Evaluation der Integrität des Spindel-Assemblierungs-Checkpoints in Maus-Eizellen

Zusammenfassung

Fehler in der Chromosomentrennung sind ein häufiges Merkmal bei Eizellen. Daher gibt die Untersuchung des Spindelanordnungs-Checkpoints wichtige Hinweise auf die Mechanismen, die zur Produktion gesunder Eier erforderlich sind. Das vorliegende Protokoll beschreibt drei komplementäre Assays zur Beurteilung der Integrität des Spindelaufbau-Checkpoints in Maus-Oozyten.

Zusammenfassung

Aneuploidie ist die häufigste genetische Anomalie, die beim Menschen zu frühen Fehlgeburten und Schwangerschaftsversagen führt. Die meisten Fehler in der Chromosomentrennung, die zu Aneuploidie führen, treten während der Meiose in Eizellen auf, aber warum die Eizellmeiose fehleranfällig ist, ist noch nicht vollständig geklärt. Während der Zellteilung verhindern Zellen Fehler in der Chromosomentrennung, indem sie den Spindle Assembly Checkpoint (SAC) aktivieren. Dieser Kontrollmechanismus beruht auf der Erkennung von Kinetochor (KT)-Mikrotubuli (MT) und der Erfassung der von Spindelfasern erzeugten Spannung. Wenn KTs nicht gebunden sind, wird der SAC aktiviert und verhindert das Fortschreiten des Zellzyklus. Das SAC wird zuerst durch die MPS1-Kinase aktiviert, die die Rekrutierung und Bildung des mitotischen Checkpoint-Komplexes (MCC) auslöst, der aus MAD1, MAD2, BUB3 und BUBR1 besteht. Dann diffundiert das MCC in das Zytoplasma und sequestriert CDC20, einen anaphasenfördernden Komplex/Zyklosom-Aktivator (APC/C). Sobald KTs an Mikrotubuli gebunden sind und die Chromosomen an der Metaphasenplatte ausgerichtet sind, wird der SAC zum Schweigen gebracht, CDC20 wird freigesetzt und der APC/C wird aktiviert, wodurch der Abbau von Cyclin B und Securin ausgelöst wird, wodurch der Beginn der Anaphase ermöglicht wird. Im Vergleich zu somatischen Zellen ist die SAC in Eizellen nicht so effektiv, da Zellen trotz ungebundener KTs eine Anaphase durchlaufen können. Um zu verstehen, warum die SAC freizügiger ist und ob diese Permissivität eine der Ursachen für Chromosomentrennungsfehler in Eizellen ist, bedarf es noch weiterer Untersuchungen. Das vorliegende Protokoll beschreibt die drei Techniken zur umfassenden Beurteilung der SAC-Integrität in Maus-Eizellen. Diese Techniken umfassen die Verwendung von Nocodazol zur Depolymerisierung von MTs zur Bewertung der SAC-Antwort, die Verfolgung der SAC-Stummschaltung durch Verfolgung der Kinetik der Securin-Zerstörung und die Bewertung der Rekrutierung von MAD2 zu KTs durch Immunfluoreszenz. Zusammen untersuchen diese Techniken Mechanismen, die benötigt werden, um gesunde Eier zu produzieren, indem sie eine vollständige Bewertung der SAC-Integrität liefern.

Einleitung

Aneuploidie, die durch Fehler in der Chromosomentrennung entsteht, ist die Hauptursache für frühe Fehlgeburten und steht in engem Zusammenhang mit Fehlern in der Meiose¹. Die Meiose unterscheidet sich von der Mitose dadurch, dass sie aus zwei Zellteilungsrunden ohne einen dazwischenliegenden DNA-Replikationsschritt besteht. In der Meiose I trennen sich homologe Chromosomen, während Schwesterchromatiden zusammen bleiben. In Eizellen ist dieser Schritt fehleranfällig und führt zur Produktion von aneuploiden Eizellen².

Um Fehler bei der Chromosomentrennung zu vermeiden, aktivieren die meisten Zelltypen einen Überwachungsmechanismus, der den Zellzyklus anhält, den sogenannten Spindle Assembly Checkpoint (SAC). Dieser Mechanismus erkennt Kinetochor (KT)-Mikrotubuli (MT) -Anhaftungen und die Spannung wird erzeugt, wenn Chromosomen bipolar ausgerichtet sind³. Ungebundene Kinetochoren lösen eine SAC-Reaktion aus, die mit der Rekrutierung von MPS1, dem Master-Regulator des SAC, zu den Kinetochoren ^3,4 beginnt. MPS1 initiiert die Rekrutierung anderer SAC-Komponenten und fungiert als Plattform für die Bildung des mitotischen Checkpoint-Komplexes (MCC). Das MCC, bestehend aus MAD1, MAD2, BUB3 und BUBR1, diffundiert in das Zytoplasma und hemmt die APC/C-Aktivierung, indem es seinen Aktivator CDC20 sequestriert. Sobald alle Kinetochoren stabil an MTs gebunden sind und die Chromosomen an der Metaphasenplatte ausgerichtet sind, wird der SAC zum Schweigen gebracht, und der MCC zerlegt und setzt CDC20 frei, wodurch eine APC/C-Aktivierung ermöglicht wird. Aktives APC/C baut Securin und Cyclin B ab, zwei wichtige Schritte bei der Auslösung des Beginns^der Anaphase ^5,6. In somatischen Zellen ist das SAC stringent, da es durch ein einzelnes, nicht gebundenes Kinetochor aktiviert wird und ausreicht, um einen Zellzyklusstillstand zu induzieren⁶. Während der Meiose der Oozyten ist die SAC jedoch freizügiger, und die Eizellen können mit einer oder mehreren ungebundenen Kinetochorenⁱⁿ die Anaphase I eintreten 6,7,8,9,10. Zu verstehen, warum die SAC in Eizellen freizügiger ist, ist ein fortlaufender Schwerpunkt in diesem Bereich. Mechanismen, die Defekte in der SAC-Aktivierung oder SAC-Stummschaltung verursachen, können zu Fehlern in der Chromosomentrennung oder zu einem verlängerten Zellzyklusstillstand und Zelltod führen. Daher ist die Bewertung der Mechanismen, die die SAC-Integrität in Eizellen aufrechterhalten, wichtig, um den Prozess der Bildung gesunder, euploider Eizellen zu verstehen.

Dieses Protokoll beschreibt Techniken zur umfassenden Bewertung der SAC-Integrität in der Meiose von Maus-Eizellen durch die Untersuchung verschiedener kritischer Schritte des Checkpoints. Zunächst wird die Auswertung der SAC-Antwort nach Induktion der SAC-Aktivierung beschrieben. Diese Aktivierung wird durch die Erzeugung von ungebundenen Kinetochoren unter Verwendung von Nocodazol erreicht, einem Medikament, das MTs¹¹ depolymerisiert. Zweitens wird eine Methode zur Überwachung der SAC-Stummschaltung beschrieben, indem die Dynamik des Securin-Abbaus während der Eizellreifung verfolgt wird. Schließlich wird ein Immunfluoreszenz-basierter Assay verwendet, um die Rekrutierung von MAD2, einer der MCC-Komponenten, zu Kinetochoren zu messen. Zusammen bewerten diese Assays umfassend die SAC-Integrität während der meiotischen Reifung der Eizellen.

Protokoll

Alle Mäuse, die in diesen Protokollen verwendet wurden, wurden gemäß den Richtlinien des Rutgers University Institutional Animal Use and Care Committee (Protokoll 201702497) und der National Institutes of Health untergebracht und aufgezogen. Diese Aufsichtsbehörden genehmigten alle Versuchsverfahren mit Tierversuchen. Alle Mäuse, die in der vorliegenden Studie verwendet wurden, waren 6-8 Wochen alte CF-1-Weibchen.

1. Experimentelle Vorbereitung

1. Bevor Sie mit den SAC-Auswertungen beginnen, entnehmen Sie Maus-Eizellen gemäß dem zuvor veröffentlichten Bericht¹². Die entnommenen Eizellen werden in drei gleich große Gruppen aufgeteilt und in Nährmedien von Chatot, Ziomek und Bavister (CZB) aufbewahrt, die 2,5 μM Milrinon enthalten (siehe Materialtabelle), um eine meiotische Wiederaufnahme^{zu vermeiden 13}.
   HINWEIS: CZB-Zusammensetzung: 81,6 mM NaCL; 4,8 mM KCl; 1,2 mM_KH2PO4; 1,2 mM MgSO 4-7H2O; 0,27 mM Pyruvat; 1,7 mM CaCl₂; 30,8 mM DL-Milchsäure; 7 mM Taurin; 0,1 mM EDTA; 25 mM NaHCO₃; Gentamicin; und 0,3% BSA.
2. Bereiten Sie die cRNA für die Mikroinjektion vor, wie zuvor^{beschrieben 12,14}. Amplifikation des Maus-Securin-Gens aus der cDNA, die aus den Keimvesikel-Eizellen der Maus kloniert wurde, gefolgt von der Subklonierung in den pMDL2-Vektor, der die Gfp-Sequenz^15,16 enthält.
   1. Zur Herstellung von Securin-Gfp cRNA wird das Plasmid mit Nde I-Verdauung linearisiert. Führen Sie eine In-vitro-Transkription durch, indem Sie T3-RNA-Polymerase verwenden und die cRNA¹⁶ reinigen.
      HINWEIS: Lagern Sie cRNA in Aliquots von 2-3 μL bei -80 °C bis zur Verwendung.

2. Nocodazol-Behandlung und Live-Bildgebung

1. Bereiten Sie 1 ml Nährmedium (CZB) mit 5 μM Nocodazol (NOC), 1 ml Nährmedium mit 5 μM NOC plus 0,5 μM Reversin (NOC + REV) und 1 ml Nährmedium mit Dimethylsulfoxid (DMSO) (1:2000) als Kontrolle vor (siehe Materialtabelle).
2. Verwenden Sie für die Eizellreifung und Live-Bildgebung eine 96-Well-Platte, die im Inkubator bei 37 °C, 5 %_CO2 und 80 % Luftfeuchtigkeit vorgewärmt wird. Laden Sie in der ersten Vertiefung 150 μL der kontrollierten DMSO-Behandlung; in die zweite Vertiefung 150 μL NOC-Behandlung laden; und in die dritte Vertiefung 150 μL NOC + REV-Behandlung laden. Bewahren Sie die Platte im Inkubator unter den gleichen Bedingungen wie oben auf, bis sie benötigt wird.
   HINWEIS: Vermeiden Sie bei der 96-Well-Platte die Verwendung der ersten Zeile und der ersten Spalte, da der Schatten des Rahmens die Qualität der Bilder beeinträchtigt.
3. Um die meiotische Reifung zu beginnen, entfernen Sie Milrinon. Während Sie die Eizellen unter einem Stereomikroskop mit einer Vergrößerung zwischen 30x und 64x betrachten, waschen Sie Milrinon aus dem Medium, indem Sie die Eizellen nacheinander durch sechs Tropfen 100 μL milrononfreies Nährmedium mit DMSO übertragen und sie mit einer Hand- oder Mundpipette in die entsprechende Vertiefung der 96-Well-Platte legen.
   1. Zählen Sie Eizellen, indem Sie sie mit einer Hand- oder Mundpipette aufnehmen und in den nächsten Tropfen geben, um zu vermeiden, dass sie verloren gehen. Die Eizellen sind einzelne, große (~ 80 μm im Durchmesser) und runde Zellen. Der Zellkern erscheint wie ein Knopf in der Mitte der Zelle, und die Membran und die Zona pellucida umgeben die Eizelle.
      HINWEIS: Übertragen Sie die Eizellen zwischen den Tropfen und bewegen Sie dabei die geringstmögliche Menge an Flüssigkeit. Dies ermöglicht eine optimale Entfernung des Milrinons aus den Nährmedien. Wenn es den Eizellen nicht gelingt, die Meiose wieder aufzunehmen, ist es wahrscheinlich, dass das Milrinon nicht wirksam entfernt wurde.
4. Wiederholen Sie den gleichen Vorgang (Schritt 2.3) für die NOC- und NOC + REV-Behandlung.
5. Bilden Sie die Eizellen mit einem Hellfeldmikroskop ab, das mit einer Inkubatorkammer ausgestattet ist, mit einer kontrollierten Umgebung unter folgenden Bedingungen: 37 °C, 5%_CO2 und 80% Luftfeuchtigkeit. Nehmen Sie Bilder in der mittleren Ebene der Eizellen in Abständen von 20 Minuten für 24 Stunden auf.
6. Quantifizieren Sie die Anzahl der Eizellen, die einen Polkörper (PB) extrudieren, indem Sie die Zellen identifizieren, die eine asymmetrische Zytokinese durchlaufen. Das Ergebnis ist eine kleine Zelle (PB) neben dem Ei und innerhalb der gemeinsamen Zona pellucida. Betrachten Sie die Bilder mit einer Bildbearbeitungssoftware (ImageJ, siehe Materialverzeichnis).
7. Importieren Sie die Bildsequenz in die Bildanalysesoftware und verschieben Sie die Frames, bis eine oder mehrere Zellen eine asymmetrische Zytokinese durchlaufen. Berechnen Sie den Prozentsatz der Eizellen, die einen PB der Gesamtzahl der Eizellen^{extrudieren 17}.

3. Überwachung des Musters des Securin-gfp-Abbaus während der meiotischen Reifung

1. Zentrifuge 3 μL Securin-Gfp cRNA (Schritt 1.2) bei 19.283 x g für 30 min bei 4 °C¹⁸.
   HINWEIS: Verwenden Sie den Überstand, um Verunreinigungen zu vermeiden, die während der Mikroinjektion zu einer Verstopfung der Nadel führen könnten.
2. Befolgen Sie die Schritt-für-Schritt-Mikroinjektion der Eizelle, die in Referenz¹² ausführlich beschrieben ist. Mikroinjektion von Prophase-I-verhafteten Eizellen mit 100 ng/μL Securin-gfp cRNA, die in Schritt 1.2 hergestellt wurden.
3. Lassen Sie die Eizellen nach der Mikroinjektion mindestens 3 h lang die RNA im CO₂ -Inkubator erholen und übersetzen. Überprüfen Sie die Expression, indem Sie die Eizellen in einem automatisierten Mehrkanal-Fluoreszenz-Bildgebungssystem (siehe Materialtabelle) beobachten, um das GFP-Signal anzuzeigen.
4. Wie in Schritt 2.2 beschrieben, werden 150 μL Nährmedien mit oder ohne 5 μM Nocodazol und 150 μL Nährmedien mit 0,5 μM Reversin in drei verschiedenen Vertiefungen einer 96-Well-Platte geladen.
5. Waschen Sie die mikroinjizierten Eizellen durch sechs Tropfen milrinonfreies Nährmedium und übertragen Sie 1/3 der Eizellen in jede Behandlung.
6. Halten Sie die Platte im Inkubator bei 37 °C, mit 5%_CO2 und 80% Luftfeuchtigkeit, bis die Eizellen die Meiose wieder aufnehmen, etwa 3 h nach dem Waschen von Milrinon.
   HINWEIS: Verwenden Sie ein Stereomikroskop mit einer Vergrößerung zwischen 30x und 64x, um den Zusammenbruch der Kernhülle als Kennzeichen der meiotischen Wiederaufnahme zu bewerten.
7. Nehmen Sie Bilder der Eizellreifung mit einem Fluoreszenzmikroskop auf, das mit einer Inkubatorkammer ausgestattet ist, wie in Schritt 2.6 beschrieben. Verwenden Sie Hellfeldeinstellungen, um die Eizellen in der Vertiefung zu finden. Verwenden Sie einen 488-Filter, um das Securin-gfp-Signal zu erkennen, und passen Sie die Fluoreszenzintensität an, um eine Überbelichtung der Zellen zu vermeiden.
   1. Wenn das Bildgebungssystem automatisiert ist, speichern Sie die Positionen der Eizellen in jeder Vertiefung. Da Securin-gfp gleichmäßig im Zytoplasma verteilt ist, sollten Bilder in der mittleren Ebene der Eizellen in Abständen von 20 Minuten für 24 Stunden aufgenommen werden. Um Gruppen von Eizellen in einem Bild zu erfassen, verwenden Sie ein Objektiv mit geringerer Vergrößerung, z. B. 10-fach.
8. Verwenden Sie Bildanalysesoftware, um die Zerstörung von Securin-gfp zu quantifizieren. Öffnen Sie die Bilder des GFP-Kanals. Beginnen Sie mit dem Zeitpunkt 1. Verwenden Sie in der bevorzugten Analysesoftware ein Auswahl- oder Formwerkzeug, um jede Eizelle zu markieren und eine Region of Interest (ROI) für jede Zelle zu generieren.
   1. Verwenden Sie den gleichen ROI, um einen Hintergrundbereich auszuwählen, der später subtrahiert werden soll. Messen Sie die GFP-Pixelintensität in jedem ROI.
9. Messen Sie anhand der ROIs für jede in Schritt 3.8 generierte Eizelle die GFP-Intensität in allen Zeitpunkten.
   HINWEIS: In einigen Softwareprogrammen können Sie auf der Registerkarte "Analysieren" die Funktion "Messen" auswählen.
   1. Fahren Sie dann mit dem nächsten Zeitrahmen fort und wiederholen Sie diesen Vorgang, um die Intensität des GFP in jedem Zeitrahmen zu messen. Subtrahieren Sie abschließend für jeden GFP-Wert die Messung des ROI im Hintergrund, die in Schritt 3.8 ausgewählt wurde. Diese Analyse liefert einen Wert für die Securin-gfp-Intensität für jede Eizelle zu jedem Zeitpunkt.
10. Extrahieren Sie verschiedene Parameter aus dem Muster der Securin-Zerstörung: (a) der Zeitpunkt, zu dem der Securin-gfp-Abbau begann. Dies gibt an, wann die SAC-Stummschaltung begonnen hat. b) die Zeit des Securin-gfp-Mindestsignals. Dies zeigt an, wann die SAC-Dämpfung unter einen Schwellenwert gefallen ist, um eine hohe APC/C-Aktivierung und eine vollständige Securin-GFP-Degradation zu ermöglichen. c) die Vernichtungsrate von Securin-gfp¹⁹. Dies gibt Aufschluss darüber, wie schnell die SAC-Aktivität unter einen Schwellenwert für die APC/C-Aktivierung und den Abbau von Securin-GFP fällt.

4. Rekrutierung von MAD2 an Kinetochoren durch Immunfluoreszenz während der meiotischen Reifung

ANMERKUNG: Informationen zur Entnahme und Reifung von Eizellen finden Sie im zuvor veröffentlichten Bericht¹².

1. Teilen Sie die Eizellen in drei Gruppen auf. Übertragen Sie jede Gruppe von Eizellen in 100 μL Tropfen milrinonfreies Nährmedium. Decken Sie die Tropfen mit Mineralöl ab und legen Sie sie für 3 h, 5 h und 7 h in den Inkubator (37 °C, 5 %_CO2 und 80 % Luftfeuchtigkeit), um die frühe Prometaphase I, die späte Prometaphase I bzw. die Metaphase I zu erreichen.
   HINWEIS: Legen Sie jeden Zeitpunkt in eine andere Schale, um zu vermeiden, dass dieselbe Schale mehrmals aus dem Inkubator genommen wird, was sich auf den regelmäßigen Zeitpunkt der meiotischen Reifung auswirkt.
2. Zu den zugewiesenen Zeitpunkten werden die Eizellen fixiert, indem sie in 500 μL Tropfen von 2% PFA in 1x PHEM-Puffer für 20 min bei Raumtemperatur überführt werden, wobei eine 9-Well-Glasschale verwendet wird, wie zuvor beschrieben²⁰. Dann werden die Zellen in eine saubere Vertiefung überführt, die einen 500-μl-Tropfen Blocklösung enthält (PBS + 0,3% BSA + 0,01% Tween-20 + 0,02%_NaN3).
   HINWEIS: PHEM-Zusammensetzung: 60 mM ROHRE; 25 mM HEPES; 10 mM EGTA; und 2 mM_MgCl2.
   HINWEIS: Man kann an dieser Stelle anhalten und die Eizellen in Blocklösung in der 9-Well-Platte bei 4 °C lagern, bis der Zeitpunkt der Immunfluoreszenz günstig ist.
3. Um den MAD2-Nachweis fortzusetzen, werden die Eizellen in eine saubere Vertiefung überführt, die einen 500-μl-Tropfen Permeabilisierungslösung enthält (PBS + 0,3% BSA + 0,1% TritonX-100 + 0,02% NaN₃). Inkubieren Sie für 20 Minuten bei Raumtemperatur, und dann übertragen Sie die Zellen in eine neue Vertiefung mit Blocklösung und inkubieren Sie für 10 Minuten.
4. Verwenden Sie für die restlichen Immunfluoreszenzschritte einen 96-Well-Schalendeckel mit Vertiefungen, wie zuvor beschrieben²⁰. Verwenden Sie eine befeuchtete dunkle Kammer, um Lichteinwirkung und Verdunstung zu vermeiden. Die Eizellen werden in einen 30 μl Tropfen Blocklösung mit Anti-MAD2-Antikörper (1:1000, Kaninchen) und Anti-Zentromer-Antikörper (ACA) (1:30, menschlich) überführt (siehe Materialtabelle) und 2 h bei Raumtemperatur inkubiert.
   HINWEIS: Der 96-Well-Schalendeckel bietet Platz für die gleichzeitige Verarbeitung mehrerer Proteine und Gruppen.
5. Um überschüssige Primärantikörper zu waschen, geben Sie die Zellen in einen 30 μL Tropfen 1x PHEM-Puffer, ergänzt mit 0,5% Triton, und inkubieren Sie für 10 min in der befeuchteten Kammer. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zwei weitere Male.
6. Führen Sie die vierte Wäsche durch, überführen Sie die Zellen in einen 30-μL-Tropfen 1x PHEM-Puffer ohne 0,5% 1x Triton und inkubieren Sie für 10 Minuten.
7. Die Zellen werden in einen 30 μl Tropfen Blocklösung gegeben, der sekundäre Antikörper wie Anti-Human-633 (1:200) und Anti-Kaninchen-568 (1:200) enthält (siehe Materialtabelle) und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubieren.
   HINWEIS: Wählen Sie die Kombination von Fluorophoren basierend auf Ihren Mikroskoplasern oder -filtern.
8. Um überschüssige sekundäre Antikörper zu waschen, wiederholen Sie die Schritte 4.5-4.6.
9. Um die Zellen auf dem Objektträger zu montieren, geben Sie die Zellen in einen 10-μl-Tropfen eines DAPI-haltigen Trägermediums (0,1 mg/ml) (siehe Materialtabelle). Fügen Sie kleine Punkte Vaseline in jede Ecke des Deckglases hinzu, legen Sie sie vorsichtig auf den Tropfen des Montagemediums und drücken Sie langsam, um sie zu verteilen. Verwenden Sie durchsichtigen Nagellack, um das Deckglas mit dem Objektträger zu versiegeln. Eine detailliertere Beschreibung des Montageprozesses finden Sie unter Referenz²⁰.
10. Bilden Sie Kinetochoren mit einem konfokalen Mikroskop (siehe Materialtabelle) ab, das mit einem 40-fachen oder 63-fachen Objektiv ausgestattet ist. Bestimmen Sie anhand des ACA-Signals den Z-Bereich, der die Bildgebung des gesamten Chromosomenbereichs ermöglicht.
    HINWEIS: Ein optischer Zoom von 4,0 und eine Z-Schrittweite von 0,5 μm können bei einigen Bildgebungssystemen verwendet werden. Diese Parameter können von System zu System variieren und müssen optimiert werden.
11. Analysieren Sie die MAD2-Intensität bei Kinetochören mit Hilfe von Bildanalysesoftware. Erstellen Sie eine maximale Z-Stack-Projektion und teilen Sie dann die Kanäle auf.
12. Erstellen Sie zunächst eine Maske mit dem ACA-Kanal, indem Sie den ACA-Kanal auswählen, um einen Schwellenwert festzulegen, der alle Kinetochor-Signale identifiziert. Gehen Sie auf die Registerkarte Bearbeiten und erstellen Sie eine Auswahl. Erstellen Sie dann mit dieser Auswahl einen ROI.
13. Wählen Sie den MAD2-Kanal aus und rufen Sie die in Schritt 4.12 erstellte Auswahl auf. Wählen Sie eine Schwellwertmethode, die sich besser an das MAD2-Signal anpasst. Messen Sie die Intensität.
    HINWEIS: Wählen Sie die Schwellenwertmethode in der Kontrollbehandlung und halten Sie sie konstant, wenn Sie verschiedene Behandlungen analysieren.
14. Um Berechnungen der relativen Pixelintensität durchzuführen, dividieren Sie die Intensität jeder Zelle durch die durchschnittliche Intensität der WT-Eizellen im Experiment.

Ergebnisse

Bewertung des SAC-Ansprechens durch Nocodazol-Behandlung
Der Zweck dieses Experiments ist es, die SAC-Aktivierung und -Stärke zu bewerten. Durch die Verwendung von Nocodazol zur Depolymerisation von Spindelmikrotubuli werden alle Kinetochoren gelöst, was zu einem SAC-vermittelten Zellzyklusstillstand führt. Im vorliegenden Bildgebungssystem extrudierten DMSO-behandelte Kontroll-Eizellen etwa 14 Stunden nach der Freisetzung von Milrinon einen Polkörper (Abbildung 1, ob...

Diskussion

Der Kontrollpunkt für die Spindelmontage ist ein kritischer Kontrollmechanismus während der Zellteilung, der Fehler bei der Chromosomentrennung verhindern soll. Dadurch hat die Zelle genügend Zeit, um unsachgemäße KT-MT-Anhänge zu korrigieren. Die Meiose in Eizellen ist ein fehleranfälliger Prozess, bei dem der größte Teil der Chromosomentrennung während der Meiose I auftritt, was zur Bildung von aneuploiden Eiern führt, die die Hauptursache für frühe Fehlgeburten und Unfruchtbarkeit beim Menschen sind

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A4503
DAPI	Life Technologies	D1306
Dimethyl-sulfoxide (DMSO)	Sigma	D5879
Donkey-anti-rabbit-Alexa-568	Life Technologies	A10042
EVOS FL Auto Imaging System	Life Technologies		Fluorescence microscope
EVOS Onstage Incubator	Life Technologies		Incubator chamber
Glass Bottom 96- well plates N 1.5 uncoated	MatTek Corporation	P96G-1.5-5-F
goat-anti-human-Alexa-633	Life Technologies	A21091
HEPES	Sigma	H3537
Human anti-ACA	Antibodies Incorporated	15-234	Dilution 1/30
ImageJ	NIH
KCl	Sigma	P5405
KH2PO4	Sigma	P5655
Leica SP8 equipped with a 63×, 1.40 NA oil immersion objective	Leica
MgSO4·7H20	Sigma	M7774
Milrinone	Sigma	M4659
Na2HPO4	Sigma	S2429
NaCl	Sigma	S5886
NaN3	Sigma	S2002
Nocodazole	Sigma	M1404
Paraformaldhyde (PFA)	Sigma	P6148
PIPES	Sigma	P6757
Rabbit anti- MAD2	Biolegend	924601	Dilution 1/1000; previously Covance #PRB-452C
Reversine	Cayman Chemical	10004412
Triton-X	Sigma	274348
Tween-20	Sigma	X100
Vectashield	Vector laboratories	H-1000