Magnetresonanzgesteuerte, hochintensive, fokussierte, ultraschallerzeugte Hyperthermie: eine praktikable Behandlungsmethode in einem murinen Rhabdomyosarkommodell

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll vorgestellt, um kontrollierte Hyperthermie, die durch magnetresonanzgesteuerten, hochintensiven fokussierten Ultraschall erzeugt wird, zu verwenden, um die Wirkstofffreisetzung von temperaturempfindlichen Liposomen in einem Rhabdomyosarkom-Mausmodell auszulösen.

Zusammenfassung

Der magnetresonanzgesteuerte hochintensive fokussierte Ultraschall (MRgHIFU) ist eine etablierte Methode zur Erzeugung einer lokalisierten Hyperthermie. Aufgrund der Echtzeit-Bildgebung und der akustischen Energiemodulation ermöglicht diese Modalität eine präzise Temperaturregelung innerhalb eines definierten Bereichs. Mit dieser nicht-invasiven, nichtionisierenden Technologie werden viele thermische Anwendungen erforscht, wie z. B. die Erzeugung von Hyperthermie, um Medikamente aus thermosensitiven liposomalen Trägern freizusetzen. Zu diesen Medikamenten können Chemotherapien wie Doxorubicin gehören, bei denen aufgrund der dosisbegrenzenden systemischen Nebenwirkungen, nämlich der Kardiotoxizität, eine gezielte Freisetzung erwünscht ist. Doxorubicin ist eine tragende Säule für die Behandlung einer Vielzahl von bösartigen Tumoren und wird häufig bei rezidivierendem oder rezidivierendem Rhabdomyosarkom (RMS) eingesetzt. RMS ist der häufigste extrakranielle Tumor des soliden Weichgewebes bei Kindern und jungen Erwachsenen. Trotz aggressiver, multimodaler Therapie sind die Überlebensraten des RMS in den letzten 30 Jahren gleich geblieben. Um eine Lösung für diesen ungedeckten Bedarf zu finden, wurde ein experimentelles Protokoll entwickelt, um die Freisetzung von thermosensitivem liposomalem Doxorubicin (TLD) in einem immunkompetenten, syngenen RMS-Mausmodell zu untersuchen, das MRgHIFU als Quelle der Hyperthermie für die Wirkstofffreisetzung verwendet.

Einleitung

Das Rhabdomyosarkom (RMS) ist ein Skelettmuskeltumor, der am häufigsten bei Kindern und jungen Erwachsenen auftritt¹. Lokalisierte Erkrankungen werden oft mit einer multimodalen Behandlung behandelt, einschließlich Chemotherapie, ionisierender Strahlung und Operation. Der Einsatz von Multi-Medikamenten-Chemotherapien ist bei pädiatrischen Patienten häufiger anzutreffen und hat im Vergleich zu ihren erwachsenen Kollegen bessere Ergebnisse^{erzielt 2}; Trotz laufender Forschungsbemühungen liegt die 5-Jahres-Überlebensrate bei der aggressivsten Form der Krankheit jedoch nach wie vor bei etwa 30 % ^3,4. Die Standardtherapie der Chemotherapie ist ein Multidrug-Schema, das Vincristin, Cyclophosphamid und Actinomycin D umfasst. Bei rezidivierender oder rezidivierender Erkrankung werden alternative Chemotherapien eingesetzt, darunter Standard-Doxorubicin (FD) und Ifosfamid¹. Während alle diese Chemotherapien systemische Toxizitäten aufweisen, erzwingt die Kardiotoxizität von Doxorubicin eine lebenslange Dosisbegrenzung^{von 5-7}. Um die Menge des an den Tumor abgegebenen Arzneimittels zu erhöhen und die systemische Toxizität zu minimieren, wurden alternative Formulierungen entwickelt, einschließlich liposomaler Verkapselung. Dabei kann es sich um nicht-thermosensitives Doxorubicin handeln, das für die Behandlung von Brustkrebs und hepatozellulärem Karzinom zugelassen ist, oder um thermosensitives Doxorubicin, für das klinische Studien laufen 8,9,10,11,12,13. Alternative Methoden zur Verabreichung liposomal verkapselter Arzneimittel wie multivesikuläre Liposomen und Liganden-gerichtete Liposomen wurden evaluiert und sind vielversprechend für die Behandlung von Tumoren⁹. In dieser Studie hat die Zugabe von Wärme multifaktorielle Auswirkungen, einschließlich der Wirkstofffreisetzung¹⁴. Die Kombination von Hyperthermie (HT), die mit magnetresonanzgesteuertem hochintensivem fokussiertem Ultraschall (MRgHIFU) und thermosensitivem liposomalem Doxorubicin (TLD) erzeugt wird, ist ein neuartiger multimodaler therapeutischer Ansatz für den Einsatz dieses toxischen, aber wirksamen Medikaments zur Behandlung von RMS, während gleichzeitig die dosislimitierende Toxizität minimiert und möglicherweise die Immunantwort auf den Tumor erhöht wird.

Doxorubicin wird bei Temperaturen von >39 °C schnell aus TLD freigesetzt, was weit über der durchschnittlichen menschlichen Körpertemperatur von 37 °C liegt, aber nicht hoch genug ist, um Gewebeschäden oder Ablation zu verursachen. Dies beginnt bei 43 °C, tritt aber schneller auf, wenn sich die Temperaturen 60 °C nähern¹⁵. Zur Erzeugung von HT in vivo wurden verschiedene Methoden eingesetzt, darunter Laser, Mikrowellen, Radiofrequenzablation und fokussierter Ultraschall, von denen viele invasive Erhitzungsmethoden sind¹⁶. MRgHIFU ist eine nicht-invasive, nichtionisierende Heizmethode, die eine präzise Temperatureinstellung innerhalb des Zielgewebes in situ ermöglicht. Die Magnetresonanztomographie (MR) bietet eine Echtzeit-Bildgebung, bei der Computersoftware verwendet werden kann, um eine thermometrische Messung des Gewebes während der gesamten Behandlung zu berechnen. Anschließend können diese Daten verwendet werden, um die Ultraschalltherapie in Echtzeit zu steuern, um einen gewünschten Temperatursollwert¹⁷ zu erreichen und zu halten. MRgHIFU wurde in verschiedenen Gewebetypen getestet und kann für eine Vielzahl von Temperaturbehandlungen eingesetzt werden, von der leichten HT bis zur Ablation, sowie klinisch zur erfolgreichen Behandlung schmerzhafter Knochenmetastasen¹⁸. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass HT Tumorzytotoxizität verursacht, die Proteinexpression moduliert und die Immunantwort in der Tumormikroumgebung verändert 19,20,21,22. In einer Studie wurde eine milde HT mit TLD, gefolgt von einer Ablation mit MRgHIFU, in einem synergetischen R1-Rattenmodell²³ kombiniert, was zu einer Nekrose im Tumorkern und einer Medikamentenabgabe in die Peripherie führte. Traditionell wurde die Strahlentherapie als Zusatztherapie eingesetzt, um Tumorzellen zu schädigen und das lokale Wiederauftreten der Krankheit zu verringern. Seine Verwendung ist jedoch durch die lebenslange Dosierung und den Schaden außerhalb des Ziels^{begrenzt 1}. Daher ist HT insofern einzigartig, als es einige der gleichen Wirkungen ohne die gleichen Toxizitäten oder Einschränkungen verursachen kann.

Zu den präklinischen Tiermodellen für RMS gehören syngene immunkompetente Modelle und patientenabgeleitete Xenotransplantate (PDX) in immungeschwächten Wirten. Die immungeschwächten Modelle ermöglichen zwar das Wachstum der menschlichen Tumore, aber ihnen fehlt die geeignete Tumormikroumgebung und sie sind in ihrer Fähigkeit, die Immunantwort zu untersuchen, eingeschränkt²⁴. Die FGFR4-aktivierende Mutation ist ein vielversprechender Marker für eine schlechte Prognose und ein potenzielles therapeutisches Ziel bei adulter und pädiatrischer RMS ^1,25. In den syngenen RMS-Modellen, die im Gladdy-Labor entwickelt wurden, sind die Tumore in der Lage, in einem immunkompetenten Wirt zu wachsen, der eine angeborene und adaptive Immunantwort auf den Tumor entwickelt²⁶. Da HT die Immunantwort beeinflusst, ist die Beobachtung der Veränderung der murinen Immunantwort ein wertvoller Vorteil dieses Tumormodells. Um sowohl die Tumorantwort auf TLD im Vergleich zu FD als auch die Veränderung der Immunantwort des Tumors sowohl auf Chemotherapie als auch auf HT zu testen, wurde ein Protokoll zur Behandlung von syngenen murinen RMS-Tumoren in vivo mit MRgHIFU und TLD entwickelt und eingesetzt, was im Fokus dieser Studie steht.

Protokoll

Die Forschung wurde in Übereinstimmung mit den Tierpflegeausschüssen mit genehmigten Tierverwendungsprotokollen unter einem beaufsichtigenden Tierarzt in den Tierversuchseinrichtungen des Centre for Phenogenomics (TCP) und des University Health Network (UHN) Animal Resource Centre (ARC) durchgeführt. Alle Verfahren, mit Ausnahme des MRgHIFU, an denen die Tiere beteiligt waren, wurden in einer biologischen Sicherheitswerkbank (BSC) durchgeführt, um die Exposition der Tiere gegenüber der Außenluft oder anfällige Infektionen zu minimieren.

1. Mäusezucht

HINWEIS: Insgesamt wurden 65 Mäuse (Stamm B6.129S2-Trp53tm1Tyj/J) in die Pilotstudie eingeschlossen (Männchen: n = 23; Weibchen: n = 42). Sowohl männliche als auch weibliche Mäuse wurden im Alter von 7-9 Wochen verwendet. Ihre Jungtiere wurden entwöhnt und genotypisiert, und die heterozygoten p53-Mäuse wurden für die Experimente verwendet.

1. Unterbringe mit jeder männlichen Maus zwei weibliche Mäuse, um Zuchtkäfige zu bauen. Zählen Sie das Alter ihrer Welpen von Geburt an (Geburt = Tag 0).
2. Identifizieren Sie die Welpen an Tag 10 mit einer Ohrkerbe. Sammeln Sie Schwanzschnipsel für die Genotypisierung vor der Injektion von Zelllinien.

2. Genotypisierung der Maus

1. Extrahieren Sie DNA aus dem gesammelten 2-mm-Schwanzschnitt mit einem handelsüblichen DNA-Extraktionskit (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
2. Bestimmen Sie die DNA-Konzentration und -Reinheit, indem Sie die Absorption bei 260-280 nm auf einem Spektralphotometer messen (siehe Materialtabelle).
3. Führen Sie eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durch.
   1. Erstellen Sie einen Mastermix, der eine kommerzielle PCR-Mischung (mit Taq-Polymerase, dNTPS und MgCl 2; siehe Materialtabelle), Primer und dH₂O in einem Verhältnis von 12,5:0,25:10,75 (μL) für die erforderliche Anzahl von Proben enthält. Geben Sie 1 μl DNA-Probe in jedes PCR-Röhrchen und fügen Sie_dH2O, eine Nullprobe (homozygot für p53-Mutation), eine heterozygote Probe (heterozygot für p53-Mutation) und eine Wildtyp-Probe (homozygot für normales p53) als PCR-Kontrollen hinzu.
   2. Geben Sie 24 μl des Mastermixes in jedes PCR-Röhrchen, das DNA enthält. Pipettieren Sie die Lösung in jedem PCR-Röhrchen auf und ab, um die DNA im gesamten Mastermix zu verteilen.
   3. Legen Sie die Reaktionsgefäße in einen Thermocycler und durchlaufen Sie sie gemäß den folgenden Spezifikationen: 95 °C für 2 Minuten, 40 Zyklen von 95 °C für 15 s, 60 °C für 15 s und 72 °C für 1 Minute und dann bei 4 °C halten, bis Sie bereit sind, auf dem Gel zu analysieren.
4. Analysieren Sie die PCR-Produkte mittels Agarose-Gelelektrophorese.
   1. Bereiten Sie ein 2%iges Gel (50 ml 1x TAE und 1 g Agarose) vor, indem Sie die Agarose in der TAE erhitzen und mischen, bis sie sich aufgelöst hat. Wenn es abgekühlt und noch flüssig ist, fügen Sie der Agarose 2,5 μl DNA-Gelfärbung hinzu und mischen Sie. Gießen Sie das Gel in eine Gelbox mit einem Kamm. Geben Sie das Gel in die elektrophoretische Apparatur (siehe Materialtabelle) und bedecken Sie es mit 1x TAE.
   2. Laden Sie 10 μL 1 kB DNA Ladder auf das Gel. Laden Sie 12,5 μl jeder Probe. Lassen Sie das Gel 25 Minuten lang bei 135 V laufen.
   3. Bilde das Gel mit den entsprechenden Einstellungen für die verwendete DNA-Gelfärbung auf einem Gel-Imager (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers ab.

3. Vorbereitung des Tumormodells (Abbildung 1)

1. Die M25FV24C-Zelllinie (Passage 12-15) wird 1 Woche vor dem Injektionstermin in komplettem Nährmedium (Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM] mit Zusatzstoffen: 10 % FBS, 1 % Penicillin/Streptomycin und 2 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptid) in einem 75-ml-Kolben bei 37 °C und 5 % CO₂ gezüchtet. Sobald die Zellen zu ~80 % konfluent sind, saugen Sie das Medium ab und waschen Sie die Zellen 1x mit 5 ml Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS).
   HINWEIS: M25FV24C ist eine murine Zelllinie, die zur Überexpression der Mutante FGFR4^V550E entwickelt wurde, die bei pädiatrischen und adulten RMS ^1,26 beobachtet wird.
2. Heben Sie die Zellen an, indem Sie 0,5 ml 0,25%ige Trypsinlösung an die Seite der Platte geben und das Gefäß 2-3 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Sobald sich die Zellen gelöst zu haben scheinen, fügen Sie 2,5 ml vollständiges Nährmedium bei Raumtemperatur hinzu, um das Trypsin zu inaktivieren. Verwenden Sie ein 10-μl-Probenaliquot, um die Zellkonzentration lebensfähiger Zellen mit einem Hämozytometer und einem Trypanblau-Ausschluss zu bestimmen.
3. Bereiten Sie das richtige Volumen der DPBS-suspendierten Zellen für die Injektion vor und geben Sie es in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen: zu zentrifugierendes Volumen = (Anzahl der Mäuse × Anzahl der Zellen pro Maus)/ (Konzentration der Zellen), wobei die Anzahl der Mäuse = die zu injizierenden Mäuse + 10 zusätzliche Mäuse für Fehler und die Anzahl der Zellen pro Maus = 10⁴.
4. 5 min bei 153 x g zentrifugieren. Resuspendieren Sie das Zellpellet im entsprechenden Volumen (10 μl pro Maus × Anzahl der Mäuse) des Myo-Injektionspuffers (F10-Medium + 0,5 % FBS) und injizieren Sie die Mäuse innerhalb von 1 Stunde nach der Herstellung dieser Suspension.

4. Intramuskuläre Zellinjektion

HINWEIS: M25FV24C-Zellen werden im Alter von 4 bis 6 Wochen in die rechte Hintergliedmaße von Mäusen injiziert. Die Injektion nach 4 Wochen führt zu einer kleinen Maus mit einem Tumor, der schwieriger zu behandeln sein kann, da weniger umgebendes Gewebe für die HT-Dispersion vorhanden ist. Wenn Sie bis zu 6 Wochen warten, erhalten Sie eine größere Maus, was die Behandlung des Tumors erleichtert.

1. Invertieren Sie die Zellsuspension vor der Aspiration mehrmals, um die Zellen gleichmäßig in der Lösung zu verteilen. 10 μL (10,⁴ Zellen) mit einer Mikroliterspritze absaugen (siehe Materialtabelle). Scruff die Maus; Nach der Fixierung kann der Zugang zu den kaudalen Oberschenkelmuskeln durch Streckung des Hinterbeins erlangt werden. Rasieren Sie das Bein mit einer Haarschneidemaschine und wischen Sie es mit 70% Ethanol ab.
2. Injizieren Sie die M25FV24C-Zellsuspension (10 μL, 10 4 Zellen) mit einer gasdichten Mikroliterspritze mit einer 26s G-Nadel in die rechte Hinterschenkelmuskulatur einer^4-6 Wochen alten Maus.
   HINWEIS: Die Nadel sollte parallel zum Oberschenkelknochen in Richtung Knie eingeführt werden, wobei darauf zu achten ist, dass der Ischiasnerv nicht getroffen wird. Führen Sie aufgrund der geringen Muskelmasse der Hintergliedmaße nur die Nadelspitze (ca. 2 mm) ein.
3. Verabreichen Sie die Lösung in einer gleichmäßigen Bewegung. Entfernen Sie die Nadel und stellen Sie sicher, dass keine Blutungen auftreten. Bringen Sie die Maus in einen zweiten Käfig zurück.
4. Untersuchen Sie die Tiere täglich und überwachen Sie ihre Hinterbeine durch Abtasten auf Tumorwachstum. Euthanasieren Sie die Mäuse mit Kohlendioxid, wenn einer der folgenden frühen Endpunkte auftritt: Tumorgröße mit einem Durchmesser von mehr als 1,5 cm, Tumorulzeration oder systemische Krankheitszeichen (Piloerektion, gekrümmte Haltung, Inaktivität oder verminderte Nahrungs- oder Wasseraufnahme).

5. Screening-MRT-Scan

1. Betäuben Sie die Maus mit Isofluran unter den folgenden Parametern bis zu einem Niveau, auf dem es keine Bewegung mehr gibt, mit Isofluran: induzieren Sie es in einer Kammer mit 4 % bei 1,5 l/min, übertragen Sie es dann auf den Nasenkegel des MRT-Scanners und setzen Sie die Isofluran-Aufrechterhaltung am Nasenkegel mit 1,5 %-2 % bei 0,75 l/min fort. Bringen Sie den Atemmonitor an. Verwenden Sie Tierarztsalbe auf den Augen, um Trockenheit unter Narkose zu vermeiden.
2. Stellen Sie die anästhesierte Maus mit dem MRT-Scanner dar (siehe Materialtabelle). Notieren Sie sich auf dem T2-gewichteten Bild (Ax_Screen Aufnahme, Tabelle 1) die Abmessungen in der Ebene und die Anzahl der axialen Schnitte, in denen der Tumor erscheint. Notieren Sie sich die Lage des Tumors in Bezug auf den Femur und die laterale Oberfläche des Oberschenkels, wo die Ultraschallwelle eintreten würde.
   Anmerkung: Der Tumor erscheint als hyperintense Masse innerhalb des Muskels, die von der gegenüberliegenden Seite asymmetrisch ist. Eine gute Ausgangstumorgröße für mehrere Behandlungen beträgt 2 mm x 2 mm x 2 mm für Akut- oder Überlebensstudien. Wenn er viel größer ist, ist er nur für akute Studien geeignet, da der Tumor vor Abschluss von drei wöchentlichen Behandlungen einen Größenendpunkt erreicht. Zu den Ausschlusskriterien für eine HIFU-Behandlung gehören: um den Femur gewickelt, zu nah am Femur, zu posterior bei der Maus, medial des Femurs, zu nah am Rektum.
3. Nehmen Sie die Maus aus dem Scanner und ermitteln Sie die Basisgewichtung. Rasieren Sie die Maus unter Narkose mit einem Elektrorasierer von der Körpermitte bis zu den Füßen.
   Anmerkungen: Idealerweise wird die Rasur 1 Tag vor der Behandlung durchgeführt, da die Maus so die Pflege durchführen kann, wodurch die Enthaarungscreme effizienter wirken kann.
4. Bringen Sie die Maus mit einem Heizkissen unter einem Ende des Käfigs wieder in die BSC. Bringen Sie die Maus in ihren Käfig zurück, wenn sie das Brustbein wieder aufnimmt.

6. Experiment: HIFU-Behandlungstag Tiervorbereitung

1. Um das HIFU-System mit kleinem Durchmesser (siehe Materialtabelle) vorzubereiten, schalten Sie den Generator ein und füllen Sie den Wandler mit genügend deionisiertem Wasser, bis sich die Membran unter dem Wandler ausdehnt, aber nicht so fest, dass sie die Maus zusammendrücken würde. Entgasen Sie das Wasser im Wandlerkreislauf für 30 Minuten, um gelösten Sauerstoff aus dem Medium zu entfernen.
2. Bereiten Sie das zugehörige Computersystem vor.
   1. Schalten Sie den steuernden Computer ein und stellen Sie sicher, dass er über Ethernet mit dem HIFU-Generator und über USB mit dem Display der Wärmesonde verbunden ist. Starten Sie die Software und klicken Sie auf Home, um den Schallkopf zu starten, bevor Sie die Maus einsetzen.
   2. Kalibrieren Sie die faseroptischen Wärmesonden: Ermitteln Sie die Basis-Raumtemperaturen und notieren Sie die Temperaturänderung im MRT-Raum. Beachten Sie das Ausmaß der Temperaturdrift für jede Sonde aufgrund der magnetischen Feldstärke. Führen Sie den Temperaturfühler des Driftrohrs zur Temperaturkalibrierung während des Scanvorgangs in ein mit Gadolinium gefülltes Glasröhrchen ein und sichern Sie das Driftrohr mit Klebeband.
      HINWEIS: Die Basis-Raumtemperatur (Driftrohr) wird manuell als Thermometrieparameter in der GUI in der Software hinzugefügt. Innerhalb des Driftrohrs im MR-Bild wird eine Region of Interest (ROI) eingestellt, um eine Temperaturdrift zu erkennen, und korrigiert die Thermometriebilder automatisch.
   3. Ziehen Sie das zu injizierende Arzneimittel in eine 1-ml-Spritze auf und geben Sie es in die automatische Förderpumpe (siehe Materialtabelle). Bereiten Sie die Leitung, die mit dem Schwanzvenenkatheter der Maus verbunden wird, vor, bis das Medikament die Leitung vollständig gefüllt hat, indem Sie die Taste für die manuelle Abgabe an der automatischen Abgabepumpe drücken.
   4. Verwenden Sie eine Wärmelampe, um die Mäuse in den Käfigen ~20 Minuten lang zu erwärmen, bevor Sie sie in die Anästhesiekammer bringen.
      Anmerkungen: Das Vorheizen fördert die Vasodilatation, die auftritt, sobald die Maus betäubt wird, und hilft bei der Platzierung des Katheters.
3. Die Maus wird mit Isofluran betäubt (Induktion: 4 % bei 1,5 l/min; Erhaltung: 1,5 %-2 % bei 0,75 l/min) und in einen Nasenkegel überführt. Tragen Sie ein Hornhautgleitmittel auf die Augen auf, um Schäden durch den fehlenden Blinzelreflex unter Narkose zu vermeiden.
4. Tragen Sie Enthaarungscreme auf die rasierte Stelle, einschließlich der gesamten rechten Hintergliedmaße, auf und befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers zur Haarentfernung.
   Anmerkungen: Positionieren Sie die Maus unter einer Wärmelampe, während sie sich in der BSC befindet, um die Wärmeregulierung während der Haarentfernung unter Narkose zu unterstützen.
5. Nachdem Sie die Enthaarungscreme mit warmem Wasser abgewaschen haben, wiegen Sie die Maus auf einer digitalen Waage und notieren Sie die Medikamentendosierung.
6. Bewegen Sie die Maus zu einem MRT-kompatiblen Nasenkegel auf dem MRT-Schlitten. Positionieren Sie eine Wärmelampe an der Maus, um sie warm zu halten, während Sie sich auf das MRT vorbereiten. Platzieren Sie die Maus in der lateralen Dekubitusposition mit der nicht-tumortragenden Seite nach unten und dem Tumor superior in einem 3D-gedruckten Maushalter auf dem Schlitten (ergänzende Abbildung 1 und Abbildung 2). Stellen Sie sicher, dass der Tumor richtig positioniert ist (d. h. in der Mitte der Spule horizontal und vertikal, mit der Höhe knapp über den Rändern des Maushalters, um die Kompression durch den Ultraschallkopf zu berücksichtigen).
   Anmerkungen: Schneiden Sie bei Bedarf ein komprimiertes Ultraschall-Gelpad-Segment ab, um es unter die Maus zu legen und die Unterseite des Halters mit einer Dicke auszukleiden, um den Tumor bis zur Oberseite des Halters auszurichten.
7. Stecken Sie das unbeteiligte Bein vom Tumorbein weg, entweder unter der Maus oder gestreckt mit gebeugtem Tumorbein. Stellen Sie sicher, dass sich die Füße nicht im Nah- oder Fernfeld des Tumor- und Ultraschallstrahlengangs befinden. Positionieren Sie die Wärmelampe 15 cm vom Schwanz entfernt, um sie für das Einführen des Katheters in die Schwanzvene zu erwärmen.
8. Führen Sie den Ösophagustemperaturfühler ein.
   1. Fädeln Sie die Speiseröhrensonde durch den Nasenkegel und schrubben Sie den Hals der Maus. Neigen Sie die Mausnase nach oben, um eine Linie vom Maul direkt zum Bauch zu bilden, indem Sie den Kopf verlängern. Schieben Sie die Wärmesonde ca. 0,5 cm über die Zunge in die Speiseröhre der Maus und setzen Sie den Nasenkegel wieder um die Nase der Maus ein. Befestigen Sie die Speiseröhrensonde und den Nasenkegel an der Oberseite des Schlittens.
      Anmerkungen: Achten Sie unmittelbar nach dem Einführen auf Anzeichen von Atemnot, da es unsachgemäß in die Luftröhre eingeführt werden kann.
9. Führen Sie den rektalen Temperaturfühler ein.
   Anmerkungen: Die rektalen und ösophagealen Temperaturfühler sollten innerhalb von 3 °C voneinander entfernt sein.
10. Platzieren Sie den Atemmonitor mit dem Verbindungskabel in Richtung des Mauskopfes, damit er die Platzierung des Ultraschallwandlers nicht stört. Mit Klebeband sichern.
11. Führen Sie einen 27-G-Schmetterlingsnadel-Schwanzvenenkatheter mit 20 μl Totraum und Klebeband in eine seitliche Schwanzvene ein, die an einem Mikroschlauch befestigt ist. Stellen Sie nach dem Tapen sicher, dass der Katheter noch gut spült.
12. Tragen Sie die vorbereitete Maus, den Mausschlitten, den Anästhesieschlauch, den Beatmungsschlauch, den Schwanzvenenkatheter und die Wärmesondenschnüre zu zweit in den MRT-Scanner und legen Sie sie in den MRT-Schlittenhalter.
13. Lassen Sie den Bediener der HIFU-Software ( siehe Materialtabelle) den Meniskus des Schallkopfs durch Sichtprüfung direkt über den Tumor bewegen, um eine anfängliche Ausrichtung²⁷ zu erreichen. Tragen Sie Augengleitgel oder entgastes Ultraschallgel auf die haarlose Haut über dem Tumor auf und koppeln Sie den HIFU-Schallkopf an den Tumorbereich.
14. Schließen Sie die Medikamentenabgabeleitung von der automatischen Pumpe an den Schwanzvenenkatheter an. Berechnen Sie den Totraum in der Schwanzvenenlinie und der Verbindungslinie. Schieben Sie den Maus-HIFU-Schlitten auf MRT-Schienen in die Mitte des MRT.
15. Stellen Sie die Menge der Arzneimittelinfusion an der Pumpe ein, abhängig von der Art und Konzentration des Arzneimittels und dem Gewicht des Tieres, und fügen Sie die Menge des Totraums hinzu. Stellen Sie die Pumpe auf eine Infusionsrate von 200 μL/min ein.
    HINWEIS: In dieser Studie wurden FD und TLD in einer Konzentration von 2 mg/ml und einer Dosis von 5 mg/kg Körpergewicht verwendet.
16. Notieren Sie die Basistemperaturen der Wärmefühler.
17. Stellen Sie das Luftkonvektionswärmgerät (siehe Materialtabelle) auf die wärmste Stufe. Richten Sie den Schlauch, der Luft in die Mitte der MRT-Bohrung bläst, auf die Maus und befestigen Sie sie mit Klebeband. Das Aufwärmgerät wird später auf die niedrigste Stufe (32 °C) gedreht, um eine Überhitzung der Maus während der Beschallung zu vermeiden.
18. Erfassen Sie die MR-Bilder der Vermessung (Ax_Loc, Sag_Loc; Tabelle 1) zur Bestimmung der Tumorlokalisation für das Beschallungsziel, einschließlich der Tiefe. Passen Sie die Position des Gebers mit der HIFU-Software entsprechend an, indem Sie den gewünschten Bewegungsabstand eingeben, der auf dem Bild gemessen wird, und dann auf die Pfeilrichtung klicken, um sich zu bewegen (Abbildung 3A). Beachten Sie auch die Position des Driftrohrs. Wiederholen Sie den Vorgang nach Bedarf.
19. Bestimmen Sie die Position des Brennflecks des Schallkopfs in der koronalen Ebene, indem Sie während der Test_Shot Thermometrieaufnahme eine kurze kontinuierliche "Testaufnahme" mit einer Amplitude von 5 s x 50 mV durchführen (Tabelle 1).
20. Richten Sie die MR-Survey-Bilder mit der koronalen Ansicht des Brennflecks in der HIFU-Software aus. Überprüfen Sie die Bilder auf die Lokalisation des Tumors in Bezug auf die knöcherne Struktur und das Rektum und überprüfen Sie die Positionierung des Schallkopfs nach Bedarf.
21. Wiederholen Sie die Testbeschallung während der Thermo-Bildgebung mit neun Wiederholungen (Tabelle 1), um zu bestätigen, ob das Tumorvolumen gleichmäßig und genau erhitzt wird und nur eine minimale Off-Target-Erwärmung vorliegt. Passen Sie die Scheibenposition, die Position des Gebers und die Lenktiefe an und bestätigen Sie die Heizleistung mit wiederholten "Testschüssen", wenn dies als erforderlich erachtet wird.
22. Definieren Sie mit der HIFU-Behandlungsüberwachungssoftware den ROI für die thermometrische Überwachung innerhalb des endgültigen Heizprofils, indem Sie den zu bewegenden Abstand messen und dann die Rasterkoordinaten im Programm ändern. Stellen Sie einen ROI um das Driftrohr herum ein, um die Drift zu korrigieren. Geben Sie die Basistemperatur basierend auf der Temperatur der rektalen Sonde für thermometrische Messungen ein. Das HIFU-System wird verwendet, um die HIFU-Behandlung zu initiieren, die Beschallung durchzuführen und die Thermometrie zu überwachen.
23. Öffnen Sie die Spezifikationen für die 20-minütige Hyperthermie-Behandlung in der Software und starten Sie die Beschallung, sobald die Referenz-MRT-Bilder erfasst sind und die Thermometrie beginnt.
24. Führen Sie eine 20-minütige Behandlung (Abbildung 3B) während der thermischen Bildgebung (Tabelle 1) mit der integrierten PID-Reglersoftware (Proportional-Integrative-Derivative) durch. Injizieren Sie das ausgewählte Medikament nach 1,5 Minuten, nachdem sich die Temperatur im ROI auf die gewünschte Temperatur (40 °C) erwärmt hat.
25. Überwachen Sie die Kerntemperatur während der gesamten Behandlung. Wenn die rektale Temperatur während der Behandlung schnell ansteigt, kann eine Neupositionierung der Maus erforderlich sein, um eine rektale Erwärmung über die Behandlungsdauer von 10 oder 20 Minuten zu vermeiden. Beenden Sie die Behandlung, wenn die rektale Temperatur auf >40 °C ansteigt.

7. Experiment: Bildgebung und Beschallungsverfahren im Mausmodell für akute Studien

1. Nach Abschluss der Behandlung wird die Maus aus der MRT-Bohrung entfernt und die Hämostase an der Einführstelle des Schwanzvenenkatheters sichergestellt. Legen Sie die Maus in den BSC und legen Sie sie zur weiteren Anästhesie auf den Nasenkegel.
2. Legen Sie die Maus auf den Rücken auf eine blaue, saugfähige Unterlage, wobei die Gliedmaßen gefesselt und das Herz freigelegt ist.
3. Euthanasieren Sie die Mäuse durch Ausblutung durch Herzpunktion mit anschließender Entfernung des Herzens. Das Blut wird sofort entnommen und zur Plasmatrennung bei 10.621 x g für 10 min zentrifugiert.
4. Führen Sie eine Nekropsie durch und lagern Sie die Organe nach Bedarf für die Analyse. Die Organe in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -80 °C für mehrere Monate oder langfristig in einem Flüssigstickstofftank lagern.
5. Homogenisieren Sie das Tumorgewebe mechanisch, indem Sie einen neunfachen Überschuss (w/w) deionisiertes Wasser hinzufügen und das Gewebe mit einem perlschlagenden Homogenisator aufbrechen. Doxorubicin wird aus 600 μl homogenisiertem Gewebe extrahiert, indem nacheinander 75 μl 300 mg/ml Silbernitrat, 75 μl 10 mM Schwefelsäure und 2,5 ml 1:1 Isopropanol:Chloroform hinzugefügt werden. 20 min aufwirbeln und über Nacht bei −20 °C lagern.
6. Um Proben für die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) vorzubereiten, zentrifugieren Sie die Lösung aus Schritt 7.5 bei 4.500 x g, entfernen Sie die organische Lösungsmittelschicht und trocknen Sie das Isopropanol:Chloroform unter einem Stickstoffgasstrom. Resuspendierung in 100 μl 2:1 MeOH_:H2O. Doxorubicin-Konzentration mit HPLC-MS/^{MS 28} messen.

8. Experiment: Bildgebung und Beschallung von Mausmodellen für Überlebensstudien

HINWEIS: Befolgen Sie für Überlebensstudien das HIFU-Behandlungstag-Tiervorbereitungsverfahren (Schritt 6.1 bis 6.25).

1. Legen Sie die Maus nach Abschluss der Behandlung unter eine Wärmelampe, damit sie sich erholen kann, und überwachen Sie ihre Atmung und Bewegung, bis sie wieder sternal liegt. Bringen Sie das Tier dann in seinen Käfig zurück.
   Anmerkungen: Stellen Sie sicher, dass die Hälfte des Käfigs mit einer Wärmelampe ausgerichtet ist, da die Wärmeregulierung der Tiere durch die Anästhesie und HT-Behandlung beeinträchtigt wird.
2. Überwachen Sie die Mäuse täglich auf Verhalten, Fressmuster und Atemfrequenz auf Anzeichen von Stress.
3. Führen Sie die Behandlungen einmal wöchentlich nach den Schritten 6.1 bis 6.25 für 3 aufeinanderfolgende Wochen durch.
4. Führen Sie zweimal wöchentlich eine MRT-Bildgebung der Mäuse zur Tumormessung durch. Führen Sie in den Wochen während der Behandlung jede Woche eine MRT-Untersuchung und einen Ultraschall durch. Führen Sie nach Abschluss der Behandlung alle zwei Wochen eine Ultraschallbildgebung durch.
5. Euthanasieren Sie die Maus 60 Tage nach Abschluss der Behandlungsreihe oder wenn ein humaner Endpunkt erreicht ist (Tumorgröße >1,5 cm³ oder Morbidität des Tumors), gefolgt von einer Sektion mit Tumor- und Organentnahme zur Analyse.

Ergebnisse

Mit Hilfe des MRgHIFU-generierten Hyperthermie-Protokolls konnten die Tumoren in der Hintergliedmaße für die Dauer der Behandlung konstant auf die gewünschte eingestellte Temperatur erhitzt werden (Abbildung 4 zeigt eine repräsentative Behandlung, 10 oder 20 min, n = 65). Um eine Behandlung als erfolgreich zu betrachten, musste der ROI während der gesamten Behandlung über 39 °C gehalten werden, mit einer Schwankung von <6 °C während der gesamten Behandlung und ohne Erwärmung des Of...

Diskussion

Das hier entwickelte Protokoll wurde verwendet, um Tumore der Hintergliedmaßen unter Verwendung von MRgHIFU für eine milde HT-Behandlung zu behandeln und verkapselte Wirkstoffe aus Liposomen in vivo freizusetzen. Während der Pilotstudie wurden mehrere kritische Schritte in diesem Protokoll festgestellt, und die Optimierung dieser kritischen Schritte führte zu einem verbesserten Behandlungserfolg gegenüber der Pilotstudie. Zuerst werden die Haare an der zu beschallenden Stelle vollständig entfernt. Jeder Ga...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5mL Eppendorf tubes	Eppendorf	22363204
1kb plus DNA Ladder	Froggabio	DM015-R500
2x HS-Red Taq (PCR mix)	Wisent	801-200-MM
7 Tesla MRI BioSpec	Bruker	T184931	70/30 BioSpec, Bruker, Ettlingen, Germany
C1000 Thermal cycler	Biorad	1851148
Clippers	Whal Peanut	8655
Compressed ultrasound gel	Aquaflex	HF54-004
Convection heating device	3M Bair Hugger	70200791401
Depiliatory cream	Nair	61700222611	Shopper's Drug Mart
DMEM	Wisent	219-065-LK
DNeasy extraction kit	Qiagen	69504
DPBS	Wisent	311-420-CL
Drug injection system	Harvard Apparatus	PY2 70-2131	PHD 22/2200 MRI compatible Syringe Pump
Eye lubricant	Optixcare	50-218-8442
F10 Media	Wisent	318-050-CL
FBS	Wisent	081-105
Froggarose	FroggaBio	A87
Gel Molecular Imager	BioRad	GelDocXR
Glutamax	Wisent	609-065-EL
Heat Lamp	Morganville Scientific	HL0100	Similar to this product
Intravascular Polyethylene tubing (0.015" ID x 0.043" OD, 20G)	SAI infusion	PE-20-100
Isoflurane	Sigma	792632
M25FV24C Cell line	Gladdy Lab	N/A
Microliter Syringe	Hamilton	01-01-7648
Molecular Imager Gel Doc XR	Biorad	170-8170
Mouse holder	The 3D printing material used was ABS-M30i, and it was printed on FDM Fortus 380mc machine	N/A	Dimensions: length = 43 mm, outer radius = 15 mm, inner width (where the mouse would sit) = 20.7 mm.
MyRun Machine	Cosmo Bio Co Ltd	CBJ-IMR-001-EX
Nanodrop 8000 Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-8000-GL
p53 primers	Eurofins	N/A	Custom Primers
PCR tubes	Diamed	SSI3131-06
Penicillin/Streptomycin	Wisent	450-200-EL
Proteus software	Pichardo lab	N/A
Respiratory monitoring system	SAII	Model 1030	MR-compatible monitoring and gating system for small animals
Small Bore HIFU device, LabFUS	Image Guided Therapy	N/A	LabFUS, Image Guided Therapy, Pessac, France Number of elements 8 frequency 2.5 MHz diameter  25 mm radius of curvature 20 mm Focal spot size 0.6 mm x 0.6 mm x 2.0 mm Motor: axes 2 Generator: Number of channels 8 Maximum electrical power/channel Wel 4 Maximum electrical power Wel 32 Bandwidth 0.5 - 5 MHz Control per channel: Freq., Phase and. amplitude Measurements per channel: Vrms, Irms, cos(theta) Duty Cycle at 100% power % 100% for 1 min. Transducer: Number of elements 8 frequency  2.5 MHz diameter 25 mm radius of curvature 20 mm Focal spot size  0.6 mm x 0.6 mm x 2.0 mm
SYBR Safe	ThermoFisher Scientific	S33102
TAE	Wisent	811-540-FL
Tail vein catheter (27G 0.5" )	Terumo Medical Corp	15253
Thermal probes	Rugged Monitoring	L201-08
Trypan blue	ThermoFisher Scientific	15250061
Trypsin	Wisent	325-052-EL
Ultrasound Gel	Aquasonic	PLI 01-08