Lumican-Extraktion aus Amnionmembran und Bestimmung ihrer Lagertemperatur

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Extraktion von Lumican aus der Amnionmembran (AM) und deren Lagerbedingungen als AM-Extrakt (AME) bei -20 °C, 4 °C und Raumtemperatur (RT) für 6, 12, 20 und 32 Tage, um seine Proteine und Lumican-Konzentration zu quantifizieren.

Zusammenfassung

Lumican ist ein kleines leucinreiches Proteoglykan in der menschlichen Amnionmembran (AM), das die Hornhautepithelisierung und die Organisation von Kollagenfasern fördert und die Transparenz der Hornhaut aufrechterhält. In der vorliegenden Arbeit wird eine Methode zur Proteinextraktion aus AM vorgeschlagen, um Lumican zu erhalten. Zusätzlich wird die Stabilität von Lumican im AM-Extrakt (AME) bewertet, der bei verschiedenen Temperaturen und Zeiträumen gelagert wird. 100 mg AM wurden aufgetaut und mechanisch deepithelialisiert. Das deepithelialisierte AM wurde eingefroren und zerkleinert, bis ein feines Pulver erhalten wurde, das mit 2,5 ml Kochsalzpuffer mit Proteaseinhibitoren gelöst und zur Proteinextraktion zentrifugiert wurde. Der Überstand wurde gesammelt und bei -20 °C, 4 °C und Raumtemperatur (RT) für 6, 12, 20 und 32 Tage gelagert. Danach wurde Lumican in jedem AME quantifiziert. Diese Technik ermöglicht ein zugängliches und erwerbbares Protokoll für die Lumican-Extraktion aus AM. Die Lumican-Konzentration wurde durch die Lagerzeit und die Temperaturbedingungen beeinflusst. Lumican in der AME von 12 Tagen Lagerung bei -20 °C und 4 °C war signifikant höher als andere AME. Diese Lumican-Extraktion könnte für die Entwicklung von Behandlungen und pharmazeutischen Lösungen nützlich sein. Weitere Studien sind erforderlich, um die Verwendung von AME Lumican bei der Reepithelialisierung und Wundheilung zu bestimmen.

Einleitung

Eine der am häufigsten verwendeten Behandlungen für Hornhauterkrankungen ist die Amnionmembrantransplantation; In den letzten Jahren sind jedoch neue Vorschläge für die Verwendung verschiedener Bestandteile des Fruchtwassergewebes als alternative und adjuvante Behandlungen aufgetaucht. Zu den am meisten untersuchten Komponenten von AM gehören diejenigen, die aus dem AM-Extrakt (AME) 1,2,3,4,5,6,7 gewonnen werden. AM enthält mehrere löslic....

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Protokoll

Alle experimentellen Verfahren wurden vom Institutional Review Board genehmigt (Projekt Nr. CEI-2020/06/04). Die AM wurde von der Amnionbank Instituto de Oftalmologia Conde de Valenciana (von identifizierten menschlichen Probanden) erhalten, die wie von Chávez-García et ^al.17 beschrieben hergestellt wird.

1. Herstellung des Amnionmembranextrakts

1. Erhalten Sie 100 mg AM von der Amnionbank.
   HINWEIS: Laut einem früheren Bericht sezernieren 50 mg AM insgesamt 10 ng / ml Lumican¹⁴. Um eine höhere Konzentration von Lumic zu erhalten, verwenden Sie 100 mg AM, was einer Ge....

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Ergebnisse

Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) angegeben. Es wurden studentische t-Tests und Varianzanalysen (ANOVA) durchgeführt. P-Werte < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen. Die statistische Auswertung erfolgte mit Hilfe von Statistiksoftware (siehe Materialtabelle).

Die Gesamtproteinmenge in der AME wurde durch Zeit und Lagerbedingungen beeinflusst. Die basale Proteinkonzentration war bei allen AME ähnlich; der Bereich de.......

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Diskussion

In dieser Studie wurde das Vorhandensein von Lumican im AME und seine direkte Korrelation mit seiner Stabilität unter verschiedenen Lagerbedingungen analysiert. Interessanterweise stieg die Proteinkonzentration nach der Lagerung an, wenn die Gesamtproteinkonzentration in AME quantifiziert wurde. Es gibt Hinweise auf drei Mechanismen, die die Proteinkonzentration in gefrorenen Lagern verändern könnten: kalte Denaturierung, die gefrorene Konzentration gelöster Stoffe und eisinduzierte teilweise Entfaltung der Proteinst.......

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 N H2SO4 stop solution	R&D Systems	DY994
100 μL micropipette	Eppendorf
1000 μL micropipette	Eppendorf
15 mm Petri dish	Symlaboratorios
18 G Needle (1.2 mm x 40 mm)	BD Becton Dickinson	305211
2 mL microcentrifuge tube	Eppendorf	Z606340
20 mL plastic syringe	BD Becton Dickinson	302562
20 μL micropipette	Eppendorf
20-200 μL micropipette	Eppendorf
5 mL microcentrifuge tube	Eppendorf	30119401
96-well microplate	SARSTEDT	821581
Aluminum foil	N/A	N/A
Amniotic membrane	Instituto de Oftalmologia Conde de Valenciana Amnion Bank		100 mg
Balanced salt solution	Bausch + Lomb	BSS-403802
Beaker	N/A	N/A
BioRender	BioRender		figures design
Compact Rocker	BioRad	970822DD	Mod. 5202SD-BIO
complete, EDTA-free, Protease inhibitor cocktail tablets	Roche	11 873 580 001	Protease Inhibitor
Daiggner vortex Genie 2	A.Daigger & Co. , INC	22220A
Dispase II	Gibco	17105-041
ELISA plate spectrometer	Thermo Labsystems	35401106	Multiscan
Freezer
GraphPad Prism	GraphPad Software, Inc	version 9	statistical analysis and graphic program
Human lumican DuoSet ELISA kit	R&D Systems	DY2846-05	includes human Lumican capture antibody
Incubator	Forma Scientific	3326 S/N 36481-7002
Inverted light Microscope	Olympus	6A13921	to confirm de-epithelialization  Mod.CK2
Laminar flow hood	Forma Scientific	14753-567	Mod.1184
Liquid nitrogen	N/A	N/A
Mortar	N/A	N/A
Multi-channel pipettor	Eppendorf
Nitrogen Tank	Thermo Scientific		Mod. Biocan 20
Paper towels	N/A	N/A
Phosphate-buffered saline	R&D Systems	DY006
Pierce Modified Lowry Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23240
Plate sealers	R&D Systems	DY992
Reagent diluent	R&D Systems	DY995	1% BSA in PBS, pH 7.2-7.4, 0.2 μm filtered
Refrigerated centrifuge	centurion scientific Ltd	15877	Mod. K2015R
Rubber policeman cell scraper	NEST	710001	for mechanical de-epithelialization
Scalpel knife	Braun	BB521	No. 10 or 21
Streptavidin-HRP 40-fold concentrated	R&D Systems	part 893975
Substrate tetramethylbenzidine (TMB) solution	R&D Systems	DY999
Toothed tweezers	Invent Germany	6b	inox
Ultrapure water	PISA
Wash buffer	R&D Systems	WA126	0.05% Tween 20 in PBS, pH 7.2-7.4