Resektion des poplitealen vaskulären Lymphknotens in der Hintergliedmaße des Kaninchens zur Induktion eines sekundären Lymphödems

Zusammenfassung

In dieser Arbeit wird die chirurgische Induktion eines stabilen erworbenen Lymphödems in der Hintergliedmaße des Kaninchens beschrieben. Mit diesem Versuchstier kann die Wirkung der Lymphödembehandlung mit mikrochirurgischen Techniken weiter untersucht werden.

Zusammenfassung

Lymphödeme sind eine häufige Erkrankung, die oft mit Krebs und seiner Behandlung in Verbindung gebracht wird und zu einer Schädigung des Lymphsystems führt, und die derzeitigen Behandlungen sind meist eher palliativ als kurativ. Die hohe Inzidenz bei onkologischen Patienten deutet auf die Notwendigkeit hin, sowohl die normale Lymphfunktion als auch die pathologische Dysfunktion zu untersuchen. Um chronische Lymphödeme zu reproduzieren, ist es notwendig, ein geeignetes Versuchstier auszuwählen. Versuche, Tiermodelle zu etablieren, sind durch die Regenerationsfähigkeit des lymphatischen Systems begrenzt. Unter den potenziellen Kandidaten ist die Kaninchen-Hintergliedmaße einfach zu handhaben und auf das klinische Szenario beim Menschen zu extrapolieren, was sie vorteilhaft macht. Darüber hinaus ermöglicht die Größe dieser Spezies eine bessere Auswahl der Lymphgefäße für die vaskularisierte Lymphknotenresektion.

In dieser Arbeit stellen wir ein Verfahren zur vaskulären Lymphknotenresektion in der Hintergliedmaße des Kaninchens zur Induktion eines sekundären Lymphödems vor. Anästhesierte Tiere wurden einer Umfangsmessung, einer Patentblau-V-Infiltration und einer Indocyaningrün-Lymphographie (ICG-L) mittels Echtzeit-Nahinfrarotfluoreszenz unterzogen, einer Technik, die die Identifizierung einzelner Kniekehlknoten und Lymphkanäle ermöglicht. Der Zugang zu den identifizierten Strukturen erfolgt durch die Exzidierung des Kniekehlenknotens und die Ligatur der medialen und lateralen afferenten Lymphgefäße. Besonderes Augenmerk muss darauf gelegt werden, dass jedes Lymphgefäß, das mit dem femoralen Lymphsystem im Oberschenkel verbunden ist, ohne in den Kniekehlenknoten einzudringen, identifiziert und ligiert werden kann.

Die postoperative Beurteilung erfolgte 3, 6 und 12 Monate nach der Einleitung anhand von Umfangsmessungen der Hintergliedmaße und des ICG-L. Wie in der Nachbeobachtung gezeigt wurde, entwickelten die Tiere einen dermalen Rückfluss, der bis zum 12^. Monat aufrechterhalten wurde, was dieses Versuchstier für neuartige Langzeitbewertungen bei der Behandlung von Lymphödemen nützlich macht. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der hier beschriebene Ansatz machbar und reproduzierbar ist. Darüber hinaus kann es während des vorgestellten Zeitfensters repräsentativ für das menschliche Lymphödem sein und somit ein nützliches Forschungsinstrument darstellen.

Einleitung

Das Lymphödem ist eine chronische Erkrankung, die aufgrund ihrer weltweiten Inzidenz, des Mangels an kurativer und standardisierter Behandlung und der schwerwiegenden Auswirkungen auf die Lebensqualität der Patienten besondere Aufmerksamkeit verdient ^1,2.

In den Industrieländern wird das Lymphödem aufgrund der hohen Prävalenz dieser bösartigen Erkrankung hauptsächlich erworben und ist sekundär zu Brustkrebs. Die kumulative Inzidenz von Brustkrebs-bedingten Lymphödemen 10 Jahre nach der Operation kann bis zu 41,1 %³ erreichen. Aber auch Krankheiten wie Melanome, gynäkologische Krebserkrankungen, Urogenitaltumoren und Kopf-Hals-Neoplasien sind mit einer hohen Inzidenz dieser Krankheit verbunden⁴. Die regionale Lymphknotenresektion als Teil der notwendigen onkologischen Behandlung zur Erhöhung der Überlebensraten führt zu einer Störung der funktionellen Lymphdrainage. In einigen Fällen ergeben sich daraus kompensatorische Mechanismen, die das Auftreten von Lymphödemen verhindern oder verzögern⁵. Wenn jedoch Chemo- und Strahlentherapie verabreicht werden, sind diese Mechanismen nicht in der Lage, die Veränderung zu kompensieren, und es kommt zu einem Lymphödem. Dies wirkt sich negativ auf die Lebensqualität der Patientinnen und Patienten aus und beeinträchtigt ihr funktionelles, soziales und psychisches Wohlbefinden ^6,7.

Die Notwendigkeit einer wirksamen Heilung von Lymphödemen erfordert ein Verständnis der Physiopathologie des Lymphsystems sowie einen tiefen Einblick in die komplexen zellulären Mechanismen und ihre Reaktionen sowohl im normalen als auch im dysfunktionalen lymphatischen System ^8,9,10. Solche Erkenntnisse lassen sich zunächst aus experimentellen Tiermodellen gewinnen, die chronische Krankheiten des Menschen reproduzieren können¹¹.

Es wurden viele Versuche unternommen, Lymphödeme in experimentellen Tiermodellen zu replizieren; Die meisten von ihnen wurden jedoch durch einige Einschränkungen behindert, darunter die Unfähigkeit, chronische lymphatische Insuffizienz in einem stabilen Tiermodell zu reproduzieren, die Kosten der Studie und vor allem die große Regenerationsfähigkeit des lymphatischen Systems, die es ihm ermöglicht, die Durchblutung wiederherzustellen^12,13.

In dieser Arbeit wird der experimentelle Ansatz zur chirurgischen Induktion eines stabil erworbenen Lymphödems anhand der Hintergliedmaße des Kaninchens vorgestellt. Basierend auf einer Literaturrecherche kann dieses Tier als optimal für die Entwicklung eines Lymphödems angesehen werden, da es eine konsistente Anatomie seines Lymphsystems der Hintergliedmaßen aufweist, das einen einzigen Kniekehlknoten umfasst, der die Hintergliedmaßen entwässert und das hauptfemorale Lymphsystem im Bein erreicht^14,15.

Die spezifische Anatomie der Hintergliedmaßen des Kaninchens ermöglicht die Reproduktion der chirurgischen Eingriffe, die beim Menschen durchgeführt werden, um ein sekundäres Lymphödem zu induzieren. Daher kann dieses Verfahren für die mikrochirurgische Ausbildung und die präklinische Forschung genutzt werden, um die Ergebnisse auf die Humanmedizin zu übertragen.

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Protokoll

Alle Eingriffe wurden von der Ethikkommission des Zentrums für minimalinvasive Chirurgie Jesús Usón und den Tierschutzrichtlinien der Regionalregierung, die auf der europäischen Gesetzgebung basieren, genehmigt.

1. Präoperative und chirurgische Vorbereitung

1. Beherbergen Sie neun weibliche neuseeländische weiße Kaninchen mit einem Gewicht von 4-4,5 kg und einem Alter von 4 Monaten in separaten Käfigen, die bei einer Temperatur von 22-25 °C gehalten werden und freien Zugang zu Futter und Wasser haben. Achten Sie darauf, dass die Käfige eine Polysulfonwanne mit einer Grundfläche von 3 m² und einer Höhe von 40 cm sowie ein Bett mit Holzspänen enthalten.
   1. Identifizieren Sie die Käfige mit dem Projektcode und der Tieridentifikationsnummer.
   2. Akklimatisieren Sie die Tiere 1 Woche vor der Operation, um stressbedingte Probleme zu vermeiden. Sammeln Sie präoperative Laborwerte von Blutproben, um sicherzustellen, dass jedes Tier vor der Anästhesie bei guter Gesundheit ist.
2. Stellen Sie sicher, dass alle Kaninchen vor jedem chirurgischen Eingriff 12 Stunden fasten.
   1. Nach der Prämedikation die Kaninchen mit einer Gesichtsmaske (Hall-Maske) für 5 min mit 100% Sauerstoff und einem Frischgasfluss von 3-5 L/min präoxygenieren. Führen Sie die Co-Induktionsphase mit Midazolam (0,3 mg/kg) und Propofol (10 mg/kg) intravenös durch.
3. Intubieren Sie die Kaninchen mit 3,0-3,5 Endotrachealtuben mit Pneumotaponation, die an einen halbgeschlossenen Kreislauf angeschlossen sind, der mit einem Beatmungsgerät verbunden ist, dessen Frischgasstrom zunächst 5 Minuten lang 1 l/min beträgt und anschließend auf 0,5 l/min eingestellt wird.
   1. Führen Sie eine Erhaltungsanästhesie durch Inhalation von Sevofluran in einer Konzentration von 3 % bis 3,5 % durch, die auf dem Verdampfer eingestellt ist.
4. Verabreichen Sie den anästhesierten Kaninchen während des gesamten chirurgischen Eingriffs eine kontinuierliche Infusion von Ringer-Laktatlösung (2-4 ml/kg/h) durch die marginale Vene des Ohrs.
   1. Verwenden Sie eine schützende Augensalbe, um die Augenoberfläche zu schützen.
5. Überwachung der Vollnarkose: Verwenden Sie ein Rektalthermometer, um die Temperatur bei 38,7-39,7 °C zu überwachen, untersuchen Sie die Schleimhautfarbe und überwachen Sie die_{O2-Sättigung}bei >95 % und die Herzfrequenz bei 180-240 Schlägen pro Minute mit einem Kaninchen-Pulsoximeter.
6. Platzieren Sie eine thermische Stütze, damit das Tier während des gesamten Eingriffs eine konstante Temperatur beibehält.
7. Verabreichen Sie Ketorolac (1,5 mg/kg) plus Tramadol (3 mg/kg) intravenös zur intraoperativen Analgesie.
8. Verabreichen Sie Antibiotika (7,5 mg/(kg∙Tag) Enrofloxacin subkutan [s.c.]) vor der Operation und 5 Tage nach der Operation sowie postoperative Analgesie (10 μg/(kg∙Tag) Buprenorphin s.c.) für 5 Tage.
9. Bringen Sie die Kaninchen in Rückenlage und rasieren Sie die Hintergliedmaßen und die Leistengegend des Tieres. Legen Sie das Tier in die Rücken-/Rückenlage und schneiden Sie die Haare von den Hintergliedmaßen und der Leistengegend ab.
10. Führen Sie eine Hautantisepsis durch, indem Sie 0,5 % Chlorhexidin und 70 % Ethanol auf die zuvor rasierte Haut auftragen. Sobald der Bereich desinfiziert ist, decken Sie das Kaninchen mit einem sterilen Tuch ab, mit Ausnahme der linken Hintergliedmaßen.

2. Resektion der Kniekehle vaskulärer Lymphknoten (Abbildung 1)

1. Infiltrieren Sie 0,2-0,3 ml Indocyaningrün (ICG) intradermal in den zweiten und dritten Interdigitalraum der linken Hintergliedmaße. Massieren, beugen und strecken Sie die hintere Gliedmaße einige Minuten lang, um die Aufnahme des Farbstoffs in die Lymphgefäße zu erleichtern. Verwenden Sie die kontralaterale Extremität als Kontrolle.
2. Verwenden Sie eine Echtzeit-Nahinfrarot-Fluoreszenzkamera, um die Lymphgefäße, die sich auf Kniehöhe kreuzen, und den Kniekehlenlymphknoten (PLN) auf der Haut zu visualisieren und zu markieren (mit einem chirurgischen Marker) (Abbildung 2).
3. Injizieren Sie Patentblau V (0,2 mL) in den interdigitalen Bereich zur anschließenden Identifizierung der Lymphgefäße und Lymphknoten.
4. Sobald der PLN mit einer Echtzeit-Nahinfrarot-Fluoreszenzkamera identifiziert wurde (Abbildung 3), erstellen Sie einen 2 cm langen Schnitt in der Mitte der Kniekehlegrube, längs der Längsachse der Hintergliedmaße durch die Sitzbeinvene, die durch die Haut sichtbar ist.
   1. Um mit der Echtzeit-Nahinfrarot-Fluoreszenzkamera Echtzeit-Panoramabilder des Lymphsystems zu erhalten, verwenden Sie den optischen Kopf, der mit einem Laser der Klasse 1 als Anregungslichtquelle und einer Nahinfrarot-empfindlichen Kamera vom Knöchel bis zum Knie der Hintergliedmaße des Tieres ausgestattet ist.
   2. Visualisieren Sie die Lymphgefäße oberhalb der Muskelfaszie, indem Sie das Unterhautfettgewebe resezieren⁵. Die Lymphgefäße erscheinen aufgrund der Patentblau-V-Färbung in Schritt 2.3 blau.
   3. Verwenden Sie eine mikrochirurgische Pinzette, um den Schnitt zu dehnen und den PLN, einschließlich der vaskulären und afferenten Lymphstiele, freizulegen. Sorgen Sie für eine klare Sichtbarkeit aller lymphatischen und vaskulären Strukturen (Abbildung 4).
   4. Identifizieren Sie den PLN mit einem Durchmesser von 0,8 mm unter der Sitzbeinvene und zwischen dem Musculus biceps femoris und der Musculus colessehne medialis.
5. Identifizieren Sie die beiden wichtigsten Lymphgefäße auf der medialen Seite des PLN. Diese Gefäße befinden sich parallel zur distalen Vena saphena und teilen sich in ein Netzwerk von Mikrogefäßen, wenn sie sich dem PLN nähern (Abbildung 5).
6. Präparieren Sie den Lymphknotenstiel und vermeiden Sie gleichzeitig eine Schädigung des umgebenden Gewebes und der Gefäße (Abbildung 6).
7. Lital verschließen Sie die Arteria medialis (einen Ast der Arteria poplitea) und die Vena saphena lateralis distal und proximal mit nicht resorbierbaren Nähten aus 10/0 Nylon.
8. Identifizieren und kauterisieren Sie die beiden Gruppen afferenter Lymphgefäße, die direkt mit dem femoralen Lymphsystem im Oberschenkel verbunden sind, aber nicht in das PLN eintreten (Abbildung 7).
   HINWEIS: Die erste Gruppe entspricht den medialen afferenten Lymphgefäßen, die die Lymphe aus dem Oberschenkel und der Wade ableiten. Die zweite Gruppe besteht aus Lymphgefäßen in der Muskulatur der unteren Extremitäten. Diese Gefäße verlaufen entlang des Musculus gastrocnemius, zusammen mit der Vena saphena.
9. Bestätigen Sie die vollständige Störung des Lymphsystems durch Wiederholung der Nahinfrarot-Fluoreszenzbildgebung in Echtzeit.
10. Umliegendes Fettgewebe vollständig entfernen, um eine mögliche Lymphangiogenese zu vermeiden.
11. Vernähen Sie den Hautschnitt mit 4-0 Polyglykolsäure (PGA) resorbierbaren geflochtenen Nähten (mit einer 16 mm 3/8 Dreiecksnadel) unter Verwendung eines kontinuierlichen intradermalen Musters, um eine postoperative Autoverstümmelung zu vermeiden.
12. Halten Sie die Kaninchen nach der Operation einzeln in Käfigen; Bewahren Sie sie unter Aufsicht und bei einer Raumtemperatur zwischen 16 und 22 °C auf.

3. Postoperative Bewertung

1. Führen Sie postoperative Untersuchungen 3, 6 und 12 Monate nach der Induktion durch.
2. Betäuben Sie die Kaninchen nach den zuvor verwendeten Schritten (Schritte 1.2-1.7).
3. Messen Sie den Umfang der Hinterbeine der anästhesierten Kaninchen mit einem Maßband. Nehmen Sie alle 2 cm Maße, wobei der erste Punkt am Knöchel und der letzte am Knie liegt. Berechnen Sie das Gesamtvolumen mit der Formel für den Kegelstumpf.
4. Verwenden Sie die Indocyaningrün-Lymphographie (ICG-L) zur Beurteilung der Lymphfunktion.
   1. Infiltrieren Sie 0,2-0,3 ml ICG intradermal in den zweiten und dritten Interdigitalraum und massieren Sie es 1 Minute lang sanft ein, um die ICG-Aufnahme in die Lymphgefäße zu erleichtern.
5. Erfassen Sie Bilder nach 15 Minuten mit dem Nahinfrarot-Fluoreszenzsystem, um den dermalen Rückfluss zu beurteilen.
6. Sobald die Nachuntersuchungen abgeschlossen sind, euthanasieren Sie das Kaninchen nach dem gleichen Anästhesieprotokoll, das bei der Intervention verwendet wurde. Sobald die gewünschte Anästhesieebene erreicht ist, verabreichen Sie intravenös Kaliumchlorid in die Ohrvene mit einer durchschnittlichen Rate von 2 meq/kg.

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Ergebnisse

Neun Kaninchen wurden in dieser Studie einer Lymphödem-Induktion unterzogen, drei Kaninchen starben jedoch in der unmittelbaren postoperativen Phase und konnten nicht untersucht werden. Die Studiendaten wurden 3, 6 und 12 Monate postoperativ von drei unabhängigen Forschern erhoben. Unter Vollnarkose wurden zirkumferenzielle Messungen der hinteren Gliedmaßen und ICG-L durchgeführt, um die Funktion des lymphatischen Systems und den dermalen Rückfluss zu beurteilen.

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Diskussion

Die Resektion des PLN an einem Versuchstier ist ein relativ neues Verfahren, das ein sekundäres Lymphödem in den Gliedmaßen zur Beurteilung und Untersuchung induzieren kann. Nach der Lymphknotenresektion kommt es zu einer Periode der Veränderung der Funktionalität des Lymphsystems, der Lymphansammlung und der histologischen Veränderungen der Lymphgefäße, die erweitert erscheinen. Wenn diese Lymphansammlung ein angemessenes Niveau erreicht, kann der charakteristische dermale Rück...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bleu Patente V sodique (Guerbet)	Guerbet. Villepinte, France		2.5 g/100 mL
Buprenorphine (Bupaq)	Richter Pharma. Wels, Austria	0820645AA	3 mg/10 mL
Fluobeam	Fluoptics. Grenoble, France		Fluorescence imaging
IBM SPSS software	IBM	version 21.0
Indocyanine green (Verdye, Diagnostic Green GmbH)	Diagnostic Green GmbH. Aschheim-Dornach, Germany		5 mg/mL
Ketorolaco  (Normon)	Normon, S.A. Madrid, Spain	T01H	30 mg/mL
Microsoft Excel	Microsoft	version 16.66.1
Midazolam (Normon)	Normon, S.A. Madrid, Spain	T35M	15 mg/3 mL
Pentero 800 microscope, fluorescence module	Carl Zeiss Meditec AG. Goeschwitzer Strasse 51-52. Jena, Germany	302581-9245-000
Potassium chloride (Braun)	B.Braun. Barcelona, Spain	19262010	20 mmol/10 mL
Propofol (Propomitor, Orion Pharma)	Orion Pharma. Spoo, Finland	20R039B	200 mg/20 mL
RÜSCH endotracheal tubes	Teleflex Medical IDA Business and Technology Park. Athione, Ireland.	12CE 12	Size Tube 4.0 I.D. mm
Sevoflurano (SevoFlo, Zoetis)	Zoetis Belgium. Luvain-la-Neuve, Belgium	6093559	1000 mg/g (250 mL)
Tramadol (Normon)	Normon, S.A. Madrid, Spain	T08U	100 mg/2 mL