Tier während des gesamten Versuchs nicht unbeaufsichtigt, um sicherzustellen, dass es nicht unerwartet aus der Narkose erwacht oder ohne die Möglichkeit eines Eingreifens Stress verspürt.
         HINWEIS: Die Euthanasie am Ende des Eingriffs sollte durch Zervixluxation oder andere geeignete Maßnahmen gemäß den von der IACUC zugelassenen Methoden durchgeführt werden. Dabei handelt es sich um ein Nicht-Überlebensprotokoll, was bedeutet, dass alle Tiere nach der Bildgebung eingeschläfert werden.

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Ergebnisse

Hier berichten wir über eine Methodik zur Untersuchung des Kalzium-Signalwegs in eingebetteten Osteozyten in vivo unter Verwendung von akuter chirurgischer Vorbereitung und Multiphotonen-Fluoreszenzbildgebung. Ein grün fluoreszierendes Signal kann von genetisch kodierten Calciumindikatoren in Osteozyten über die DMP1-Cre-Expression beobachtet werden. Abbildung 4 ist ein Einzelebenenbild von eingebetteten Osteozyten. Beachten Sie, dass al...

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Diskussion

Es ist schwierig, Osteozyten experimentell zu untersuchen, da sie in der Hartgewebematrix eingebettet sind und sich nach Entfernung dieser Nische schnell verschlechtern oder dedifferenzieren. Die Erforschung von Osteozyten erforderte in den letzten 3 Jahrzehnten immensen Einfallsreichtum, wie z. B. die Erstellung von osteozytenähnlichen Linien ^29,30,31, die Erstellung von Protokollen zur Isolierung primärer Osteozyten

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
#3 Handle scalpel	Electron Microscopy Sciences	72040-03	Surgical supplies
20x Water immersion objective	Olympus	XLUMPLFLN20XW	This is a 20x objective, but 40x can also be used for this protocol. We recommend water immersions because it needs to be dipped in the bath during imaging, so open-air objective may cause abberrations
A.M. Bickford Omnicon F/AIR	AM Bickford	80120	A sensible answer to anesthesia gas problems in the operating room, the F/AIR anesthesia gas filter was specifically designed to remove waste anesthesia gases such as Isoflurane, Halothane, Enflurane, etc. from the operating room environment.
A.M. Bickford Omnicon F/AIR Kit	AM Bickford	80000	An entire kit with tube and adaptors to connect F/AIR to setup
B6J.Cg-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAG-GCaMP6f)Hze/MwarJ	The Jackson Laboratory	28865	GCaMP6f Mice for cross-breeding with Dmp1-Cre mice
B6N.FVB-Tg(Dmp1-cre)1Jqfe/BwdJ	The Jackson Laboratory	23047	Dmp1-Cre Mice for cross-breeding with GCaMP6f  mice
Compression load cell	FUTEK Advanced Sensor Technology, Inc.	905898	LCM100 , 1000 g , Sub-miniature tension & compression load cell (Miniature/Inline Threaded) , RoHS lead free, Material - 17-4 PH S.S. , M3x0.5-thread , 34 Awg 4 conductor braided polyester cable , 5 ft Long
Corning 500 mL DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline), 1x [+] calcium, magnesium	VWR International	21-030-CV	Ionically balanced bath that contains calcium submerges the metatarsal during imaging
Dental pick tool	Electron Microscopy Sciences		Surgical supplies
Ethyl alcohol pure 200 proof ACS reagent >99.5%	Sigma Aldrich	SIAL-459844-500ML	Sterilization purposes
Fulcrum pin	Fathom	N/A	Fabricated by direct 3D laser sintering of stainless steel (PH1 alloy) from 3D SolidWorks STL files. Original vendor was GPI Prototype & Manufacturing Services, Inc, now acquired by FATHOM, specifications are provided in the previously published document
High resolution and speed USB220 output kit	FUTEK Advanced Sensor Technology, Inc.	717435	Used to connect load cell to laptop
ImageJ 1.53t with Java 1.8.0_172 (for Windows 64-bit)	NIH	N/A	Install here https://imagej.nih.gov/ij/
Isoflurane	Piramal Critical Care	66794-013-25	100% inhalation vapour liquid
Loading bracket	Fathom	N/A	Fabricated by direct 3D laser sintering of stainless steel (PH1 alloy) from 3D SolidWorks STL files. Original vendor was GPI Prototype & Manufacturing Services, Inc, now acquired by FATHOM, specifications are provided in the previously published document
MATLAB R2019a	MathWorks		For running the loading device
Matrx VIP 3000 vaporizer well fill isoflurane	Butler Schein Animal Health	14309	Vaporizer for anesthetic
Nonin pulse oximeter Model 2500A Vet		2500A Vet
Piezo servo controller	PI-USA	E-625	Electronic component recommended by the company to be used with the actuator
PiezoMove high-stiffness linear piezo actuator	PI-USA	P-602.5SL	Actuator for the loading device
Scalpel blades, No. 10 for handle No. 3, pack of 100	Electron Microscopy Sciences	72044-10	Surgical supplies
Stainless steel tweezers with sharp, fine tips. Length: 120 mm	Electron Microscopy Sciences	78326-42	Surgical supplies
Thorlabs Bergamo multiphoton microscope	ThorLabs	N/A	This is only the imaging system and does not have the laser included, although ThorLabs has laser options if desired
Titanium-Saphire Chameleon Discovery NX with Total Power Control (TPC)	Coherent	N/A	This system technically has two lasers, both a tunable and a fixed laser. However, for the protocol, only the tunable is needed.
Vannas spring scissors - 4 mm cutting edge	Fine Science Tools	15018-10	Surgical supplies
Water bath	Fathom	N/A	Fabricated by direct 3D laser sintering of stainless steel (PH1 alloy) from 3D SolidWorks STL files. Original vendor was GPI Prototype & Manufacturing Services, Inc, now acquired by FATHOM, specifications are provided in the previously published document