Live-Cell-Bildgebung intakter Ex-vivo-Globen mit einem neuartigen 3D-gedruckten Halter

Zusammenfassung

Die vorliegende Arbeit beschreibt ein neuartiges experimentelles Protokoll, das einen 3D-gedruckten Halter verwendet, um hochauflösende Lebendzellbildgebung von enukleierten Globen zu ermöglichen. Durch dieses Protokoll kann die zelluläre Kalziumsignalaktivität in verwundetem Hornhautepithel von ex vivo Globen in Echtzeit beobachtet werden.

Zusammenfassung

Die Hornhautepithelwundheilung ist ein Migrationsprozess, der durch die Aktivierung purinerger Rezeptoren initiiert wird, die auf Epithelzellen exprimiert werden. Diese Aktivierung führt zu Kalziummobilisierungsereignissen, die sich von Zelle zu Zelle ausbreiten, die für die Initiierung der Zellmotilität in das Wundbett unerlässlich sind und eine effiziente Wundheilung fördern. Das Trinkaus-Randall-Labor hat eine Methodik entwickelt, um die Hornhautwundheilungsreaktion in ex vivo Mauskugeln in Echtzeit abzubilden. Dieser Ansatz beinhaltet die Enukleierung eines intakten Globus aus einer Maus, die gemäß etablierten Protokollen eingeschläfert wurde, und die sofortige Inkubation des Globus mit einem Kalziumindikatorfarbstoff. Ein Gegenfleck, der andere Merkmale der Zelle färbt, kann in diesem Stadium angewendet werden, um die Bildgebung zu unterstützen und zelluläre Orientierungspunkte zu zeigen. Das Protokoll funktionierte gut mit mehreren verschiedenen lebenden Zellfarbstoffen, die für die Gegenfärbung verwendet wurden, einschließlich SiR-Aktin zur Färbung von Aktin und tiefroter Plasmamembranfärbung zur Färbung der Zellmembran. Um die Reaktion auf eine Wunde zu untersuchen, wird das Hornhautepithel mit einer 25-G-Nadel verletzt und die Kugeln in einen 3D-gedruckten Halter gelegt. Die Abmessungen des 3D-gedruckten Halters sind kalibriert, um die Immobilisierung des Globus während der gesamten Dauer des Experiments zu gewährleisten, und können modifiziert werden, um Augen unterschiedlicher Größe aufzunehmen. Die Live-Zellbildgebung der Wundantwort wird kontinuierlich in verschiedenen Tiefen des Gewebes im Laufe der Zeit mittels konfokaler Mikroskopie durchgeführt. Dieses Protokoll ermöglicht es uns, hochauflösende Bilder in Publikationsqualität mit einem 20-fachen Luftobjektiv auf einem konfokalen Mikroskop zu erzeugen. Für dieses Protokoll können auch andere Ziele verwendet werden. Es stellt eine signifikante Verbesserung der Qualität der Lebendzellbildgebung in ex vivo Mauskugeln dar und ermöglicht die Identifizierung von Nerven und Epithel.

Einleitung

Hornhaut
Die Hornhaut ist eine klare, avaskuläre Struktur, die die vordere Oberfläche des Auges bedeckt, Licht bricht, um das Sehen zu ermöglichen und das Innere des Auges vor Schäden zu schützen. Da die Hornhaut der Umwelt ausgesetzt ist, ist sie anfällig für Schäden sowohl durch mechanische Ursachen (Kratzen) als auch durch Infektionen. Eine Hornhautverletzung bei einem ansonsten gesunden Patienten heilt typischerweise innerhalb von 1-3 Tagen. Bei Patienten mit Grunderkrankungen wie limbalem Stammzellmangel und Typ-II-Diabetes kann der Hornhautwundheilungsprozess jedoch stark verlängert werden¹. Da die Hornhaut stark innerviert ist, sind diese nicht heilenden Hornhautgeschwüre und wiederkehrenden Hornhauterosionen sehr schmerzhaft und verringern die Lebensqualität der Patienten, die sie erleben, stark¹.

Zellsignalisierung
Wenn eine ansonsten gesunde Hornhaut verletzt wird, gehen Kalziumsignalereignisse in den an die Wunde angrenzenden Zellen vor und veranlassen eine zelluläre Migration in das Wundbett, wo sie die Verletzung ohne das Risiko einer Narbenbildung schließen ^2,3. Diese Signalereignisse wurden in Hornhautepithelzellkulturmodellen mit Lebendzellbildgebung gut charakterisiert². Vorläufige Experimente zeigen signifikant mehr Kalziumsignale nach Verletzungen in nicht-diabetischen Zellen im Vergleich zu diabetischen Zellen. Die Charakterisierung der Zellsignalereignisse in ex vivo Globen hat sich jedoch als technische Herausforderung erwiesen.

Bildgebung lebender Zellen
Frühere Studien haben erfolgreich Kalziumsignalereignisse aus in vitro Zellkulturmodellen der Hornhautwundheilung aufgezeichnet ^4,5,6. Die Entwicklung einer Methodik zur Erzeugung qualitativ hochwertiger Bilder dieser Signalereignisse in ex vivo Gewebe ist von großem Interesse, da sie die Untersuchung dieser Ereignisse in einem komplexeren und lebensechten System ermöglichen würde. Frühere Ansätze beinhalteten die Dissektion der Hornhaut gefolgt von einer Immobilisierung in einem UV-induzierten PEG-Gel ^7,8,9. Die Immobilisierung ist ein wesentlicher, aber auch herausfordernder Schritt bei der Arbeit mit lebendem Gewebe, da es während des gesamten Experiments lebensfähig und hydratisiert bleiben muss. Außerdem darf die Ruhigstellung das Gewebe nicht schädigen. Während die PEG-Lösung das Gewebe immobilisierte, waren Auflösung und Qualität der erzeugten Bilder nicht konsistent. Daher wurden 3D-gedruckte Halter entwickelt, um intakte Kugeln zu immobilisieren, um qualitativ hochwertigere Bilder mit geringerem Risiko von Gewebeschäden zu erzeugen.

Der Ansatz
Ein einzigartiger 3D-gedruckter Halter wurde entwickelt, um intakte Ex-vivo-Globen für die Bildgebung lebender Zellen zu immobilisieren. Dieser Halter verhindert Schäden durch zwei Hauptquellen: Er ermöglicht die Abbildung eines enukleierten Globus, ohne dass die Hornhaut seziert werden muss, und er eliminiert die Exposition gegenüber UV-Licht. Ohne diese Schadensquellen stellten die erhaltenen Bilder die Reaktion auf die experimentell durchgeführten Kratzverletzungen genauer dar. Darüber hinaus wurde der 3D-gedruckte Halter auf die genauen Abmessungen des Mausauges kalibriert. Dies führte zu einer viel besseren Passform als die Immobilisierung in PEG-Lösung, was aufgrund der verminderten Gewebebewegung zu einem qualitativ hochwertigeren Bild bei Zielen mit geringerer Leistung führte. Eine an der Oberseite des Halters angebrachte Abdeckstange stellt sicher, dass der Globus während der gesamten Dauer des Experiments unbeweglich bleibt und dass es keine Verschiebung des Globus gibt, wenn Wachstumsmedien aufgetragen werden, um die Hydratation und Lebensfähigkeit zu erhalten. Die Möglichkeit, den Halter auf genaue Abmessungen zu drucken, ermöglicht es uns auch, eine optimale Passform für Mausaugen unterschiedlicher Größe aufgrund des Alters oder des Krankheitsstatus zu generieren. Diese Technologie kann breiter angewendet werden, um Halter für die Augen verschiedener Arten basierend auf ihren Abmessungen zu entwickeln.

Protokoll

Die Verfahren mit Tieren wurden von der Association for Research in Vision and Ophthalmology for the Use of Animals in Ophthalmic Care and Vision Research und dem IACUC-Protokoll der Boston University (201800302) genehmigt.

1. Gestaltung der 3D-gedruckten Halter und der Abdeckleiste

1. Entwerfen Sie die 3D-gedruckten Halter und die Abdeckleiste unter Berücksichtigung des durchschnittlichen Durchmessers von Mauskugeln und drucken Sie das Design in 3D (Abbildung 1A, B).
2. Halten Sie den Durchmesser der Innenwand des Halters etwas größer als den durchschnittlichen Durchmesser des Globus, um die unterschiedlichen Größen einzelner Mäuse zu berücksichtigen. Halten Sie die Höhe des Halters bei etwa der Hälfte des Globusdurchmessers, um einen festen Sitz des Globus zu gewährleisten, wenn er durch die 3D-gedruckte Abdeckleiste gesichert wird.
3. Passen Sie die Halterabdeckung auf die Länge des Außendurchmessers des Halters mit einer Breite von 1/4 bis 1/2 des Halterdurchmessers an. Die Abdeckleiste ist so dimensioniert, dass sie den Zugang zum Globus ermöglicht, wenn sie in der Halterung für die Hydratation und die Entfernung des Auges am Ende des Experiments befestigt ist.
4. Drucken Sie die Halterung und die Abdeckleiste.

2. Probenentnahme

1. Euthanisieren Sie Mäuse (männliche C57BL / 6-Mäuse im Alter von 9-12 Wochen und 27 Wochen wurden für diese Studie verwendet) unter Verwendung etablierter Protokolle in Übereinstimmung mit institutionellen Richtlinien. Führen Sie für dieses Protokoll Euthanasie mit Kohlendioxid durch, gefolgt von Enthauptung.
2. Entfernen Sie den Mauskopf und legen Sie ihn sofort auf Eis, um die Lebensfähigkeit des Gewebes zu erhalten. Enukleieren Sie die Kugeln mit Dissektionswerkzeugen und verhindern Sie gleichzeitig Gewebeschäden.
3. Proptosen Sie den Globus mit einer Pinzette. Clippen Sie den Sehnerv mit einer Dissektionsschere direkt unter der Stelle, an der er von der Pinzette gehalten wird.
   HINWEIS: Für weitere Vorsichtsmaßnahmen führen Sie die folgenden Schritte in einer Laminar-Flow-Haube durch.
4. Die Kugeln werden in 2 ml Medium in einer p35-Zellkulturschale mit Kalziumindikator und/oder Zellmembranfärbung für 1 h in einem 37 °C, 5%_{CO2-Inkubator} bei schlechten Lichtverhältnissen inkubiert. Stellen Sie sicher, dass die Kugeln in das Färbemedium eingetaucht sind, um eine gleichmäßige Färbung zu erzielen.
   1. Verwenden Sie für die hier durchgeführten Experimente den Calciumindikator Fluo4-AM (1:100)2 und die Zellmembran-Gegenfärbung, tiefrote Plasmamembranfärbung (1:10.000)2, mit einer Endkonzentration von 1% (v/v) DMSO und 0,1% (w/v) Pluronsäure in ² ml keratinozytenserumfreies Medium (KSFM) mit den folgenden Wachstumsergänzungen: 25 μg/ml Rinderhypophysenextrakt, 0,02 nM epidermaler Wachstumsfaktor, 0,3 mM CaCl₂ und Penicillin-Streptomycin (100 Einheiten/ml bzw. 100 μg/ml).
      HINWEIS: Die Inkubationsbedingungen und -zeiten variieren je nach Kalziumindikator, Gewebetyp und Probenvolumen. Bei der Verwendung von Pluronsäure ist Vorsicht geboten, da sie das Gewebe durchlässig macht. Dieses Protokoll fordert 10% Pluronsäure. Niedrigere Konzentrationen von Pluronsäure wurden experimentell als unwirksam eingestuft, und höhere Konzentrationen riskieren Schäden am Gewebe.

3. Vorbereitung der Probenhalter

1. Kleben Sie die Halter auf ein sauberes Glasboden-Deckglas mit Kleber, der zuvor nicht verwendet wurde. Der in diesem Protokoll verwendete Klebstoff stammt aus Einwegbehältern, um die Sterilität zu gewährleisten, und jedes Mal wird ein neuer, ungeöffneter Behälter verwendet.
2. Waschen Sie den Halter in 70% Ethanol. Kleben Sie Kleber auf den Halter und kleben Sie den Halter auf das Glasbodendeckglas. Stellen Sie sicher, dass sich kein Klebstoff im inneren Bereich des Halters befindet, da Klebstoff fluoreszieren kann, was die Bildgebung erschwert.
3. Warten Sie, bis der Klebstoff erstarrt. Vergewissern Sie sich, dass der Halter gegen das Deckglas gesichert ist.
   HINWEIS: Für die in diesem Manuskript vorgestellten Experimente wurden P35-Zellplatten mit Glasbodendeckgläsern verwendet. Andere Glasbodenobjektträger und/oder -platten können je nach Bedarf des Experiments ersetzt werden.

4. Verwundung der Augenkugeln

1. Entfernen Sie die Kugeln mit sterilen Pipetten aus der Färbelösung und achten Sie darauf, Gewebeschäden in der interessierenden Region zu vermeiden. Waschen Sie die Kugeln 5 Minuten lang bei Raumtemperatur mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung, um überschüssigen Fleck zu entfernen, und legen Sie die Kugeln für den Transport zum Mikroskop in das Medium.
2. Wunden Sie die Kugeln mit einer sterilen 25-G-Nadel in der interessierenden Region.
   1. Nehmen Sie die Kugel mit einer sterilen Pipette auf und halten Sie sie von der Rückseite des Auges. Dies hält den Globus stabil, verhindert das Rollen und ermöglicht konsistente Wunden. Mit diesem Setup befindet sich der Sehnerv in der Pipettendüse und die Hornhaut zeigt nach außen.
   2. Bei einer Kratzwunde bewegen Sie vorsichtig eine sterile 25 G-Nadel über die freiliegende Hornhaut. Bei einer Stichwunde drücken Sie die Nadel vorsichtig direkt in die zentrale Hornhaut. Stellen Sie sicher, dass die Wunde die Hornhaut nicht durchsticht.
      HINWEIS: Überspringen Sie diesen Schritt, wenn für das Experiment keine Wundreaktion oder eine verletzte Umgebung erforderlich ist. Frühere Studien haben gezeigt, dass sowohl Kratzwunden als auch Stichwunden an Maushornhäuten, die mit dieser Methode hergestellt wurden, sowohl im Durchmesser als auch in der Tiefe konsistent sind¹⁰. Die Bestätigung der Wunddimensionen zwischen unabhängigen Globen erfolgte mittels einer Region of Interest-Analyse.

5. Probenplatzierung auf dem Halter

1. Legen Sie die Hornhaut oder den limbalen Bereich auf das Deckglas im inneren Bereich des Halters und stabilisieren Sie sich mit der 3D-gedruckten Abdeckung (Abbildung 1C-H).
2. Vergewissern Sie sich, dass der Globus richtig positioniert ist und dass die gewünschte Stelle in Kontakt mit dem Glasdeckglas steht. Sobald die Kugel in die Halterung eingesetzt wurde, versuchen Sie nicht, die Kugel zu entfernen, da dies zu Gewebeschäden führen kann.
3. Kleben Sie die 3D-gedruckte Abdeckung mit Klebstoff auf den Halter, um die Stabilisierung zu gewährleisten. Stellen Sie sicher, dass die Abdeckleiste auf der Halterung und nicht auf dem Globus haftet.
   HINWEIS: Der abzubildende Bereich wird nach unten gelegt, da das Protokoll für die Verwendung auf einem inversen Mikroskop geschrieben wurde. Das Protokoll kann für aufrechte Mikroskope angepasst werden, indem Halter mit kleinerem Innenradius und das Entfernen der Abdeckleiste verwendet werden. Dies wird zu einer geringeren Stabilisierung des Globus führen.

6. Proben-Bildgebung

1. Schalten Sie das Mikroskop und die Klimakammer ein und überprüfen Sie, ob die Kammer befeuchtet ist. Stellen Sie die Klimakammer für die Dauer des Versuchs auf 35 °C und 5% CO₂ ein.
   HINWEIS: Mikroskope mit Klimakammern sind für dieses Verfahren vorzuziehen, um Austrocknung zu verhindern und den Globus auf optimalen Temperaturen zu halten, sind jedoch nicht erforderlich.
2. Legen Sie das Deckglas, den Halter und die stabilisierte Kugel auf den Mikroskoptisch innerhalb der Klimakammer und nehmen Sie es mit Live-Cell-Imaging-Techniken^{ab 9}.
3. Pipetten Sie zusätzliche Wachstumsmedien auf das Deckglas, um Austrocknung zu verhindern und die Lebensfähigkeit des Gewebes zu erhalten. Stellen Sie sicher, dass genügend Medium im Brunnen vorhanden ist, um den Globus im Halter abzudecken. Abhängig von der Dauer der Bildgebung fügen Sie bei Bedarf während des gesamten Experiments frisches Medium hinzu.
4. Beginnen Sie mit Experimenten mit Live-Cell-Imaging-Techniken und -Protokollen. Verwenden Sie Lasereinstellungen mit geringer Leistung, um das Gewebe zu erhalten und Gewebeschäden in Langzeitexperimenten zu verhindern. Verwenden Sie geeignete Objektive für lange Arbeitsabstände. Die Experimente in diesem Manuskript wurden mit einem 20x-Objektiv durchgeführt.
   HINWEIS: Die Laserleistung und -verstärkung, die experimentelle Dauer, der Ort und die Ebene der Bildgebung sind alle Variablen, die von den experimentellen Parametern abhängen. Bildgebende Experimente an intakten Globen mit einer Dauer von 1 h bis 4 h wurden in früheren Publikationen erfolgreich durchgeführt¹⁰.
5. Zeichnen Sie Daten im bevorzugten Dateiformat auf und speichern Sie sie. Die vom Mikroskop verwendete Software erzeugt .czi-Dateien für die Datenaufzeichnung.
6. Entsorgen Sie die Globen gemäß den institutionellen Standardprotokollen am Ende des Protokolls.

Ergebnisse

Dieses Protokoll wurde verwendet, um konsistent Daten und Bilder in Publikationsqualität zu erzeugen¹⁰. Die erhaltenen Bilder stellen eine deutliche Verbesserung im Vergleich zu früheren Ansätzen dar (Abbildung 2). Mit dem 3D-gedruckten Halter können Bilder in den Schichten der Hornhaut aufgenommen und die Kalziummobilisierung in verschiedenen Z-Ebenen beobachtet werden (Abbildung 3). Dieser Ansatz wurde verwendet, um die Zell-Zell-Si...

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt eine Lebendzellbildgebungstechnik, die einen 3D-gedruckten Halter verwendet, um intakte Tieraugen zu stabilisieren und zu immobilisieren. Es wurde entwickelt, um mehrere signifikante Nachteile zu umgehen, die mit früheren Live-Zellbildgebungsprotokollen von Ex-vivo-Hornhautgewebe erkannt wurden. Dieses Protokoll bietet viele Vorteile für die Lebendzellbildgebung intakter Kugeln. Es reduziert signifikant unnötige Gewebeschäden, die die Wundheilungsreaktion auf experimentell induzie...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.75 blue polylactic acid (PLA) plastic	Creality (Shenzen, China)	N/A	Material for holder
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm glass diameter, Poly-D-Lysine Coated	MatTek Corporation (Ashland, MA)	P35GC-1.5-14-C	Well for imaging.
Autodesk Fusion 360 software	Autodesk (San Rafael, CA).	N/A	Software used for printing the holders.
BD 25 G 7/8 sterile needles single use 100 needles/box	Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA)	305124	For experimentally-induced wounds to the globes
CellMask DeepRed	Invitrogen (Carlsbad, CA)	C10046	Cell membrane counterstain. Calcium indicator. 1:10,000 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid
Complete Home Super Glue	Walgreens (Deerfield, IL)	N/A	For attaching the holder to the imaging well
Ender 3 Pro 3D printer	Creality (Shenzen, China)	N/A	For printing the holder
FIJI/ImageJ	ImageJ (Bethesda, MD)	License Number: GPL2	Softwareused for confirming consistency of wound depth and diameter between independent globes using Region of Interest analysis
Fluo-4	Invitrogen (Carlsbad, CA)	F14201	Calcium indicator. 1:100 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid
Keratinocyte Serum-Free Medium	Gibco (Waltham, MA)	17005042	25 mg/mL bovine pituitary extract, 0.02 nM EGF, 0.3 mM CaCl2, and penicillin-streptomycin (100 units/mL, 100 µg/mL, respectively) added to medium
Phophate-Buffered Saline (PBS)	Corning, Medlabtech (Manassas, VA)	21-040-CV	Used to wash excess stain off of corneas before imaging
Zeiss Confocal 880 Microscope with AiryScan	Zeiss (Thornwood, NY)	N/A	20x magnification objective was used