Eine In-vitro-Auflösungsbestimmung von Multi-Index-Komponenten in der tibetischen Medizin Rhodiola-Granulat

Zusammenfassung

Hier testen wir die Auflösung von Rhodiola-Granulat (RG) in vitro, zeichnen Auflösungskurven von Salidrosid, Gallussäure und Ethylgallat in Reinstwasser und passen die Kurven an verschiedene mathematische Modelle an. Dieses Protokoll enthält Informationen und Leitlinien für In-vivo-Bioäquivalenz- und In-vivo-In-vitro-Korrelationsstudien von RG.

Zusammenfassung

Die Zusammensetzung des tibetischen Arzneimittels Rhodiola-Granulat (RG) ist komplex und die Gesamtqualität von RG ist schwer zu bestimmen. Daher ist die Etablierung einer Methode zur Bestimmung der Mehrkomponenten-In-vitro-Auflösung von RG von großer Bedeutung für die Qualitätskontrolle. In dieser Studie wird die zweite Paddelmethode der vierten allgemeinen Regel 0931 des chinesischen Arzneibuchs (Ausgabe 2020) verwendet, die mit dem Gerät 2 des Arzneibuchs der Vereinigten Staaten (USP) übereinstimmt. Die Auflösungsvorrichtung wurde auf eine Drehzahl von 100 U/min mit Reinstwasser als Auflösungsmedium eingestellt. Zu jedem Zeitpunkt wurde ein Probenvolumen von 1 ml entnommen. Darüber hinaus wurde die kumulative Auflösung von Gallussäure, Salidrosid und Ethylgallussäure in RG zu verschiedenen Zeitpunkten mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) bestimmt. Schließlich wurden die Auflösungskurven gezeichnet und die Kurven an die GompertzMod-, Gompertz-, Logistik- und Weibull-Gleichungen angepasst. Die Ergebnisse zeigten, dass die kumulative Auflösung von Gallussäure in RG nach 1 min über 80% betrug, die kumulative Auflösung von Salidrosid und Ethylgallussäure nach 5 min über 65% betrug und die kumulative Auflösung jeder Indexkomponente nach 30 min abnahm. Die Kurvenanpassung zeigte, dass die GompertzMod-Gleichung das am besten passende Modell für jede Indexkomponente von RG war. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die in diesem Protokoll beschriebene Auflösungstestmethode einfach, genau und zuverlässig ist. Es kann das Auflösungsverhalten der Indexkomponenten in RG in vitro charakterisieren, was eine methodische Referenz für die Qualitätskontrolle von RG und die Qualitätsbewertung anderer ethnischer Verbindungen darstellt.

Einleitung

In China steigt die Prävalenz von Herz-Kreislauf-Erkrankungen weiter an, und die Morbiditäts- und Mortalitätsraten von Herz-Kreislauf-Erkrankungen stehen bei den chinesischen Einwohnern an erster Stelle¹. Die Angina pectoris der koronaren Herzkrankheit wird durch eine luminale Stenose aufgrund einer koronaren Atherosklerose verursacht, die zu einer relativ unzureichenden koronaren Blutversorgung und Myokardischämie und Hypoxie führt². In den letzten Jahren wurde die heilende Wirkung der traditionellen chinesischen Medizin bei der Behandlung der koronaren Herzkrankheit von vielen Ärzten erkannt³.

Die Traditionelle Chinesische Medizin spielt eine wichtige Rolle bei der Linderung klinischer Symptome und der Verbesserung der Lebensqualität der Patienten⁴. Rhodiola-Granulat (RG) wird aus der tibetischen Plateau-Heilpflanze Rhodiola rosea L gewonnen und veredelt. Die Hauptbestandteile von RG sind Salidrosid, Rhodiosin und Flavonoide ^5,6. RG hat die Wirkung, Qi⁷ zu ergänzen und die Durchblutung zu aktivieren und zu fördern, um Schmerzen zu lindern. Klinisch wird es zur Behandlung von Thoraxobstruktionen eingesetzt, die durch Qi-Mangel und Blutstauung, koronare Herzkrankheit und Angina pectoris^{verursacht werden 8}. Die Bestimmung des Gehalts allein spiegelt die intrinsische Qualität der Arzneimittel nicht vollständig wider, da sowohl der Zerfall als auch die Auflösung in vitro die Bioverfügbarkeit und Wirksamkeit der Arzneimittel beeinflussen können^9,10. Zu den Inspektionsmethoden für die Auflösung der chinesischen Medizin gehören die rotierende Korbmethode, die Paddelmethode und die kleine Tassenmethode. Der Nachteil des rotierenden Korbverfahrens besteht darin, dass nur der äußere Teil des rotierenden Korbes während der Rotation mit dem Auflösungsmedium in Kontakt kommt, was das reale Auflösungsverhalten nicht widerspiegelt. Die Paddelmethode kann den oben genannten Mangel überwinden, wodurch sie für einige Präparate der festen chinesischen Medizin besser geeignet ist als die Korbmethode¹¹. Derzeit gibt es keinen Bericht über die In-vitro-Auflösungsanalyse von RG. Um die Qualität von RG umfassender kontrollieren zu können, wurde das Auflösungsverhalten der drei Indexkomponenten (Gallussäure, Salidrosid und Ethylgallat) in RG untersucht. Diese Studie liefert Daten für die Qualitätskontrolle von RG und eine methodische Referenz für die Qualitätsbewertung anderer ethnischer Präparate.

Protokoll

1. Vorbereitung der Lösung

1. Bereiten Sie die Referenzsubstanz-Stammlösung vor: 10,6 mg Salidrosid, 5,24 mg Gallussäure und 5,21 mg Ethylgallussäure werden separat auf einer elektronischen Analysenwaage abgewogen und einzeln in einen 5-ml-Messkolben gegeben. Fügen Sie dann Methanol in HPLC-Qualität hinzu, um es aufzulösen und auf 5 ml zu verdünnen. Zum Schluss gut schütteln, um die Stammlösung der Referenzsubstanz mit Massenkonzentrationen von 2,120 mg/ml, 1,048 mg/ml bzw. 1,042 mg/ml zu erhalten.
   ANMERKUNG: Die Referenzsubstanz-Stammlösung enthält 2,120 mg/ml Salidrosid, 1,048 mg/ml Gallussäure und 1,042 mg/ml Ethylgallat als Stammlösung jeder Lösung in der nachfolgenden Standardkurve.
2. Bereiten Sie die Testprobenlösung vor. Extrahieren Sie 2,8 g RG (Table of Materials) mit 10 ml Methanol in HPLC-Qualität unter Verwendung einer Ultraschallreinigungsmaschine (Leistung: 200 W, Frequenz: 40 kHz) für 30 Minuten und filtern Sie es dann mit einem 0,22-μm-Filter für den Systemanpassungstest.
3. Bereiten Sie eine gemischte Referenzlösung vor, die 0,590 mg/ml Salidrosid, 2,030 mg/ml Gallussäure und 1,930 mg/ml Ethylgallat enthält.
   ANMERKUNG: Jeder Standard (2.950 mg Salidrosid, 10.150 mg Gallussäure und 9.650 mg Ethylgallussäure) wird in einem 5-ml-Messkolben in HPLC-Methanol als Auflösungsmedium gelöst.
4. Erhalten Sie den theoretischen Inhalt jeder charakteristischen Komponente von RG für die Reinstwasserextraktion.
   1. 2,8 g RG in einen 500-ml-Kolben geben, 200 ml Reinstwasser hinzufügen und 60 Minuten lang mit Ultraschall (Leistung: 200 W, Frequenz: 40 kHz) extrahieren. Filtern Sie es dann mit einem 0,22-μm-Filter.
   2. Bestimmen Sie den Inhalt der Testlösung gemäß der linearen Gleichung, die im folgenden Experiment erhalten wurde.

2. Chromatographischer Zustand

1. Stellen Sie die chromatographischen Bedingungen wie in Tabelle 1 für die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie ein. Einzelheiten zum verwendeten Gerät finden Sie in der Materialtabelle.

3. Test der Anpassungsfähigkeit des Systems

1. Untersuchen Sie die lineare Beziehung.
   1. Die Referenzlösungen von Gallussäure und Ethylgallat werden um das 5-, 10-, 25-, 50- und 125-fache und die Referenzstammlösungen von Salidrosid um das 2-, 4-, 8-, 16- und 32-fache verdünnt, um die Gradientenkonzentrationslösung zum Zeichnen einer Standardkurve zu erhalten.
      HINWEIS: Passen Sie das Verdünnungsverhältnis der Standardkurve entsprechend dem Vorexperiment der Probenbehandlung an. Im Vorexperiment wurden die Stammlösungen der drei Standards zunächst 5-, 10-, 25-, 50- und 125-fach verdünnt und dann die erste Standardkurve aufgetragen. Als jedoch die Konzentration der Testprobe nachgewiesen wurde, wurde festgestellt, dass die Salidrosidkonzentrationen nicht in den linearen Bereich dieser Standardkurve fielen, und daher wurden die Konzentrationen angepasst, um sie in die Kurve aufzunehmen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die oben genannten Vorversuche verwendet wurden, um die endgültigen Verdünnungskonzentrationen der drei Testproben für nachfolgende experimentelle Studien zu bestimmen.
2. Präzisionsprüfung: Injizieren Sie sechsmal täglich 10 μl der gemischten Referenzlösung in das HPLC-System und lassen Sie die Proben mit den in Schritt 2.1 beschriebenen HPLC-Bedingungen laufen. Zeichnen Sie den Spitzenbereich jeder Feature-Komponente auf.
3. Stabilitätstest-Experimente: Injizieren Sie 10 μl der vorbereiteten Probenlösung und bestimmen Sie die Peakflächen der HPLC gemäß den chromatographischen Bedingungen nach 0 h, 6 h, 10 h, 12 h, 14 h, 16 h, 18 h, 20 h bzw. 24 h.
   HINWEIS: Die Peakflächen werden automatisch vom HPLC-System erfasst.
4. Reproduzierbarkeitstest: Nehmen Sie sechs Proben derselben Charge von RG, um die Testprobenlösung gemäß dem Verfahren in Schritt 1.2 herzustellen. Injizieren Sie 10 μl jeder Probe in das HPLC-System. Führen Sie die Beispiele wie in Schritt 2.1 beschrieben aus, und bestimmen Sie die Reproduzierbarkeit.
   ANMERKUNG: Die Wiederholbarkeit wurde durch den Vergleich der Konzentrationsunterschiede zwischen den sechs Proben bewertet.
5. Wiederherstellungs-Experiment
   1. Bereiten Sie sechs Portionen derselben Charge RG für die Testlösung vor. Fügen Sie dann etwa 50 % der Referenzsubstanz jeder Indexkomponente in die Testlösung hinzu, um die Wiederfindungsrate zu berechnen. Führen Sie diese Proben im HPLC-System unter den in Schritt 2.1 beschriebenen Bedingungen aus.
   2. Berechnen Sie die Wiederherstellungsrate.
      ANMERKUNG: Wiederfindungsrate = (C - A) / B x 100, wobei A die Menge der in der Testlösung zu messenden Komponente, B die Menge der zugesetzten Referenzsubstanz und C der gemessene Wert der Lösung ist, die die Referenzsubstanz und die RG-Probe enthält. In Schritt 2.1 finden Sie die chromatographischen Bedingungen zum Ausführen der obigen Schritte (d. h. Schritte 3.1-3.5).

4. In-vitro-Auflösungstest

1. Führen Sie den Auflösungstest mit der Paddelmethode der zweiten Methode der allgemeinen Regel 0931 des chinesischen Arzneibuchs (Ausgabe 2020)¹² durch.
   HINWEIS: Probenahmetechnik und -ausrüstung: Die Arzneimittelauflösungsvorrichtung (Materialtabelle) verfügt über einen Auflösungsbecher, ein Paddel, ein Temperaturkontrollsystem und ein Geschwindigkeitseinstellungssystem. Vor dem Start des Auflösungsexperiments wird das Wasser auf eine eingestellte Temperatur vorgewärmt und dann die entsprechende Geschwindigkeit eingestellt. Beginnen Sie sofort nach dem Hinzufügen von RG mit der Aufzeichnung der Uhrzeit.
2. 100 ml Reinstwasser werden in den Auflösungsbecher der Arzneimittelauflösungsvorrichtung gegeben und die Temperatur bei 37 °C ± 0,5 °C gehalten. Stellen Sie die Drehzahl auf 100 U / min ein.
   HINWEIS: Die Auflösungsvorrichtung verfügt über eine Heizvorrichtung, mit der die Temperatur innerhalb des Systems eingestellt werden kann. Es gab keinen signifikanten Unterschied in der Auflösungsrate von Salidrosid in Wasser, künstlichem Magensaft (16,4 ml verdünnte Salzsäure [234 ml konzentrierte Salzsäure, verdünnt auf 1000 ml mit Wasser] mit etwa 800 ml Wasser und 10 g Pepsin, gut geschüttelt und mit Wasser auf 1.000 ml verdünnt) und künstlichem Darmsaft (Phosphatpuffer [pH 6,8], der Trypsin enthält)¹³. Als Auflösungsmedium wurde das am leichtesten verfügbare Wasser (ultrarein) gewählt.
3. Geben Sie 2,8 g RG in einen Auflösungsbecher und beginnen Sie sofort mit der Aufzeichnung der Auflösungsdauer. Sammeln Sie insgesamt 1 ml der Probe mit einem Injektor (siehe Materialtabelle) nach 1 min, 5 min, 10 min, 20 min, 30 min und 60 min und füllen Sie das Volumen im Auflösungsbecher mit dem Auflösungsmedium sofort bei der gleichen Temperatur auf.
   HINWEIS: Das Probenahmeröhrchen im Auflösungsbecher kann keine kleinen Probenvolumina sammeln, daher wird der Injektor zum Sammeln der Probe verwendet. Die Proben müssen schnell entnommen werden, um zu vermeiden, dass bestimmte Entnahmezeitpunkte übersehen werden.
4. Filtern Sie die gesammelten Proben sofort durch eine 0,22 μm mikroporöse Membran und entnehmen Sie das anschließende Filtrat. Bestimmen Sie den Gehalt jeder Komponente zu jedem Zeitpunkt durch HPLC (gemäß Schritt 2.1) und berechnen Sie die kumulative Auflösung.
   1. Um die kumulative Auflösung zu berechnen, berechnen Sie die Auflösung jedes Zeitpunkts (X_n):
      X_n = A / B x 100, wobei A die Menge der zu jedem Zeitpunkt gemessenen Komponenten und B der theoretische Inhalt jeder Komponente ist.
   2. Berechnen Sie dann die kumulative Auflösung (Y):
      Y = X n + (X 1 + ... + X _n-1) x V 2 / V 1, wobei V₁ das Gesamtvolumen des Auflösungsmediums und V ₂ das Volumen des gelösten Stoffes ist, der nach jeder Probenahme zugegeben wird.
      HINWEIS: Aufgrund der niedrigen Ansprechwerte von Salidrosid und Gallussäure im Chromatogramm wurde die kumulative Auflösung von Salidrosid und Ethylgallat zum Zeitpunkt von 1 min nicht in der Auflösungskurve aufgetragen.

5. Anpassung des Auflösungsmodells

1. Importieren Sie die kumulativen Auflösungsdaten zu jedem Zeitpunkt in die Datenanalysesoftware.
2. Verwenden Sie das Plug-in für die Analyse der Wirkstoffauflösung in der Datenanalysesoftware, um die GompertzMod-Gleichung, die Gompertz-Gleichung, die Logistikgleichung und die Weibull-Gleichung¹⁴ anzupassen. Je größer der Wert von ^R2 ist, desto besser ist der Kurvenanpassungseffekt.
   1. Starten Sie die Software und wählen Sie das Fenster Book1 aus, um das Fenster Origin Data Editing aufzurufen.
   2. Definieren Sie in der ersten Spalte A(X)-Long Name-Eingabezeit Zeit als Zeit, und geben Sie jede Auflösungsbestimmungszeit ein. Geben Sie Daten in die zweite Spalte B(Y)-Langer Name, definieren Sie Daten als kumulative Auflösung, geben Sie den kumulativen Auflösungsprozentsatz jeder Auflösungsbestimmungszeit ein.
   3. Wählen Sie nach der Dateneingabe die Spalten A(X ) und B(Y) aus, wählen Sie in der Software-Menüleiste das Plug-in Drug Dissolution Analysis aus und klicken Sie auf Fit > Concatenate Fit > OK. Die Software generiert die Anpassungsergebnisse jedes Modells.

Ergebnisse

In dieser Studie lagen die Präzision, Stabilität, Wiederholbarkeit und Probenrückgewinnung von RG alle innerhalb des methodischen Bereichs, der im chinesischen Arzneibuch (Band 4, 2020)¹² angegeben ist, was darauf hindeutet, dass die Methode durchführbar ist. Nach wiederholtem Debuggen wurde festgestellt, dass der in dieser Studie verwendete Elutionsgradient eine gute Auflösung (Abbildung 1) für die drei Indexkomponenten in RG aufwies. Die drei Indexkomponenten ...

Diskussion

Der Freisetzungstest ist eine ideale In-vitro-Methode, um den Zerfall und die Auflösung von festen oralen Präparaten im Magen-Darm-Trakt zu simulieren¹⁵. Es ist ein wichtiger Index zur Bewertung und Kontrolle der Qualität fester oraler Präparate. Daher spielt der Auflösungstest eine wesentliche Rolle bei der Entwicklung von oralen Präparaten mit festen Arzneimitteln¹⁶. Insbesondere mit der Entwicklung der Qualitätskontrolltechnologie der Traditionellen Chine...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chromatographic column	ZORBAX Eclipse	XDB-C18	4.6 mm x 250 mm, 5 µm
Drug dissolution tester	Shanghai Huanghai Pharmaceutical Inspection Instrument Co., Ltd.	RCZ-6B3
Electronic analytical balance	Shanghai Liangping Instruments Co., Ltd.	FA1004
Ethyl gallate (HPLC, ≥98%)	Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.	DSTDM006301
Function drawing software	OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA	2022
Gallic acid (HPLC, ≥98%)	Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.	DSTDM000802
High performance liquid chromatography	Agilent Technologies Singapore (International) Pte. Ltd.	Agilent 1260 Infinity
HPLC grade methanol	Thermo Fisher Scientific (China) Co., Ltd.	216565
Injector	Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instrument Co., Ltd.	0.7 (22 G)
Millipore filter	Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd	φ13 0.22 Nylon66
Rhodiola granules	Tibet Nodikang Pharmaceutical Co., Ltd.	210501
Salidroside (HPLC, ≥98%)	Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.	DST200425-037
Ultra pure water systemic	Merck Millipore Ltd.	Milli-Q
Ultrasonic cleansing machine	Ningbo Xinyi Ultrasonic Equipment Co., Ltd	SB-8200 DTS