Eine Intragewebe-Radiometrie-Mikrosonde zur Messung der Strahldichte in situ in lebendem Gewebe

Zusammenfassung

In dieser Arbeit wird eine Methode zur Messung der Strahldichte in situ in lebendem Gewebe beschrieben. Diese Arbeit enthält Details zum Aufbau von mikroskaligen Sonden für verschiedene Messungen von Strahldichte und Bestrahlungsstärke, bietet Anleitungen für die Montage von Gewebe zur Charakterisierung der Strahldichte und skizziert Berechnungsmethoden zur Analyse der resultierenden Daten.

Zusammenfassung

Organismen erscheinen vor allem deshalb undurchsichtig, weil ihre äußeren Gewebeschichten stark an einfallendem Licht gestreut werden; Stark absorbierende Pigmente, wie z. B. Blut, haben typischerweise eine enge Absorption, so dass der mittlere freie Weg des Lichts außerhalb der Absorptionsspitzen recht lang sein kann. Da Menschen nicht durch Gewebe hindurchsehen können, stellen sie sich im Allgemeinen vor, dass Gewebe wie Gehirn, Fett und Knochen wenig oder gar kein Licht enthalten. Photoresponsive Opsin-Proteine werden jedoch in vielen dieser Gewebe exprimiert, und ihre Funktionen sind nur unzureichend verstanden. Auch die Strahlkraft im Gewebe ist wichtig für das Verständnis der Photosynthese. Zum Beispiel sind Riesenmuscheln stark absorbierend, halten aber eine dichte Algenpopulation tief im Gewebe aufrecht. Die Lichtausbreitung durch Systeme wie Sedimente und Biofilme kann komplex sein, und diese Gemeinschaften können einen wichtigen Beitrag zur Produktivität von Ökosystemen leisten. Daher wurde eine Methode zur Konstruktion optischer Mikrosonden zur Messung der skalaren Bestrahlungsstärke (Photonenfluss, der einen Punkt schneidet) und der Abwärtsbestrahlungsstärke (Photonenfluss, der eine Ebene senkrecht durchquert) entwickelt, um diese Phänomene im lebenden Gewebe besser zu verstehen. Diese Technik ist auch in Feldlaboren umsetzbar. Diese Mikrosonden bestehen aus wärmegezogenen Lichtwellenleitern, die dann in gezogenen Glaspipetten befestigt werden. Um die Winkelakzeptanz der Sonde zu verändern, wird dann eine 10-100 μm große Kugel aus UV-härtendem Epoxidharz, gemischt mit Titandioxid, am Ende einer gezogenen, getrimmten Faser befestigt. Die Sonde wird in lebendes Gewebe eingeführt und ihre Position wird mit einem Mikromanipulator kontrolliert. Diese Sonden sind in der Lage, die Strahldichte von Gewebe in situ mit einer räumlichen Auflösung von 10-100 μm oder auf der Skala einzelner Zellen zu messen. Diese Sonden wurden verwendet, um das Licht zu charakterisieren, das die Fett- und Gehirnzellen 4 mm unter der Haut einer lebenden Maus erreicht, und um das Licht zu charakterisieren, das ähnliche Tiefen in lebendem algenreichem Riesenmuschelgewebe erreicht.

Einleitung

Überraschenderweise haben Landtiere und flache Meeresbewohner genug Licht in ihrem Körper für die visuelle Physiologie und sogar die Photosynthese. Zum Beispiel werden die Lichtverhältnisse in der Mitte des Kopfes einer Maus (außerhalb der starken Hämoglobinabsorptionsbänder) um drei oder vier Größenordnungen relativ zur Außenwelt abgeschwächt. Dies entspricht in etwa der Unterschied zwischen den Lichtverhältnissen im Innen- und Außenbereich. Die Opazität eines Gewebes oder Materials aufgrund starker Streuung ist also nicht dasselbe wie die Opazität aufgrund starker Lichtabsorption. Licht kann sich in einem stark vorwärtsstreuenden System über große Entfernungen ausbreiten, ähnlich wie Licht, das sich durch aquatische Systeme mit hohen Konzentrationen von Zellen und Partikeln ausbreitet¹. Diese Beobachtung ist besonders auffallend vor dem Hintergrund, dass Opsin-Proteine nahezu ubiquitär in allen Geweben aller Tiere exprimiert werden. Daher ist es wichtig zu verstehen, wie und wo Licht im lebenden Gewebe abgeschwächt und gestreut wird. Im Gegensatz zu aquatischen Systemen mit lebendem Gewebe ist es jedoch unmöglich, ein Instrument in die Wassersäule einzutauchen und Strahlungs- und Bestrahlungsstärkemessungen durchzuführen, und es ist eine neue Technik erforderlich.

Andere Methoden, die bisher zur Charakterisierung der Absorptions- und Streueigenschaften von lebendem Gewebe verwendet wurden, umfassen die Messung von Gewebereflexionssonden und/oder Ulbrichtschen Kugeln^2,3, mikroskopische Methoden wie die konfokale Rastermikroskopie^4, die Messung der Streuung von Laserlicht auf der Oberfläche⁵ und Modellierungstechniken wie der Monte-Carlo-Strahlungstransfer⁶. Die genannten experimentellen Methoden erfordern oft spezifische, große und teure Geräte oder detaillierte Kenntnisse über die Gewebestruktur und sind in der Regel nur begrenzt in ihrer Fähigkeit, die räumliche Struktur des Lichts tief im Gewebe zu charakterisieren.

Es gibt auch ähnliche sondenbasierte Verfahren, bei denen eine Injektionsnadel verwendet wird, um eine optische Faser durch Gewebe einzuführen ^7,8,9. Unserer Erfahrung nach sind modifizierte Nadeln wirksam beim Durchstechen von Gewebe, erfordern jedoch erhebliche Kraft und reißen im Allgemeinen empfindliches Gewebe auf, wenn sie durch dicht gepackte Zellen gelangen. Daher erfordern diese Nadeln in der Regel einen chirurgischen Eingriff, bei dem mehr als ein Millimeter oder so in eine Gewebeschicht eingeführt wird. Die hier beschriebene Methode, bei der ein geschmierter, gezogener Glasträger verwendet wird, ist in der Lage, mit minimaler Verletzung des Gewebes und ohne zusätzliche Operation zwischen den Zellen zu gleiten.

Dieses Manuskript stellt eine Methode vor, die von der Arbeit von Jorgenson und Kollegen zur Messung von Licht in Algenmatten^10,11 inspiriert ist^, wobei glasgestützte optische Mikrosonden und tragbare Elektronik verwendet werden, die für die Untersuchung tief in dichtes Gewebe und für die Konstruktion und den Einsatz im Feld geeignet sind. Diese Sonden können so konstruiert werden, dass sie die skalare Bestrahlungsstärke (Licht, das aus allen Richtungen auf einen Punkt trifft) und die abwärts gerichtete Strahldichte (Licht, das eine horizontale Ebene schneidet) in lebendem Gewebe mit hoher räumlicher Auflösung charakterisieren. Diese Sonden wurden ursprünglich entwickelt, um den Strahlungstransport im Gewebe photosymbiotischer Riesenmuscheln^{zu messen 12}. Standardmessungen der Absorption und Transmission des gesamten Gewebes reichten nicht aus, um die Photosyntheseleistung des Gewebes zu charakterisieren, da es einen großen Unterschied macht, ob das gesamte einfallende Licht von einigen wenigen Zellen absorbiert wird, die eine hohe Intensität an der Oberfläche des Gewebes aufweisen, oder von vielen Zellen, die eine geringe Intensität im gesamten Volumen des Gewebes aufweisen. In einem zweiten Projekt wurden diese Sonden verwendet, um die In-vivo-Bestrahlungsstärke im Gehirn einer Maus zu messen^13,14 und so die Lichtumgebung von Opsinen zu charakterisieren, die tief im Gehirn exprimiert werden. Diese Mikrosonden sind sowohl klein als auch empfindlich genug, um die Bestrahlungsstärke im Gehirngewebe von Mäusen mit intaktem Fell, Haut und Knochen zu messen und zu zeigen, dass die physiologischen Lichtstärken leicht hoch genug sind, um die Opsine im tiefen Gehirn zu stimulieren.

Diese mikrooptische Sonde und der Messaufbau könnten für Forscher nützlich sein, die das Licht im Inneren von biologischem Gewebe quantifizieren und charakterisieren müssen, insbesondere für ein nuancierteres Verständnis der Photosynthese oder der Funktionen von Sehpigmenten, die außerhalb der Augen exprimiert werden. Diese Methode kann allein oder in Verbindung mit anderen Techniken verwendet werden, um die optischen Eigenschaften und die Lichtausbreitung in lebendem Gewebe zu geringen Kosten vollständig zu charakterisieren, mit kleinen, tragbaren Geräten, die im eigenen Haus gebaut werden, und mit aufgabenabhängig einstellbaren Parametern.

Protokoll

Diese Studie entspricht allen relevanten ethischen Vorschriften der Yale University in Bezug auf die Forschung an Wirbeltieren und wirbellosen Tieren.

1. Aufbau der optischen Mikrosonde

1. Aufbau der Glashülse, Material: Pasteurpipette, 5,75 Zoll (siehe Materialtabelle)
   1. Montieren Sie die Glaspipette mit einer montierbaren Krokodilklemme (Materialtabelle) am breiten Ende, so dass das sich verjüngende Ende nach unten zum Boden zeigt und die Ausrichtung der Pipette senkrecht zum Boden ist.
   2. Hängen Sie einen 50 g schweren Kunststoff-Schraubstockgriff (Materialtabelle) an das sich verjüngende Ende der Pipette. Legen Sie ein Polster aus Isolierband zwischen die Pipette und den Schraubstockgriff, um ein Verrutschen zu verhindern.
   3. Erhitzen Sie das konische Ende der Pipette mit einem kleinen Butangasbrenner (Materialtabelle). Setzen Sie die Flamme 1 cm über dem Schraubstockgriff auf. Halten Sie die Fackel so, dass der hellste Teil der Flamme 3 cm vom Glas entfernt ist und sich das Glas an der Spitze der Flamme befindet. Wenn die Länge der Pipette um etwa 5 Zoll zugenommen hat, entfernen Sie sofort die Flamme.
   4. Verwenden Sie eine kleine Schere oder einen Glasschneider, um das gezogene Ende der Pipette an der Stelle zu kürzen, an der der neue gezogene Durchmesser etwa doppelt so groß ist wie der der im nächsten Abschnitt verwendeten Glasfaser (siehe Schritt 1.2). Feilen Sie alle scharfen Stellen des abgeschnittenen Endes mit Carborundumpapier ab (Materialtabelle). Spülen Sie alle entstandenen kleinen Glasscherben oder Staub mit einer Spritzflasche mit Isopropylalkohol und anschließender Druckluft ab.
2. Ziehen der Glasfaser (Abbildung 1D)
   1. Verwenden Sie eine Rasierklinge, um die Glasfaser zu durchtrennen, und entfernen Sie einen SMA-Stecker einer SMA-terminierten Glasfaser mit einem Durchmesser von 200 μm (Tabelle der Materialien). Schneiden Sie in der Nähe eines der SMA-Anschlüsse ab. Entfernen Sie dann mit der Rasierklinge die nächsten 5 cm Kunststoff- und Glasfaserummantelung, so dass die blanke Glasfaser freigelegt wird und aus dem Rest der intakten Baugruppe herausragt.
   2. Verwenden Sie den Butangasbrenner, um die Polyimid-Polymerbeschichtung von der Glasfaser abzubrennen. Mit Isopropanol abspülen. Wischen Sie die blanke Glasfaser mit einem fusselfreien Tuch sauber.
   3. Der nächste Schritt besteht darin, die blanke Faser so zu montieren, dass sie auch mit einer Flamme gezogen werden kann. Montieren Sie das blanke Ende der Glasfaser direkt in einer Zangenklemme (Table of Materials) an einer Tisch- oder Regalkante, wobei das SMA-terminierte Ende der Faser zum Boden hin hängt. Fügen Sie die Gewichte zum Ziehen in Form von zwei kleinen Klemmen (Gesamtgewicht: 10 g) am ummantelten Ende der Faser hinzu, etwa 12 Zoll von der Stelle entfernt, an der die blanke optische Faser in der Zangenklemme gehalten wird.
   4. Um die Faser zu ziehen, beginnen Sie mit der Flamme des Butangasbrenners. Halten Sie den Butangasbrenner bei eingeschalteter Flamme 1 cm von der blanken Faser entfernt, so dass die Flamme senkrecht zur Glasfaser steht, und 3 cm senkrecht von der Stelle, an der die Zangenklemme die blanke Faser hält. Lassen Sie die Faser dehnen, ziehen, trennen und auf den Boden fallen.
   5. Untersuchen Sie das resultierende gezogene Glasfaserende. Unebenheiten vorsichtig mit Carborundpapier abschleifen, mit Isopropylalkohol und einem fusselfreien Tuch reinigen und mit Druckluft trocknen.
      HINWEIS: An dieser Stelle kann man ein Mikroskop verwenden, um die Größe und Form der gezogenen Faser zu charakterisieren und zu dokumentieren.
   6. Verwenden Sie einen filmdichten Stift, um die Seiten der Faser abzudunkeln und das Eindringen von Streulicht zu verhindern (Materialtabelle). Ziehen Sie die Faser vorsichtig über die Spitze des Stifts und lassen Sie nur einen kleinen Bereich an der Spitze unbedeckt.
3. Montage der gezogenen Faser in der Glaspipettenhülse (Abbildung 1A)
   1. Führen Sie unter einem Stereomikroskop vorsichtig die konische optische Faser aus Schritt 1.2 in das breite Ende der veränderten Glaspipette aus Schritt 1.1 ein und schieben Sie die Faser durch, bis ~ 1 mm blanke Faser aus dem konischen Ende der Pipette herausragt.
   2. Befestigen Sie das ummantelte Ende der Glasfaser mit Isolierband am breiten Ende der Pipette.
   3. Geben Sie einen Tropfen Cyanacrylatkleber auf eine kleine Nadel (Materialtabelle). Berühren Sie vorsichtig den Tropfen Klebstoff an der Schnittkante der gezogenen Pipette und vermeiden Sie dabei das blanke Ende der gezogenen Faser.
   4. Lassen Sie den Klebstoff durch Kapillarwirkung in die Pipette leiten und benetzen Sie den Bereich zwischen der Pipettenwand und der Glasfaser. Lassen Sie den Klebstoff mindestens 15 Minuten aushärten, bevor Sie die Sondenbaugruppe bewegen.
4. Modifizieren der Faserspitze mit einer Streukugel (Abbildung 1C)
   1. Erzeugen Sie das Rohmaterial für die Streukugelspitze, indem Sie einen Tropfen UV-härtenden Klebstoffs mit Titandioxidpulver (Materialtabelle) bei ~1:1 v/v mischen.
   2. Befestigen Sie die Sonde an einem Mikromanipulator mit einem Montagestangenhalter (Materialtabelle), so dass sich die Sonde in horizontaler Ausrichtung befindet. Bereiten Sie ein Arbeitsreservoir des Streumaterials vor, indem Sie die Spitze eines Drahtes oder einer Nadel in das oben hergestellte Klebstoff/_TiO2-Gemisch tauchen, so dass sich ein Klebstofftröpfchen bildet. Montieren Sie den Draht oder die Nadel mit dem Tropfen in der Nähe der Spitze der horizontalen Sonde. Es ist praktisch, dies mit einem Krokodilclip zu tun, der an der Bank montiert ist.
   3. Legen Sie eine Streukugel auf die Spitze der Sonde. Verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Spitze der optischen Faser der Sonde langsam und vorsichtig in das Tröpfchen von Klebstoff/_{TiO 2} zu drücken. Ziehen Sie dann die Spitze schnell vom Kleber ab. Wiederholen Sie dies zwei- bis dreimal, bis sich ein kugelförmiger Klebstofftropfen der gewünschten Größe an der Spitze der Glasfaser ablagert.
      Anmerkungen: Die Streukugel ist bei Durchmessern stabil, die zwei- bis achtmal größer sind als der Durchmesser der sich verjüngenden Glasfaser. Die endgültige optimale Größe hängt von der endgültigen gewünschten Anwendung ab.
   4. Härten Sie die Kugel aus, indem Sie das SMA-terminierte Ende der Glasfaser mit einer fasergekoppelten UV-Lichtquelle verbinden (Materialtabelle).
      HINWEIS: Die in dieser Studie verwendete Lichtquelle hatte eine Leistung von 5,3 mW. Bei dieser Leistung beträgt die empfohlene Aushärtungszeit mindestens 12 h oder über Nacht. Nach dem Aushärten ist ein guter Zeitpunkt, um die Größe der endgültigen optischen Sondenspitze zu charakterisieren und zu messen.

2. Vorbereiten und Montieren des Gewebes für optische Messungen (Abbildung 2 und Abbildung 3)

1. Bereiten Sie das Geschirr vor, um die Proben für ein Experiment zu montieren. Erhitzen Sie das große Ende einer Pasteurpipette mit einem Butangasbrenner, um einen Loch zu machen, um ein Loch mit einem Durchmesser von 0,5 cm im Boden einer 35 mm x 10 mm großen Kunststoff-Petrischale zu schmelzen. Verschließen Sie das Loch an der Unterseite der Schale mit Isolierband oder Laborklebeband. Machen Sie mehrere auf einmal, um die Effizienz zu steigern.
2. Flüssiggelatine (Materialtabelle) gemäß den Anweisungen auf der Packung zubereiten.
   Anmerkungen: Kommerzielle geschmacksneutrale Gelatine in Lebensmittelqualität aus dem Lebensmittelgeschäft ist für diesen Zweck besser geeignet als Gelatine in chemischer Qualität von Chemikalienlieferanten, da die Gelatine in chemischer Qualität optisch weniger klar und mechanisch weniger zuverlässig ist als das Lebensmittelprodukt.
3. Führen Sie die Präparation und Präparation des zu verwendenden Gewebes durch.
   HINWEIS: Erfahrungsgemäß kann in diesem Experiment jedes flache Gewebe mit einer Dicke von bis zu 1 cm mit jeder für das interessierende System geeigneten Präpariertechnik erfolgreich gemessen werden. Für Riesenmuschelgewebe wurde eine 8-mm-Biopsiestanze verwendet, um einen flachen, regelmäßigen Kreis aus Muschelgewebe für die Verwendung im Experiment^{herzustellen 12}. Für dieses System konnte jeweils nur eine Probe effektiv präpariert werden, da die Zeit für die Durchführung einer Messung erforderlich war, um sicherzustellen, dass sich die Probe am Ende des Experiments noch in einem lebensechten Zustand befand.
4. Füllen Sie zwei Petrischalen aus Schritt 2.1 zu einem Viertel mit der flüssigen Gelatine und lassen Sie sie kurz vor der Gelierung auf Raumtemperatur (RT) abkühlen. Legen Sie die Biopsie in eine Schale in das Polster aus zähflüssiger Gelatine, das sich in dem Loch am Boden der Schale bildet. Verwenden Sie eine Pasteurpipette, um RT-Gelatine vorsichtig um die Biopsie herum hinzuzufügen, bis die Petrischale voll ist (Abbildung 3). Füllen Sie die zweite Schale mit Gelatine, um eine leere Probe herzustellen.
5. Stellen Sie die Probenschalen für ca. 10-30 Minuten in den Kühlschrank, bis die Gelatine vollständig ausgehärtet ist und sich leicht elastisch anfühlt.
   Anmerkungen: In einem kühlen Raum ist dies möglicherweise nicht erforderlich. Bei der Arbeit in den Tropen ist dieser Schritt erforderlich, um die Gelatine vollständig auszuhärten.
6. Herstellen einer Halterung für die Petrischale am Mikromanipulator (Abbildung 2)
   1. Schneiden Sie ein 6 cm x 6 cm großes Quadrat von 1/4 in dickes Plexiglas (Materialtabelle).
   2. Bohren oder schmelzen Sie ein Loch in das Kunststoffquadrat mit dem gleichen Durchmesser wie die Petrischale (~35 mm). Stellen Sie sicher, dass die Petrischale genau in diesem Loch sitzt und durch Reibung an Ort und Stelle gehalten wird. Fügen Sie Klebeband an den Rändern der Schale hinzu, um die Größe und den Reibungskontakt leicht zu erhöhen.
   3. Bohren oder schmelzen Sie ein Loch mit einem Durchmesser von 1/4 in die Ecke des Kunststoffquadrats. Verwenden Sie dieses Loch, um das Quadrat mit einer 1/4-Zoll-Schraube und einem Bolzen am Mikromanipulator zu befestigen.
   4. Decken Sie das Kunststoffquadrat mit schwarzem Isolierband ab, um das Streulicht zu reduzieren, das die Sonde erreicht. Verwenden Sie in ähnlicher Weise Klebeband, um eine Schürze um die Seiten des Quadrats zu erstellen, die sich unter den Boden der eingesetzten Schale erstreckt (>10 mm), um Streulicht zu reduzieren (Abbildung 2B).
   5. Verwenden Sie eine Schraube und geeignete Hardware, um den Petrischale-Halter an einem Mikromanipulator zu befestigen, der dreidimensionale Anpassungen und eine gut aufgelöste vertikale Bewegung über eine Ausdehnung ermöglicht, die größer ist als die Dicke der Proben (Teil 1 und Teil 2 des in der Materialtabelle erwähnten Manipulators sind gute Beispiele). Befestigen Sie diesen Mikromanipulator an einem optischen Steckbrett.

3. Messaufbau für Gewebebiopsien

1. Montieren Sie eine Lichtquelle über dem Bereich, in dem die Messung stattfindet, so, dass das Licht kollimiert wird, wenn es die Ebene erreicht, in der die Probe platziert wird (Abbildung 2A). Befestigen Sie z. B. eine 5-cm-Kollimationslinse (Materialtabelle) an einem 5-mm-Flüssigkeitslichtleiter (Materialtabelle) und heben Sie sie mit einem Schraubstock und einem Rahmen, die an einem optischen Steckbrett befestigt sind, um >0,6 m über die Probe (Materialtabelle). Schließen Sie dann den Lichtleiter an eine breitbandige Lichtquelle an, z. B. die in der Materialtabelle aufgeführte Plasmalichtquelle.
2. Befestigen Sie die Sonde an einer vertikal ausgerichteten Halterung, so dass sie auf die Lichtquelle zeigt. Befestigen Sie die Sonde mit Klemmen, Schlauchschellen oder Klebeband an einem optischen Tischpfosten.
   HINWEIS: Beim Riesenmuschel-Experiment wird ein speziell entwickelter Stäbchenhalter verwendet, wie z. B. der in der Materialtabelle aufgeführte Mikromanipulator. In dieser Arbeit wurde es mit Magneten an einem optischen Steckbrett befestigt (Table of Materials). Die zusätzlichen Freiheitsgrade für die Ausrichtung, die sich daraus ergeben, dass sowohl die Sonde als auch die Probe auf Manipulatoren angebracht werden, sind praktisch, aber nicht erforderlich. Achten Sie darauf, dass Sie nicht zu viel am Pfosten festklemmen, da dies das Pipettengehäuse beschädigen kann.
3. Positionieren Sie den Probenmanipulator in der Nähe der vertikal montierten Sonde. Verwenden Sie den Probenmanipulator, um die Position des Probentisches so einzustellen, dass die Sonde in der 0,5 cm großen Öffnung am Boden der Petrischale zentriert ist. Seien Sie äußerst vorsichtig, um zu vermeiden, dass die Spitze der montierten Sonde berührt oder angestoßen wird.
   HINWEIS: Ein Stereomikroskop am Ausleger, das über dem Probenbereich positioniert ist, kann nützlich sein. Auf diese Weise kann die Top-Down-Ausrichtung der Sondenspitze, des Tisches und der Probe vor Beginn eines Experiments angezeigt werden (Abbildung 2A).
4. Verbinden Sie das SMA-terminierte Ende der Glasfaser der Sonde mit einem faseroptischen USB-Spektrometer (Materialtabelle) und verbinden Sie das Spektrometer über ein USB-Kabel mit dem Computer.

4. Datenerhebung

1. Versuchsaufbau
   1. Halten Sie die Sonde und die Manipulatoren genau in der Position, in der die Daten erfasst werden, wie in Schritt 3.4 beschrieben.
   2. Verwenden Sie ein Wattestäbchen oder eine feine Nadel, um vorsichtig eine kleine Menge Silikongleitmittel (Materialtabelle) auf den Teil der Sonde aufzutragen, der in das Gewebe eingeführt wird, um die Reibung zwischen den Seiten der Sonde und der Gewebeprobe zu verringern. Tragen Sie das Silikongleitmittel vor jeder Baseline- oder Gewebemessung erneut auf.
   3. Entfernen Sie das Klebeband, das das Loch in der Petrischale der leeren Probe abdeckt, und legen Sie es in den Probenhalter (Schritt 2.7), wobei Sie darauf achten, dass es durch Reibung sicher an Ort und Stelle gehalten wird.
   4. Verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Probe auf die Sonde abzusenken. Lassen Sie die Sonde durch das Loch an der Unterseite der Petrischale in die Gelatine eindringen. Fahren Sie fort, bis die Sonde etwa 5 mm von der Unterseite der Gelatineschicht entfernt ist.
   5. Schalten Sie die Lichtquelle ein. Passen Sie mit der Spektrometersoftware die Integrationszeit des Spektrometers an, bis das Signal so hoch wie möglich, aber nicht sättigend ist. Legen Sie die Anzahl der gemittelten Scans zwischen zwei und fünf und den Wert für die Glättungspixel auf sechs fest. Die nutzbaren Integrationszeiten in dieser Phase können für diese Baseline zwischen 1 und 50 ms variieren.
2. Erfassung der Referenzspektren
   1. Erfassen Sie ein dunkles Maß.
      1. Sobald die Parameter des Spektrometers mit der leeren Probe eingestellt wurden, lösen Sie die Sondenfaser vom Spektrometer und decken Sie den Anschluss mit der undurchsichtigen Metallabdeckung ab, die mit dem Spektrometer geliefert wurde.
      2. Erhalten Sie eine Dunkelmessung vom Spektrometer (oft unter Verwendung des dunklen Glühbirnensymbols in der GUI), um das Rauschen des Spektrometers ohne Eingangslicht zu charakterisieren. Speichern Sie diese Messung entsprechend der Datenerfassungsstrategie.
   2. Erfassen Sie eine Lampenmessung. Schließen Sie die Sondenfaser wieder an das Spektrometer an, warten Sie, bis sich das Signal stabilisiert hat, und erfassen Sie ein anderes Spektrum. Diese Messung charakterisiert das Licht, das in Abwesenheit von Gewebe durch die Gelatine auf die Sonde trifft.
3. Erfassung der Gewebespektren
   1. Entfernen Sie das Klebeband an der Unterseite der Proben-Petrischale und legen Sie sie in den Probenhalter.
   2. Richten Sie die Probenschale mit dreidimensionaler Manipulation auf die Sonde aus, so dass die Gewebebiopsie über der Spitze der Sonde zentriert ist.
   3. Tragen Sie Silikongel auf die Sonde auf (siehe 4.1.2) und senken Sie die Probe langsam auf die Sonde ab, bis die Sondenspitze die Gelatine, die die Gewebeprobe stützt, durchdrungen hat und gerade in die Gewebeprobe eingedrungen ist.
      HINWEIS: Einige Spektrometer und Computerprogramme ermöglichen die Echtzeitüberwachung des detektierten Lichts. Verwenden Sie dies, um festzustellen, wann die Sonde in das Gewebe eindringt. Die Intensität des Spektrums nimmt schlagartig ab, sobald die Sondenspitze in direktem Kontakt mit dem Gewebe steht.
   4. Stellen Sie sicher, dass die Integrationszeit für die Messung geeignet ist, indem Sie sicherstellen, dass das gemessene Spektrum weder zu verrauscht noch zu gesättigt ist. Ändern Sie bei Bedarf die Integrationszeit.
      1. Jedes Mal, wenn die Integrationszeit angepasst wird, führen Sie eine neue Dunkelmessung durch und speichern Sie sie (Schritt 4.2.1). Ändern Sie nicht die Anzahl der gemittelten Scans oder die Anzahl der geglätteten Pixel.
      2. Nachdem Sie geeignete Messparameter gefunden haben, nehmen Sie die Messungen vor und speichern Sie das Spektrum.
   5. Bewegen Sie die Probe mit dem Mikromanipulator um eine bestimmte Strecke nach unten. Bei dem für diese Studie verwendeten Manipulator betrug jedes kleine Häkchen 0,001 Zoll oder 25,4 μm. Die Probe wurde bei jeder Messung um fünf Teilstriche oder 127 μm nach unten bewegt. Wiederholen Sie Schritt 4.3.4.
   6. Speichern Sie die Spektren an jeder vertikalen Position im Gewebe weiter.
      HINWEIS: Für das hier beschriebene System variierten die erforderlichen Integrationszeiten zwischen 1 ms und 5 s für die Messungen innerhalb einer einzelnen Gewebeprobe. Schließlich verlässt die Sondenspitze die Oberseite des Gewebes und ist dort sichtbar (Abbildung 4A). Dies ist die abschließende Messung und charakterisiert den Lichteinfall an der Oberseite des Gewebes.
4. Laden und Verarbeiten der Daten
   1. Verwenden Sie die Software des Spektrometers, um alle gesammelten Spektren (Dunkelspektren, Lampenspektren und Gewebemessungen) in getrennte Textdateien umzuwandeln.
   2. Laden Sie mit Matlab oder einer Programmiersprache Ihrer Wahl alle Messdateien für eine Probe. Subtrahieren Sie für jedes Gewebemessspektrum das Dunkelspektrum mit der passenden Integrationszeit und dividieren Sie es dann durch die Integrationszeit.
      HINWEIS: In dieser Studie wurde ein Matlab-Skript zum Laden und Verarbeiten der Daten verwendet (Supplementary File 1).
   3. Berechnen Sie den Prozentsatz des einfallenden Lichts, das jede Position im Gewebe erreicht, indem Sie die mit der Sonde im Gewebe erhaltenen Spektren durch das in leerer Gelatine erhaltene Basisspektrum dividieren.
      HINWEIS: Die Messung an der Oberseite des Gewebes (Schritt 4.3.6) sollte der Basismessung in Gelatine (Schritt 4.1) sehr ähnlich sein und nach der Teilung nahe bei 100 % liegen. Je nach experimentellem Kontext kann entweder das Lampenspektrum (das Spektrum von leerer Gelatine oder das von ganz oben im Gewebe) als Referenz verwendet werden. Dennoch ist es wichtig, vor Beginn des Experiments ein Lampenspektrum zu erfassen. Denn wenn die Sonde bricht oder das Experiment anderweitig fehlschlägt, bevor es die Oberseite des Gewebes erreicht, sind die vor dem Versagen gewonnenen Daten immer noch verwertbar, was nicht der Fall ist, wenn kein entsprechendes anfängliches Lampenreferenzspektrum vorhanden ist.
   4. Visualisieren Sie die Daten; Konturdiagramme können hilfreich sein (Abbildung 4B).

Ergebnisse

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zum Aufbau einer mikrooptischen Sonde, mit der die Bestrahlungsstärke des Auftriebs gemessen werden kann (das Licht, das aus einer Richtung auf einen Punkt trifft) oder, mit der Hinzufügung einer lichtstreuenden kugelförmigen Spitze, die skalare Bestrahlungsstärke (das Licht, das einen Punkt aus allen Richtungen erreicht). Diese Sonden können die Bestrahlungsstärke mit räumlicher Auflösung messen, die sich den Längenskalen einzelner Zellen im lebenden Gewebe annähert. D...

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt eine Technik zur systematischen Charakterisierung der optischen Umgebung durch ein großes Volumen von lebendem Gewebe mit einer räumlichen Auflösung, die ungefähr der Skala einzelner Zellen entspricht. Diese kostengünstige, flexible und vor Ort handhabbare Methode könnte für alle Forscher nützlich sein, die die Ausbreitung von Licht in lebenden Systemen untersuchen. Erfahrungsgemäß erfordern diese Sonden im Vergleich zu bestehenden Methoden⁷ etwas mehr Übung ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1" travel ball bearing center+D11+A2:D31+A2:A2:D31	Edmond Optics	37-935	Part 2 of manipulator for lowering sample
1/4" thick acrylic sheet	McMaster-Carr	8505K754	For making Petri dish holder
3/4" mini spring clamp	Anvil	99693	Use as weight for pulling optical fiber
8 mm biopsy punch	Fisher Scientific	NC9324386	For tissue sample
Butane Torch	McMaster-Carr	MT-51	Heat source for pulling fiber and pipette
Collimating lens	Thorlabs	LLG5A1-A	To collimate light source through liquid light guide
Compressed air	McMaster-Carr	7437K35	For drying pulled fiber and pipette
Cyanoacrylate glue - liquid	McMaster-Carr	66635A31	For securing tapered fiber end at top of pulled pipette
Electrical tape	McMaster-Carr	76455A21	For securing fiber in pipette and for adding grip to clamps
Fine grade carborundum paper	McMaster-Carr	4649A24	Small triangle on exacto knife holder works well
Gelatin	Knox	10043000048679	For securing the tissue biopsy in the petri dish
Glass Pasteur Pipete	Fisher Scientific	13-678-20B	Disposable glass pipette 5.75" in length
Insulin syringes, 31G needle	BD	320440	For applying glue
Isopropanol	McMaster-Carr	54845T42	For cleaning pulled fiber and pipette
Kimwipe	Cole-Parmer	SKU 33670-04	For wiping optical fiber and glass pipette clean
LED driver	Thorlabs	LEDD1B	For powering the UV LEDs
Light source for measurements	Cole-Parmer	UX-78905-05	Low heat white light source for measurements
Linear metric X-Y-Z axis rack and pinion stage	Edmond Optics	55-023	Part 1 of manipulator for lowering sample
Liquid light guide	Thorlabs	LLG5-4T	For light source in measurements
Magnetic feet	Siskiyou	MGB 8-32	For use with magnetic strips
Magnetic strips	Siskiyou	MS-6.0	For mounting magnetically to breadboard
Manipulator #1	Siskiyou	MX10R	4-axis manipulator with pipette holder
Opaquer pen, small	WindowTint	TOP01	For opaquing side of optical fiber to prevent stray light from enter probe
Optical breadboard	Edmond Optics	03-640	For stable affixation of probe holder, sample, microscope and light source
Optical fibers	Ocean Optics	P-100-2-UV-VIS	About 4 fibers are good to have
Plasma light source	Thorlabs	HPLS345	For tissue radiometry measurements
Plastic plier clamp	McMaster-Carr	5070A11	Plier clamp used for weight in pulling pipette
Polystyrene Petri dishes	Thomas scientific	3488N10	Sample holders, enough volume to hold sample thickness plus ~10 mm of gelatin on top
Razor blades	McMaster-Carr	3962A3	For stripping jacketing from optical fiber
Silicone oil lubricant	Thomas scientific	1232E30	For reducing friction between probe and tissue
Software for analyzing data	Matlab		Chosen software for data analysis
Spectrometer + spectrometer software	Avantes	AvaSpec-2048L	Spectrometer can be any brand, this one is compatible with sma-terminated optical fibers and comes with its own software for running the spectrometer
Titanium dioxide powder	Sigma Aldrich	718467-100G	For making scattering sphere
Toolour tabletop clip	Toolour	Toolour0004	For holding pipette while pulling and for holding finished probes
Trigger-action bar clamps	mcMaster-Carr	51755A2	Good for holding optical fibers while pulling or curing
UV curable adhesive	Delo Photobond	GB368	For making scattering sphere
UV light source	Thorlabs	M365FP1	Light source for curing adhesive in scattering ball, this one is sma-fiber compatible, higher intensity = less cure time
White LED light source	Thorlabs	MCWHF2	For characterizing pulled fiber and scattering sphere