Bildgebung der alternden Cochlea mit Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie

Zusammenfassung

Ein Lichtblattmikroskop wurde entwickelt, um die gesamte Cochlea abzubilden und zu digitalisieren.

Zusammenfassung

Taubheit ist die häufigste sensorische Beeinträchtigung und betrifft laut Weltgesundheitsorganisation weltweit etwa 5 % oder 430 Millionen Menschen¹. Alterung oder Presbyakusis ist eine Hauptursache für Schallempfindungsschwerhörigkeit und ist gekennzeichnet durch eine Schädigung der Haarzellen, der spiralförmigen Ganglienneuronen (SGNs) und der Stria vascularis. Diese Strukturen befinden sich in der Cochlea, die eine komplexe, spiralförmige Anatomie aus membranösem Gewebe aufweist, das in Flüssigkeit suspendiert und von Knochen umgeben ist. Diese Eigenschaften machen es technisch schwierig, histopathologische Veränderungen zu untersuchen und zu quantifizieren. Um diesem Bedarf gerecht zu werden, haben wir ein Lichtblattmikroskop (TSLIM) entwickelt, das die gesamte Cochlea abbilden und digitalisieren kann, um die Untersuchung von Struktur-Funktions-Beziehungen im Innenohr zu erleichtern. Gut ausgerichtete serielle Schnitte der gesamten Cochlea führen zu einem Stapel von Bildern für die dreidimensionale (3D) Volumendarstellung und Segmentierung einzelner Strukturen für die 3D-Visualisierung und quantitative Analyse (d. h. Länge, Breite, Oberfläche, Volumen und Anzahl). Cochleae erfordern minimale Verarbeitungsschritte (Fixierung, Entkalkung, Dehydratisierung, Färbung und optische Reinigung), die alle mit der anschließenden hochauflösenden Bildgebung durch Raster- und Transmissionselektronenmikroskopie kompatibel sind. Da alle Gewebe in den Stapeln vorhanden sind, kann jede Struktur einzeln oder relativ zu anderen Strukturen beurteilt werden. Da bei der Bildgebung fluoreszierende Sonden verwendet werden, können Immunhistochemie und Ligandenbindung verwendet werden, um spezifische Strukturen und deren 3D-Volumen oder -Verteilung innerhalb der Cochlea zu identifizieren. Hier haben wir TSLIM verwendet, um Cochleae von gealterten Mäusen zu untersuchen, um den Verlust von Haarzellen und spiralförmigen Ganglienneuronen zu quantifizieren. Darüber hinaus wurden fortgeschrittene Analysen (z. B. Clusteranalyse) verwendet, um lokale Reduktionen von Spiralganglienneuronen im Rosenthal-Kanal entlang seines 3D-Volumens zu visualisieren. Diese Ansätze demonstrieren die Fähigkeit der TSLIM-Mikroskopie, Struktur-Funktions-Beziehungen innerhalb und zwischen Cochleae zu quantifizieren.

Einleitung

Die Cochlea ist das periphere Sinnesorgan für das Gehör bei Säugetieren. Es hat eine komplexe spiralförmige Anatomie aus sich wiederholenden Sinnes- und Stützzellen, die anatomisch darauf spezialisiert sind, Schallschwingungen zu erkennen und sie zur Wahrnehmung des Gehörs an das Gehirn weiterzuleiten. Die wichtigsten sensorischen Elemente sind die inneren und äußeren Haarzellen und ihre innervierten Nervenfasern, deren Zellkörper das Spiralganglion bilden, das sich im Rosenthal-Kanal befindet (Abbildung 1). Diese sensorischen und neuronalen Strukturen sind tonotopisch so angeordnet, dass hochfrequente Töne in der Cochlea-Basis und niederfrequente Töne in der Cochlea-Spitze² transduziert werden. Eine anatomische Karte dieser sensorischen Zellverteilung entlang der Spirallänge der tragenden Basilarmembran wird als Zytocochleogramm³ bezeichnet und kann mit einem Hörverlust in Abhängigkeit von der Frequenz verglichen werden, wie in einem Audiogramm dargestellt.

Das membranöse Labyrinth der Cochlea, das von dichtem Knochen umgeben ist, macht es technisch schwierig, mehr als eine Cochlea-Struktur gleichzeitig zu untersuchen. Der Grundgedanke für die Entwicklung eines Lichtblattmikroskops besteht daher darin, gut ausgerichtete Serienschnitte der gesamten Cochlea herzustellen, so dass alle Cochlea-Strukturen in 3D-Rekonstruktionen relativ zueinander untersucht werden können. Voie et ^al.4 und Voie und Spelman⁵ entwarfen das erste Lichtblattmikroskop, das sogenannte OPFOS-Mikroskop (Orthogonal Plane Fluorescence Optical Sectioning), um die gesamte Cochlea optisch zu schneiden. Dieses Mikroskop wurde jedoch nie kommerziell entwickelt; Unser Ziel war es daher, ein Lichtblattmikroskop zu konstruieren, das als Dünnschicht-Laserbildgebungsmikroskop (TSLIM; Abbildung 2). Die Design- und Konstruktionsdetails für TSLIM wurden bereits veröffentlicht⁸. TSLIM hat gegenüber dem OPFOS mehrere Verbesserungen vorgenommen, darunter die Verwendung einer Low-Light-Digitalkamera im Vergleich zu einer CCD-Kamera für die Bilderfassung, optisch codierte Mikropositionierer für eine genaue und reproduzierbare Bewegung der Probe durch das Lichtblatt, die Verwendung einer kommerziell erhältlichen, optisch klaren Probenkammer und die Rhodaminfärbung in Ethanol statt in der Klärlösung, um Fleckenausfällungen im Gewebe zu verhindern. Die kommerzielle Entwicklung von Lichtblattmikroskopen wie SPIM⁶ konzentrierte sich auf die hochauflösende Bildgebung von lebenden, kleinen, transparenten Proben, die jedoch für die Bildgebung der gesamten Cochlea ungeeignet sind, da sie keinen ausreichenden Arbeitsabstand haben. Ein Überblick über die Entwicklung anderer Lichtblattmikroskope wurde von Santi⁷ veröffentlicht. Der Hauptvorteil von TSLIM gegenüber anderen histologischen Methoden zur Untersuchung der Cochlea besteht darin, Gewebe für die 3D-Rekonstruktion optisch zu schneiden und gleichzeitig die Integrität der Probe zu erhalten, so dass sie mit anderen histologischen Methoden verwendet werden kann. Ein weiterer Vorteil der TSLIM-Bildgebung besteht darin, dass nur eine dünne Lichtschicht, die von einem Laser erzeugt wird, dem Gewebe ausgesetzt wird, verglichen mit der Belichtung des gesamten Gewebes mit dem Laser wie bei der konfokalen Mikroskopie. Die Gewebereinigung zur Minimierung der Lichtstreuung und die Tatsache, dass nur ein kleiner Teil des Gewebes dem Laser ausgesetzt ist, führt zu einem minimalen Fluorochrom-Fading (Photobleichen) bei der Lichtblatt-Laserbildgebung. Der Prozess der Fixierung, Dehydrierung und Klärung verändert jedoch die Morphologie der Cochlea-Strukturen und führt zu einer Gewebeschrumpfung im Vergleich zu lebendem Gewebe. Das tatsächliche Ausmaß der auftretenden Gewebeschrumpfung wurde nicht bestimmt.

TSLIM wurde von Shane Johnson und acht deutschen Studenten der Optischen Technik entwickelt (siehe Danksagung). Details zur TSLIM-Konstruktion wurden von Santi et ^al.8 und eine Scan-Version (sTSLIM) von Schröter et ^al.9 zur Verfügung gestellt. TSLIM fungiert als zerstörungsfreies Mikrotom zum optischen Schneiden von Proben und als Mikroskop zum Sammeln von 2D-Serienschnitten über die gesamte Breite und Dicke der Cochlea. TSLIM kann sowohl kleine (mm) als auch große (cm) dicke Proben abbilden. Die Linsen sind luftmontiert, um große Arbeitsabstände mit Sammelobjektiven von 1x und 2x auf einem Dissektionsmikroskop zu ermöglichen. Das Dissektionsmikroskop verfügt außerdem über eine Zoomoptik, die es TSLIM ermöglicht, subzelluläre und synaptische Strukturen auf Zellen aufzulösen. TSLIM ist sowohl mit einem blauen (473 nm) als auch mit einem grünen (532 nm) Laser für die Beleuchtung ausgestattet, der es ermöglicht, eine Vielzahl von Fluoreszenzsonden für die Bildgebung zu verwenden. Das Ziel von TSLIM ist es, gut ausgerichtete optische 2D-Schnitte durch eine ganze Cochlea für eine vollständige digitale Rekonstruktion von Cochlea-Geweben zu erzeugen. Da es sich um eine Fluoreszenzmethode handelt, können auch Liganden und Immunhistochemie verwendet werden, um spezifische Cochlea-Strukturen zu identifizieren.

Ursprünglich wurde eine zylindrische Linse verwendet, um zwei gegenüberliegende Gaußsche Lichtblätter zu erzeugen, aber sie erzeugte Absorptionsbildgebungsartefakte. Aufgrund der Arbeit von Keller et ^al.10 wurde die feste zylindrische Linse durch einen scannenden Galvanometerspiegel ersetzt, um das Lichtblatt⁹ herzustellen. Da die Mitte des Lichtblatts an der Strahltaille am dünnsten ist, werden sTSLIM 2D-Bilder erzeugt, indem eine Zusammenstellung von Datenspalten der X-Achse über die Breite der Probe gesammelt wird (Abbildung 3). Diese Methode wurde erstmals von Buytaert und Dircks¹¹ beschrieben. Die kundenspezifische TSLIM-Software zum Steuern und Sammeln von Bildern wurde unter Verwendung eines grafischen Programms zur Instrumentensteuerung entwickelt. Das Lichtblatt wandert durch die Probe und beleuchtet eine fluoreszierende Ebene innerhalb des Gewebes. Diese fluoreszierende Ebene wird orthogonal durch die transparente Probe projiziert und von einem Dissektionsmikroskop gesammelt. Optisch kodierte Mikropositionierer ermöglichen das Scannen durch die Strahltaille in der X-Achse, um ein einzelnes zusammengesetztes 2D-Bild zu erfassen, und anschließend bewegt der Mikropositionierer der Z-Achse die Probe in eine tiefere Ebene innerhalb des Gewebes, um einen Stapel serieller, geschnittener 2D-Bilder zu erhalten (Video 1, Abbildung 4). Ein Stapel von Translationsbildern wird über die gesamte Breite, Dicke und Länge der Cochlea gesammelt, und das Zusammenfügen von Bildern ist nicht erforderlich (Video 2). Der Bildstapel wird auf einen anderen Computer übertragen und zur 3D-Rekonstruktion und Quantifizierung in ein 3D-Rendering-Programm geladen. Die Bildstapel enthalten alle digitalen Informationen über die Morphologie einer Cochlea bei der Auflösung des Mikroskops. Wenn jedoch eine höhere Auflösung erforderlich ist, kann die intakte Cochlea durch destruktive histologische Methoden wie Mikrotomschnitt, Raster- und Transmissionselektronenmikroskopie weiterverarbeitet werden.

Das 3D-Rendering-Programm wird verwendet, um verschiedene Cochlea-Strukturen für das 3D-Rendering und die quantitative Analyse zu segmentieren. Für die Segmentierung wird jede Struktur in jedem 2D-Bild des Stapels mit einem Grafiktablett und einem Stift in einer anderen Farbe nachgezeichnet (Abbildung 5). Bis heute wurden 20 verschiedene Cochlea-Strukturen segmentiert (Abbildung 6). Nach der Segmentierung können verschiedene 3D-Analysen durchgeführt werden. Zum Beispiel kann eine 3D-Rendering-Software die Cochlea in jeder Ebene entlang des Schwerpunkts der Struktur virtuell resektionieren. Video 3 zeigt den Schnitt tangential zum Corti-Organ, der die Haarzellen entlang der Länge der Basilarmembran freilegt. Dieser Prozess erfordert zunächst eine manuelle Segmentierung der interessierenden Struktur. Als nächstes wird der Schwerpunkt der Struktur basierend auf der Anpassung der kleinsten Quadrate von Spline-Punkten berechnet, die entlang der Mitte der Struktur von ihrer Basis bis zu ihrem Scheitelpunkt platziert sind, wodurch eine Annäherung an die Länge der Struktur ermöglicht wird (Video 4). Ein ähnlicher Prozess, der als Skelettierung bezeichnet wird, kann verwendet werden, um die radiale Breite der Struktur entlang ihrer Länge mithilfe einer Farbkarte zu visualisieren (Video 4). Das Gesamtvolumen jeder Struktur wird vom Programm nach der Segmentierung berechnet, aber relative Abstände können auch quantifiziert und mit Farbkarten in einer 3D-Rendering-Software visualisiert werden (Abbildung 7). Segmentierte Strukturen können auch exportiert werden, um vergrößerte Renderings von Volumenkunststoffmodellen zu erzeugen (Abbildung 8). Darüber hinaus kann die halbautomatische Zellzählung auch mit einer 3D-Rendering-Software durchgeführt werden (Abbildung 9). Immunhistochemie und Ligandenbindung können verwendet werden, um spezifische Cochlea-Strukturen zu färben, und diese Strukturen können von anderen Cochlea-Strukturen für morphometrische Beurteilungen, wie z. B. die Erstellung eines Zytocochleogramms, isoliert werden (Abbildung 10). Länge, Breite, Oberfläche, Volumen und Anzahl aller Cochlea-Strukturen können aus den 3D-Modellen bestimmt werden, wodurch sich dieser Ansatz ideal für die Kartierung von Cochlea-Schäden auf funktionelle Beeinträchtigungen eignet. Konkret können Cochlea-Schäden durch Alterung, lärmbedingte Traumata oder andere Beleidigungen in 3D-Cochlea-Rekonstruktionen aus optischen 2D-Schnitten dargestellt und quantifiziert werden. Sobald eine Cochlea digitalisiert wurde, gibt es zahlreiche bildgebende Algorithmen, mit denen die Cochlea-Schädigung von Geweben innerhalb der Cochlea im anatomischen Register zu anderen Cochlea-Geweben beurteilt werden kann.

Protokoll

Alle Verfahren und die Verwendung lebender Tiere wurden vom Institutional Care and Use Committee (IACUC) der University of Minnesota überprüft und genehmigt (Protokoll-ID #2010-38573A), und die Ermittler, die diese Tiere verwenden, wurden von den Tierärzten der Research Animal Resources (RAR) gründlich geschult und getestet, bevor sie Zugang zu den Tiereinrichtungen haben. In dieser Studie wurden sowohl männliche als auch weibliche Mäuse verwendet.

1. Cochlea-Entfernung zur Fixierung und Gewebeverarbeitung für die Bildgebung

1. Euthanasieren Sie eine Maus durch CO₂ -Inhalation. Enthaupten Sie die Maus mit einer Schere und machen Sie einen dorsal-ventralen Schnitt durch das Gehirn, um den Schädel zu halbieren. Entfernen Sie das Gehirn, identifizieren Sie die runde Bulla im baso-ventralen Teil des Schädels, öffnen Sie die Bulla mit Rongeurs und visualisieren und entfernen Sie die Cochlea.
2. Fixierung: Führen Sie diesen Vorgang unter einem Abzug und mit einem Dissektionsmikroskop bei 5-facher Vergrößerung durch. Tragen Sie Handschuhe und Schutzkleidung. Durchstechen Sie das ovale Fenster und entfernen Sie den Steigbügel mit einer scharfen Spitzhacke. Führen Sie einen Pickel in das runde Fenster ein, um die Membran zu durchstechen.
3. Decken Sie das geöffnete runde Fenster mit der Schnittspitze eines Infusionssets ab, das an einer 1-ml-Spritze befestigt ist, die mit 2 ml Formalin gefüllt ist. Ziehen Sie Formalin langsam über einen Zeitraum von 2 Minuten durch die perilymphatischen Räume der Cochlea und stellen Sie fest, dass Formalin über das geöffnete ovale Fenster aus der Cochlea austritt. Schneiden Sie überschüssiges Gewebe von der Cochlea ab und tauchen Sie es in eine Flasche mit 10% Formalin und legen Sie es über Nacht auf einen Rotator.
4. Entkalkung: Spülen Sie die Cochlea in PBS 3x für jeweils 5 Minuten und tauchen Sie sie 4 Tage lang in eine Flasche mit 10% iger Lösung von Dinatriumethylendiamintetraessigsäure (EDTA) mit Rotation ein, wobei Sie die Lösung täglich wechseln.
5. Dehydration: Durchbluten Sie die Cochlea mit PBS 3x und tauchen Sie zwischen den Wechseln 15 Minuten lang ein. Dehydrieren Sie die Cochlea mit aufsteigenden Konzentrationen von Ethanol 10%, 50%, 70%, 95%, 95%, 100%, 100%; für 30 min in jeder Konzentration.
   HINWEIS: Es ist wichtig, das gesamte EDTA vor der Dehydratisierung zu entfernen, da EDTA in Ethanol ausfällt. Außerdem können Cochleae über Nacht in jeder Ethanolkonzentration von mehr als 70% belassen werden.
6. Färbung: Färben Sie die gesamte Cochlea durch Eintauchen in eine Lösung von Rhodamin-B-Isothiocynat (5 μg/ml in 100% Ethanol) über Nacht mit Rotation. Entfernen Sie überschüssigen Farbstoff von der Cochlea mit zwei Wechseln von 100% Ethanol, jeweils 5 Minuten Wechsel.
7. Clearing: Die gefärbte Cochlea in zwei Wechsel der Spalteholz^12-Lösung (5:3 Methylsalicylat:Benzylbenzoat) mit jeweils 30 min Wechsel überführen und über Nacht in der Clearing-Lösung mit Rotation belassen. Cochleae können auf unbestimmte Zeit in Spalteholz-Lösung belassen werden.

2. Bildgebung von Cochleae

1. Befestigen Sie die Cochleae an einem Probenstab am ovalen und runden Fenstermembranende, so dass die Klärlösung in der Cochlea verbleibt und sich keine Blasen bilden (Abbildung 2). Es muss darauf geachtet werden, dass sich keine Blasen in der Cochlea bilden, da diese schwer zu entfernen sind und wenn sie im Gewebe verbleiben, bildgebende Artefakte verursachen.
2. Verwenden Sie einen UV-aktivierenden Kleber, um die feuchte Cochlea am trockenen Probenstab zu befestigen (Abbildung 2). Befestigen Sie die Cochlea an den ovalen und runden Fensterenden. Härten Sie den UV-Kleber 10 s lang aus, indem Sie sich mit dem UV-Licht um die Cochlea bewegen.
   HINWEIS: Eine lose Befestigung der Cochlea am Probenstab führt zu Abbildungsfehlern. Dieser Stab wurde speziell für dieses Protokoll hergestellt (siehe Santi et ^al.8 für Details) und ist spezifisch für unser Lichtblattmikroskop.
3. Hängen Sie die Cochlea in die Bildgebungskammer, die mit Spalteholz-Lösung für die Bildgebung gefüllt ist. Bei der Probenkammer handelt es sich um eine optisch klare Quarzfluorometerzelle (Video 1).
4. Befestigen Sie den Probenstab an einem drehbaren Halter, der auch am XZ-Translationstisch befestigt ist. Die meisten Stapel werden durch Verschieben der Probe in den XZ-Ebenen erhalten, aber es können auch Rotationsstapel erhalten werden.
5. Optischer TSLIM-Schnitt: Verwenden Sie je nach Art der Fluorochromfärbung einen blauen oder grünen Laser zur Anregung. Positionieren Sie das Lichtblatt zur Fokussierung in der Mitte des Gewebes und bestimmen Sie die Vergrößerung, mit der die gesamte Breite der Cochlea beleuchtet wird. Verwenden Sie dann ein speziell entwickeltes Programm, um die Probe durch das Lichtblatt über die Probe in der X-Achse (Zusammenfügen des Bildes) und in Z-Schritten zu bewegen, um einen Stapel von 2D-Bildern in der gesamten Cochlea zu erstellen.
6. Für das erste Bild wird die Strahltaille des Lichtblatts am Rand der Probe positioniert und das Programm scannt die gesamte Breite der Probe und sammelt Datenspalten (siehe Bildzusammenfügung; Santi et ^al.8), die die Breite des konfokalen Parameters (Abbildung 3) darstellen, um ein zusammengesetztes 2D-Bild mit maximaler Auflösung über die Breite der Probe zu erzeugen. Das Programm automatisiert das Zusammenfügen von Bildern für jeden Z-Schritt, bis die Probe vollständig abgebildet ist.
7. Bildverarbeitung: Übertragen Sie den Bildstapel auf einen anderen Computer und laden Sie ihn zur 3D-Rekonstruktion und Quantifizierung in ein 3D-Rendering-Programm.

Ergebnisse

Da das Thema dieser Sonderausgabe die Darstellung der Auswirkungen des Alterns in der Cochlea ist, werden eine junge (3 Monate alt, HS2479, CBA-Stammmaus) und gealterte (23 Monate alt, HS2521, C57-Stammmaus) Cochleae als Beispiele verwendet. Es sollte beachtet werden, dass TSLIM in der Lage ist, eine Vielzahl von Proben abzubilden, einschließlich Cochleae von Menschen, Säugetieren, anderen Nagetieren und Fischen sowie anderen Organen wie dem Gehirn.

Johnson et al. ¹³ ...

Diskussion

Der optische Schnitt durch Lichtblattmikroskopie zur Untersuchung von Cochlea-Strukturen ist nicht mechanisch zerstörerisch wie andere traditionellere histologische Methoden und bietet eine vollständige digitale Ansicht der Cochlea-Strukturen relativ zueinander. Frühere Methoden wie Oberflächenpräparationen des Corti-14-Organs lieferten eine Karte des Haarzellverlusts entlang der Länge der Basilarmembran, aber der SGN-Verlust konnte nicht beurteilt werden, da das Gewebe wegseziert worden war, um das Corti-Organ fre...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amira 3D Rendering Software	ThermoFisher Scientific		Address: 501 90th Ave NW, Coon Rapids, MN 55433
benzyl benzoate (W213810)	Sigma-Aldrich, Inc.		Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178
Bondic	Bondic		Address: 235 Industrial Parkway S., Unit 18 Aurora, ON L4G 3V5 Canada
Ethanol 95% and 100%	University of Minnesota		Address: General Storehouse, Minneapolis, MN 55455
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)  (E5134)	Sigma-Aldrich, Inc.		Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178
LabVIEW graphical program and Vision	National Instruments		Address: 11500 N Mopac Expwy Austin, TX 78759-3504
methyl salicylate (M6742)	Sigma-Aldrich, Inc.		Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178
Olympus MVX10 dissection microscope	Olympus Corp		Address: 3500 Corporate Parkway, Center Valley, PA 18034
Rhodamine B isothiocynate, (283924)	Sigma-Aldrich, Inc.		Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178
Starna Flurometer Cell (3-G-20)	Starna Cells		Address: PO Box 1919, Atascadero, CA 82423