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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Die Elektroporation ist eine schnelle, weit verbreitete Methode zur Einführung exogener DNA in die Gattung Rickettsia. Dieses Protokoll bietet eine nützliche Elektroporationsmethode für die Umwandlung von obligaten intrazellulären Bakterien in der Gattung Rickettsia.

Zusammenfassung

Rickettsiosen werden durch eine breite Palette von obligaten intrazellulären Bakterien der Gattung Rickettsia verursacht, die durch den Biss infizierter Arthropodenvektoren auf Wirbeltierwirte übertragen werden können. Bis heute bleiben neu auftretende oder wieder auftretende epidemische Rickettsiosen aufgrund der Schwierigkeit bei der Diagnose ein Risiko für die öffentliche Gesundheit, da diagnostische Methoden begrenzt und nicht standardisiert oder allgemein zugänglich sind. Fehldiagnosen, die aus einer mangelnden Erkennung der Anzeichen und Symptome resultieren, können zu einer verzögerten Antibiotikabehandlung und schlechten Gesundheitsergebnissen führen. Ein umfassendes Verständnis der Rickettsienmerkmale würde letztendlich die klinische Diagnose, Bewertung und Behandlung mit verbesserter Kontrolle und Prävention der Krankheit verbessern.

Funktionelle Studien von Rickettsialgenen sind entscheidend für das Verständnis ihrer Rolle in der Pathogenese. Diese Arbeit beschreibt ein Verfahren zur Elektroporation des Rickettsia parkeri Stammes Tate's Hell mit dem Shuttle-Vektor pRAM18dSFA und die Selektion von transformiertem R. parkeri in Zeckenzellkultur mit Antibiotika (Spectinomycin und Streptomycin). Es wird auch eine Methode zur Lokalisation von transformiertem R. parkeri in Zeckenzellen unter Verwendung der konfokalen Immunfluoreszenzmikroskopie beschrieben, einer nützlichen Technik zur Überprüfung der Transformation in Vektorzelllinien. Ähnliche Ansätze eignen sich auch für die Transformation anderer Rickettsien.

Einleitung

Rickettsiosen werden durch eine breite Palette von obligaten intrazellulären Bakterien verursacht, die zur Gattung Rickettsia (Familie Rickettsiaceae, Ordnung Rickettsiales) gehören. Die Gattung Rickettsia wird anhand phylogenetischer Merkmale in vier Hauptgruppen eingeteilt1,2: die Fleckfiebergruppe (SFG), die diejenigen Rickettsien enthält, die die schwersten und tödlichsten durch Zecken übertragenen Rickettsiosen verursachen (z. B. Rickettsia rickettsii, der Erreger des Rocky-Mountain-Fleckfiebers), die Typhusgruppe (TG, z. B. Rickettsia prowazekii, der Erreger des epidemischen Typhus), die Übergangsgruppe (TRG, z. B. Rickettsia felis, der Erreger des durch Flöhe übertragenen Fleckfiebers) und die Ahnengruppe (AG, z. B. Rickettsia bellii).

Unter den ältesten bekannten vektorübertragenen Krankheiten werden Rickettsiosen hauptsächlich nach Übertragung der Erreger durch die Bisse infizierter Arthropodenvektoren, einschließlich Zecken, Flöhe, Läuse und Milben erworben 3,4. Obwohl die Entdeckung wirksamer Antibiotika die Behandlungsergebnisse verbesserte, stellen neu auftretende und wieder auftretende epidemische Rickettsiosen weiterhin traditionelle Präventions- und Kontrollstrategien in Frage. Daher würde ein umfassendes Verständnis der Rickettsien/Wirt/Vektor-Interaktionen letztendlich eine solide Grundlage für die Entwicklung neuer Ansätze zur Vorbeugung und Heilung dieser alten Krankheiten schaffen.

In der Natur erfolgt der horizontale Gentransfer (HGT) in Bakterien durch Konjugation, Transduktion und Transformation5. Die bakterielle In-vitro-Transformation nutzt diese HGT-Konzepte, obwohl die intrazelluläre Natur von Rickettsien einige Herausforderungen darstellt. Die eingeschränkten Wachstumsbedingungen und schlecht verstandenen Konjugations- und Transduktionssysteme bei verschiedenen Arten von Rickettsien haben die Anwendung von Konjugations- und Transduktionsmethoden bei Rickettsien 6,7,8 verhindert. Im Vergleich zu anderen obligaten intrazellulären Bakteriengattungen (z.B. Chlamydien, Coxiella, Anaplasma und Ehrlichia) unterscheidet sich die Gattung Rickettsia hinsichtlich der Wachstums- und Replikationsstrategien innerhalb des Zellzytoplasmas, was die genetische Veränderung von Rickettsien aufgrund ihrer einzigartigen Lebensweise vor besondere Herausforderungen stellt9.

Die erste Hürde, die es beim Versuch der genetischen Veränderung von Rickettsien zu überwinden gilt, ist eine erfolgreiche Transformation. Daher wäre die Entwicklung eines praktikablen Ansatzes mit hoher Transformationseffizienz äußerst wertvoll für die Entwicklung genetischer Werkzeuge für Rickettsien. Hier konzentrieren wir uns auf die Elektroporation, eine weithin anerkannte Transformationsmethode, die verwendet wurde, um exogene DNA erfolgreich in mehrere Arten von Rickettsien einzuführen, darunter Rickettsia prowazekii, Rickettsia typhi, Rickettsia conorii, Rickettsia parkeri, Rickettsia montanensis, Rickettsia bellii, Rickettsia peacockii und Rickettsia buchneri10,11,12 ,13,14,15,16.

Dieser Artikel beschreibt ein Verfahren zur Elektroporation des R. parkeri-Stammes Tate's Hell (Akzession: GCA_000965145.1) mit dem Shuttle-Vektor pRAM18dSFA, der vom Rickettsia-Amblyommatis-Stamm AaR/SC-Plasmid pRAM18 abgeleitet ist und entwickelt wurde, um mKATE, ein weit rot fluoreszierendes Protein, und aadA zu kodieren, wodurch Spectinomycin- und Streptomycin-Resistenz13,15,20 verliehen wird. Transformierte R. parkeri sind lebensfähig und werden unter Antibiotikaselektion in Zeckenzelllinien stabil gehalten. Darüber hinaus zeigen wir, dass die Lokalisation von transformiertem R. parkeri in lebenden Zeckenzellen mittels konfokaler Mikroskopie genutzt werden kann, um die Qualität von Transformationsraten in Vektorzelllinien zu beurteilen.

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Protokoll

1. Vermehrung und Reinigung von R. parkeri aus Zeckenzellkulturen

HINWEIS: Alle Zellkulturverfahren sind in einer Biosicherheitswerkbank der Klasse II durchzuführen.

  1. Vorbereitend R. parkeri-infizierte Zeckenzellen
    1. ISE6-Zellen in 25 cm 2-Zellkulturkolben bei 34 °C in 5 ml L15C300 medium17 züchten, ergänzt mit 5% fetalem Rinderserum (FBS), 5% Tryptosephosphatbrühe (TPB) und 0,1% Lipoproteinkonzentrat (LPC).
      HINWEIS: ISE6 (Ixodes scapularis embryo-derived cell line) ist eine Zeckenzelllinie, die in vielen Laboratorien ausgiebig verwendet wird und daher ein wesentliches Modell zur Untersuchung von Zecken-Erreger-Interaktionenist 17,18,19. Die Wachstumsrate von ISE6-Zellen ist langsamer als die von Säugetierzellen, mit einer Populationsverdopplungszeit von ≥72 h. Zum Beispiel benötigen ISE6-Zellen, die aus einer 100% konfluenten Kultur im Verhältnis 1:5 subkultiviert werden, 3-4 Wochen, um 100% Konfluenz wiederherzustellen. Gesunde ISE6-Zellen werden im Allgemeinen mit zahlreichen anhaftenden Filamentengerundet 17.
    2. Zählen Sie die ISE6-Zellen mit einem Hämozytometer unter einem Lichtmikroskop. Verwenden Sie in einer Konzentration von ~ 106 Zellen / ml (100% konfluent).
      1. Spülen Sie die Zellen vorsichtig mit Medium aus dem Kolben und dispergieren Sie die Zellen durch Pipettieren, um eine homogene Zellsuspension zu erzeugen. Fügen Sie 20 μL Zellsuspension zwischen dem Hämozytometer und dem Deckglas hinzu, um die Zellen mit einem Hämozytometer zu zählen.
    3. Wirtszellfreier Wildtyp R. parkeri 20 (durchschnittliche Anzahl: 5 × 10 7-10 × 107) zu den ISE6-Zellkulturkulturen in 25 cm2 Zellkulturkolben zugeben. Inkubieren infizierter R. parkeri-Zellkulturen bei 34 °C in 5 ml komplettem Medium, bestehend aus L15C300-Medium, 10% FBS, 5% TPB, 0,1% LPC, 0,25% Natriumbicarbonat (NaHCO3) und 25 mM HEPES, bis 90% -100% der Zellen infiziert sind.
      HINWEIS: Die Infektionsrate von R. parkeri in ISE6-Zellen wird durch Giemsa-Färbung bestimmt, und die Inkubationszeit bis zum Erreichen einer Infektion von 90% -100% liegt im Durchschnitt zwischen 5 Tagen und 7 Tagen.
    4. Bestimmen Sie die Infektionsrate über Giemsa-Färbung.
      1. Resuspendieren Sie im Biosicherheitswerkkasten die infizierten Zellkulturen und geben Sie 50 μL der Suspension in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
      2. Die Suspension mit vollständigem Medium (1:5 Verdünnung) verdünnen und 100 μL auf Glasobjektträger mit einer Zentrifuge bei 113 × g für 5 min zentrifugieren. Um R. parkeri am Leben zu halten, verwenden Sie eine Zentrifuge mit einem versiegelten Rotor, der so konzipiert ist, dass er aus der Zentrifuge entfernt werden kann. Dies ermöglicht den Transport des abgedichteten Rotors in und aus der Haube.
        HINWEIS: Da die R. parkeri vor der Zentrifugation noch am Leben sind, muss die Probe enthalten sein, bis die Rickettsien abgetötet sind. Daher muss die Zentrifuge, mit der die R. parkeri-Kultur auf den Objektträger gedreht wird, einen abgedichteten Rotor haben, der so konzipiert ist, dass er aus der Zentrifuge gehoben werden kann. Wenn sich der Rotor in der Laminar-Flow-Haube befindet, legen Sie die Proben in die Trichtermikroskop-Objektträgerbaugruppe, verschließen Sie den Rotor wieder und setzen Sie den versiegelten Rotor wieder in die Zentrifuge ein. Dann schalten Sie die Zentrifuge ein und die Proben werden auf die Objektträger gelegt. Nachdem der Lauf beendet ist, entfernen Sie den versiegelten Rotor aus der Zentrifuge und legen Sie ihn in die Laminarströmungshaube. Öffnen Sie dort den Rotordeckel und entladen Sie die Trichtermikroskop-Objektträgerbaugruppe in der Haube. Nach dem Trocknen tauchen Sie die Glasmikroskop-Objektträger in absolutes Methanol, das alle Krankheitserreger abtötet. Die Trichter und die Metallträger werden in verdünntes DMQ getaucht, das R. parkeri tötet.
      3. Trocknen Sie die Objektträger an der Luft und fixieren Sie sie in absolutem Methanol für 5 min bei Raumtemperatur (RT).
      4. Die Objektträger mit Giemsa-Färbung (4% im Puffer von Sørenson, pH 6,6) 30 min bei 37 °C färben und 5 s mit Wasser abspülen.
      5. Bestimmen Sie den Infektionsprozentsatz (Anzahl der mit Rickettsien infizierten Zellen/100 Zellen) durch Lichtmikroskopie.
        HINWEIS: Abbildung 1 zeigt typische Giemsa-Färbeergebnisse.
  2. Herstellung von zellfreiem R. parkeri
    HINWEIS: Wenn 90% -100% der Zellen in der Kultur infiziert sind, sollten die Rickettsien aus den ISE6-Zellen isoliert und eine Elektroporation durchgeführt werden.
    1. Fügen Sie sterile 60-90 Siliziumkarbidkörnung zu sterilen 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen auf ein Volumen von ca. 0,2 ml hinzu.
    2. Entfernen Sie 2 ml Medium aus 100% R. parkeri-infizierten Kulturen (Schritt 1.1.3) und resuspendieren Sie die Zellen in den verbleibenden 3 ml Medium.
    3. Gleiche Teile dieser Suspension werden in Röhrchen überführt, die in Schritt 1.2.1 hergestellt wurden.
    4. Wirbeln Sie jedes Rohr mit hoher Geschwindigkeit für 30 s und legen Sie die Rohre dann auf Eis. Lassen Sie die Körnung innerhalb von Sekunden durch die Schwerkraft absetzen.
    5. Halten Sie in einer Biosicherheitswerkbank der Klasse II eine sterile 5-ml-Luer-Lock-Spritze bereit, wobei der Kolben ausgefahren und das Ende des Kolbens in einem Polystyrolboden für 15-ml-konische Röhrchen befestigt ist.
    6. Entfernen Sie mit einer sterilen 1-ml-Barrierepipettenspitze, die an einem geeigneten Pipettor angebracht ist, den Überstand des vortexierten Zelllysats aus dem Röhrchen und achten Sie darauf, keinen Splitt abzusaugen. Führen Sie die Pipetenspitze in die Öffnung der Spritzennabe ein und werfen Sie den Inhalt mit leichtem Druck in die Spritze. Alternativ können Sie eine sterile 2-ml-Pasteur-Pipette verwenden, die mit einem Gummikolben betrieben wird.
    7. Befestigen Sie einen sterilisierten 2-μm-Porenfilter an der Spritzennabe und filtrieren Sie die R. parkeri-Kultur aus Schritt 1.2.6 in sterile 1,5-ml-Röhrchen.
    8. R. parkeri wird 5 min lang bei 13.600 × g bei 4 °C bei 13.600 g gesammelt und der Überstand entsorgt.
    9. Das Pellet in 1,2 mL eiskalter 300 mM Saccharose resuspendieren und nochmals bei 13.600 × g bei 4 °C für 5 min zentrifugieren. Wiederholen Sie die Resuspension und Zentrifugation für insgesamt zwei Saccharosewaschgänge.
    10. Kombinieren Sie die R. parkeri-Pellets zu einem gekühlten, sterilen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen in 50 μL eiskalter 300 mM Saccharose pro Umwandlung. Da ein 25 cm2 Kolben R. parkeri genug Rickettsien für zwei bis drei Umwandlungen liefert, fügen Sie 100-150 μL 300 mM kalte Saccharose hinzu.
      HINWEIS: Falls gewünscht, kann die Anzahl der Rickettsien mit einer Petroff-Hausser-Zählkammer berechnet werden. Bei einer anfänglichen Impfung von 5 × 10 7 -10 × 10 7 zellfreien R. parkeri dauert es durchschnittlich 5-7 Tage, um eine 90%-100%ige Infektion zu erreichen, was etwa 5 × 107-10 × 1010 zellfreie R. parkeri ergibt.
    11. Resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig durch Pipettieren, bis es vollständig dispergiert ist. Teilen Sie die Probe in 50-μL-Portionen in gekühlte, sterile 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
      HINWEIS: Falls gewünscht, kann die Rickettsiallebensfähigkeit durch Durchflusszytometrie nach Färbung mit einem Fluoreszenzfarbstoff 21 beurteilt werden.

2. Transformation von R. parkeri mit dem pRAM18dSFA-Plasmid

  1. Auf Eis 3 μg endotoxinfreies pRAM18dSFA-Plasmid DNA 13,15,20 in jedes Röhrchen mit 50 μL R. parkeri Suspension geben und die Mischung mit der Pipetenspitze vorsichtig, aber gründlich umrühren.
    HINWEIS: Verwenden Sie bei der Herstellung von Plasmid-DNA ein Reinigungskit, das einen Schritt zur Entfernung von Endotoxinen enthält, um endotoxinfreie Plasmid-DNA23 zu erhalten. Wir fanden heraus, dass ein Bereich von Plasmidkonzentrationen zwischen 1 μg und 3 μg pro 50 μL R. parkeri Suspension zu erfolgreichen Transformationen führte, während eine Erhöhung der Plasmidmenge auf 10 μg die Transformation hemmte.
  2. Die obige Mischung aus DNA und R. parkeri wird in eine gekühlte, sterile 0,1 cm Spalt-Elektroporationsküvette überführt (klopfen Sie vorsichtig auf die Küvette, bis die Mischung gleichmäßig verteilt ist) und lassen Sie sie 10-30 min auf Eis sitzen.
  3. Entfernen Sie das Medium aus einer 100% konfluenten Kultur von ISE6-Zellen und resuspendieren Sie die Zellschichten in 1,5 ml frischem Medium mit NaHCO 3 und HEPES-Puffer (oben in Schritt 1.1.3 beschrieben). Verwenden Sie einen Kolben konfluenter Zellen pro Transformation.
  4. Die resuspendierten Zellen werden in ein steriles 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt (ein Röhrchen pro 25 cm2-Kolben ISE6-Zellen).
  5. Elektropolat der R. parkeri/pRAM18dSFA-Mischung bei 1,8 KV, 200 Ohm, 25 μF unter Verwendung eines Elektroporators.
  6. Mit einer sterilen, verlängerten Feinspitzen-Transferpipette eine kleine Menge der ISE6-Zellsuspension (Schritt 2.4) in die Küvette überführen und die Flüssigkeit vorsichtig auf und ab ziehen, um die Küvette auszuwaschen. Die Mischung wird in das 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit dem Rest der ISE6-Zellsuspension überführt und das Transformationsgemisch vorsichtig mit den Zellen gemischt.
  7. Zentrifugieren Sie die transformierten Proben bei 700 × g für 2 min bei RT und erhöhen Sie dann die Zentrifugationsgeschwindigkeit auf 13.600 × g für 1 min mehr bei RT.
    HINWEIS: Die beiden Zentrifugationsgeschwindigkeiten fördern die Rickettsialbindung mit und den Eintritt in die Zellen: 700 × g werden verwendet, um die ISE6-Zellen herunterzuziehen, während 13.600 × g zum Abziehen der Rickettsien verwendet werden.
  8. Lassen Sie die Proben 15 min bis 1 h bei RT oder 34 °C ruhen.
  9. Resuspendieren Sie die Transformatoren (zwei oder drei) in ISE6-Zellen mit einer sterilen 2-ml-Barrierepipettenspitze, die an einem Pipettierer angebracht ist, und geben Sie sie in zwei oder drei 25-cm2-Zellkulturkolben mit 3,5 ml frischem Medium mit NaHCO3- und HEPES-Puffer. Alternativ können Sie eine sterile 2-ml-Pasteur-Pipette verwenden, die mit einem Gummikolben betrieben wird.
  10. Schaukeln Sie die Kolben, um die Mischung gleichmäßig zu verteilen, und inkubieren Sie sie dann bei 34 °C.
  11. Nach 16-24 h werden in Schritt 2.10 10 μl Spectinomycin (50 mg/ml) und 10 μl Streptomycin (50 mg/ml) in jeden Kolben gegeben.

3. Beobachtung des transformierten R. parkeri

HINWEIS: Verwenden Sie ein Epifluoreszenzmikroskop mit Rhodamin/TRITC-Filtern, um die in Schritt 2.11 hergestellten Kolben nach 3-7 Tagen zu beobachten. Sobald Plaques in den Kulturen sichtbar sind (5-14 Tage), kann man transformierte R. parkeri sehen, die das rot fluoreszierende Protein mKATE exprimieren, das auf dem pRAM18dSFA-Plasmid kodiert ist.

  1. Konfokale Mikroskopie
    1. Die Zellkulturen aus den Kolben der Stufe 2.11 werden resuspendiert und 100 μL dieser Zellkulturen mit 5 μL Hoechst 33342 Lösung für 10-30 min bei RT im Dunkeln gemischt.
      HINWEIS: Hoechst 33342 ist eine zelldurchlässige nukleare Gegenfärbung, die an lebende Zeckenzell-DNA bindet und blaue Fluoreszenz emittiert.
    2. 50 μL der Mischung werden mit einer Zentrifuge bei 5 × g für 3 min auf Glasobjektträger zentrifugiert.
    3. 3 μL 1x PBS an die Stelle der auf dem Objektträger abgelagerten Zellen geben, mit einem Deckglas überlagern und mit einem konfokalen Mikroskop (60x Objektiv) betrachten. Verwenden Sie die folgenden Anregungs- und Emissionsparameter für die Fluoreszenzbildgebung: für 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI), Anregung bei 350 nm, Emission bei 470 nm; für Tetramethylrhodamin (TRITC), Anregung bei 557 nm, Emission bei 576 nm.

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Ergebnisse

Die Morphologie von R. parkeri in ISE6-Zellen unter einem Lichtmikroskop nach Giemsa-Färbung ist in Abbildung 1 dargestellt. In Abbildung 2 sind transformierte R. parkeri , die rotes Fluoreszenzprotein in ISE6-Zellen exprimieren, mittels konfokaler Mikroskopie dargestellt. Es gibt einen erheblichen Anstieg der Infektionsrate von transformiertem R. parkeri (rot) in ISE6-Zellen (blau, entspricht den Kernen) von (A) Tag ...

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Diskussion

Hier demonstrieren wir eine Methode zur Einführung exogener DNA, die auf dem Shuttle-Plasmid pRAM18dSFA kodiert, in Rickettsien mittels Elektroporation. Bei diesem Verfahren wurden zellfreie Rickettsien von Wirtszellen gereinigt, mit einem Rickettsial-Shuttle-Vektor transformiert und zur Infektion auf Zeckenzellen freigesetzt. Ebenfalls beschrieben ist ein konfokales Immunfluoreszenzverfahren zum Nachweis von rotem Fluoreszenzprotein-exprimierendem R. parkeri in Zeckenzellen. Ähnliche Methoden sind auf andere ...

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Offenlegungen

Es werden keine Interessenkonflikte deklariert.

Danksagungen

Wir danken Timothy J. Kurtti und Benjamin Cull für ihre aufschlussreichen Diskussionen und Anregungen. Diese Studie wurde finanziell durch einen Zuschuss an U.G.M. vom NIH (2R01AI049424) und einen Zuschuss an U.G.M. von der Minnesota Agricultural Experiment Station (MIN-17-078) unterstützt.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1 cm gap gene pulser electroporation cuvetteBio-Rad1652083
2 μm pore size filter GE Healthcare Life Sciences Whatman6783-2520
5 mL Luer-lock syringe BD309646
60-90 silicon carbide grit LORTONE, inc 591-056
absolute methanol Fisher ScientificA457-4
Bacto tryptose phosphate broth BD260300
Cytospin centrifuge Cytospin4Thermo Fisher ScientificA78300003The rotor is detachable so the whole rotor can be put into the hood to load infectious samples
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)QIAGEN12362used to obtain endotoxin-free pRAM18dSFA plasmid
extended fine tip transfer pipet Perfector ScientificTP03-5301
fetal bovine serum Gemini Bio900-108The FBS batch has to be tested to make sure ISE6 cells will grow well in it.
Gene Pulser II electroporator with Pulse Controller PLUSBio-Rad165-2105 & 165-2110
hemocytometerThermo Fisher Scientific267110
HEPESMillipore-SigmaH4034
ImageJ FijiNational Institute of Healthraw image editing
KaryoMAX Giemsa stain Gibco 2021-10-30
Leibovitz's L-15 mediumGibco41300039
lipoprotein concentrate MP Biomedicals191476
Nikon DiaphotNikonepifluorescence microscope
NucBlue Live ReadyProbes Reagent Thermo Fisher ScientificR37605
Olympus Disc Scanning Unit (DSU) confocal microscope Olympus
Petroff-Hausser Counting ChamberHausser Scientific Chamber 3900
sodium bicarbonateMillipore-SigmaS5761
VortexFisher Vortex Genie 212-812

Referenzen

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