Zum Anzeigen dieser Inhalte ist ein JoVE-Abonnement erforderlich. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.
Method Article
* Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen
In dieser Arbeit wird ein optimiertes Protokoll zur reproduzierbaren Immobilisierung und Quantifizierung von Kollagen vom Typ I und III auf Mikrotiterplatten vorgestellt, gefolgt von einem verbesserten in vitro Binding Assay-Protokoll zur Untersuchung von Kollagen-Verbindungen-Wechselwirkungen unter Verwendung einer zeitaufgelösten Fluoreszenzmethode. Die anschließende Schritt-für-Schritt-Datenanalyse und Dateninterpretation wird bereitgestellt.
Fibrose tritt in verschiedenen Geweben als reparative Reaktion auf Verletzungen oder Schäden auf. Bei übermäßiger Fibrose kann es jedoch zu Gewebevernarbungen und Organversagen kommen, was mit einer hohen Morbidität und Mortalität verbunden ist. Kollagen ist ein Haupttreiber der Fibrose, wobei Kollagen Typ I und Typ III die Haupttypen sind, die an vielen fibrotischen Erkrankungen beteiligt sind. Im Gegensatz zu herkömmlichen Protokollen, die zur Immobilisierung anderer Proteine (z. B. Elastin, Albumin, Fibronektin usw.) verwendet werden, sind umfassende Protokolle zur reproduzierbaren Immobilisierung verschiedener Arten von Kollagenen zur Herstellung stabiler Beschichtungen nicht ohne weiteres verfügbar. Die Immobilisierung von Kollagen ist eine überraschende Herausforderung, da mehrere experimentelle Bedingungen die Effizienz der Immobilisierung beeinflussen können, einschließlich der Art des Kollagens, des pH-Werts, der Temperatur und der Art der verwendeten Mikroplatte. Hier wird ein detailliertes Protokoll zur reproduzierbaren Immobilisierung und Quantifizierung von Typ-I- und Typ-III-Kollagenen zur Verfügung gestellt, das zu stabilen und reproduzierbaren Gelen/Filmen führt. Darüber hinaus zeigt diese Arbeit, wie zeitaufgelöste Fluoreszenzbindungsstudien in vitro durchgeführt, analysiert und interpretiert werden können, um die Wechselwirkungen zwischen Kollagenen und kollagenbindenden Verbindungen zu untersuchen (z. B. ein Peptid, das an ein Metallchelat konjugiert ist, das z. B. Europium [Eu(III)]) trägt). Ein solcher Ansatz kann universell auf verschiedene biomedizinische Anwendungen angewendet werden, einschließlich des Bereichs der molekularen Bildgebung zur Entwicklung gezielter Bildgebungssonden, der Arzneimittelentwicklung, Zelltoxizitätsstudien, Zellproliferationsstudien und Immunoassays.
Die Ansammlung von fibrösem Bindegewebe im Rahmen des natürlichen Wundheilungsprozesses nach einer Gewebsverletzung wird als Fibrose bezeichnet. Wenn die Ablagerung von fibrösem Gewebe jedoch nicht beendet wird und über das für die Gewebereparatur erforderliche Maß hinausgeht, wird die Fibrose übermäßig 1,2. Übermäßige Fibrose beeinträchtigt die Physiologie und Funktion der Organe und kann zu Organschäden und möglicherweise zu Organversagen führen 3,4,5. Zwei Haupttreiber der Fibrose sind die Proteine der extrazellulären Matrix (ECM), Kollagen Typ I und Typ III6. Kollagen ist ein Strukturprotein, das in verschiedenen Organen vorkommt und etwa ein Drittel des gesamten Proteingehalts des menschlichen Körpers ausmacht1. Es gibt 28 verschiedene Arten von Kollagenen, die durch die Sequenzierung des menschlichen Genoms identifiziert wurden, und die am häufigsten vorkommenden sind die fibrillären Kollagene7. Das primäre fibrilläre Kollagen ist Kollagen vom Typ I, das der EZM Zugfestigkeit und Verformungsbeständigkeit verleiht8. Typ-III-Kollagen ist eine strukturelle Komponente, die für Elastizität sorgt und mit Typ-I-Kollagen kolokalisiert. Es wird während der Embryogenese exprimiert und kommt natürlicherweise in geringen Mengen in der Haut, den Muskeln und den Blutgefäßen von Erwachsenen vor9.
Die In-vivo-Kollagensynthese beginnt mit einem intrazellulären Prozess, bei dem die mRNA im Zellkern abgelesen wird und dann in das Zytoplasma gelangt, wo sie translatiert wird. Nach der Translation erfährt die gebildete Kette eine posttranslationale Modifikation im endoplasmatischen Retikulum, wo Prokollagen (die Vorstufe des Kollagens) gebildet wird. Pro-Kollagen wandert dann zur endgültigen Modifikation in den Golgi-Apparat, bevor es in den extrazellulären Raum ausgeschieden wird10. Durch die proteolytische Spaltung wird Prokollagen in Tropokollagen umgewandelt. Diese wird dann entweder über einen enzymatisch vermittelten Vernetzungsweg, der durch das Enzym Lysyloxidase (LOX) katalysiert wird, oder über einen nicht-enzymatisch vermittelten Vernetzungsweg, an dem die Maillard-Reaktion beteiligt ist, vernetzt11. In-vitro-Protokolle zur Immobilisierung von Kollagen beruhen hauptsächlich auf der Fähigkeit des Kollagens, sich selbst zu organisieren. Kollagen wird aufgrund seiner Löslichkeit aus Geweben gewonnen, die weitgehend vom Ausmaß der Vernetzung einzelner Kollagenfibrillen abhängt7. Fibrilläres Kollagen wird in Essigsäure aufgelöst, und die Fibrillen können sich neu bilden, wenn der pH-Wert und die Temperatur eingestellt werden12. In vitro kann die Fibrillogenese von Kollagen als zweistufiger Prozess angesehen werden7. Die erste Phase ist die Keimbildungsphase, in der Kollagenfasern Dimere und Trimerfibrillen bilden, bevor sie zu einer dreifach helikalen Struktur neu angeordnet werden. Die zweite Phase ist die Wachstumsphase, in der die Fibrillen seitlich zu wachsen beginnen und zur charakteristischen D-Bandenbildung führen, die im Allgemeinen durch Veränderungen der Trübung beobachtet wird7. Untersuchungen der Rasterkraftmikroskopie (AFM) haben auch gezeigt, dass Kollagen Typ I und Typ III unterschiedliche Eigenschaften aufweisen (Tabelle 1)13.
Um die Bindungswechselwirkungen zwischen Kollagen und anderen Verbindungen zu untersuchen, muss Kollagen reproduzierbar in die Vertiefungen von Mikrotiterplatten immobilisiert werden. Es gibt verschiedene Protokolle zur Immobilisierung von löslichem Kollagen 14,15,16. Für die Zellkultur werden in der Regel kommerziell erhältliche Mikrotiterplatten verwendet, die mit Kollagen vorbeschichtet sind. Vorbeschichtete Mikrotiterplatten haben jedoch eine sehr dünne Schicht einer unbekannten Menge Kollagen, die auf die Vertiefungen aufgetragen ist, was sie für In-vitro-Bindungsassays ungeeignet macht. Es gibt mehrere Herausforderungen bei der Immobilisierung von Kollagen in den Plattenvertiefungen. Eine der größten Herausforderungen ist die Wahl eines geeigneten Mikroplattentyps, da verschiedene Arten von Kollagenen (z. B. Typ I und III) unterschiedliche chemische Eigenschaften haben und daher je nach Material der Mikroplatte stabiler und effektiver immobilisiert werden. Eine weitere Herausforderung sind die experimentellen Bedingungen des Immobilisierungsprotokolls, da der Prozess der Fibrillogenese von mehreren Faktoren abhängt, darunter Temperatur, pH-Wert, die Stammkonzentration von Kollagen und die Ionenkonzentration des Puffers7.
Um die Wechselwirkungen zwischen dem Kollagen (dem Ziel) und anderen Verbindungen (d. h. einem Zielpeptid) zu untersuchen, ist es auch notwendig, einen robusten Screening-Assay zu entwickeln, um die Spezifität und Selektivität der Verbindung gegenüber dem Ziel durch Messung der Dissoziationskonstante Kd zu untersuchen. Die Position des Gleichgewichts der Bildung eines bimolekularen Komplexes zwischen einem Protein (Kollagen) und einem Liganden wird durch die Assoziationskonstante Ka ausgedrückt, deren Größe proportional zur Bindungsaffinität ist. Am häufigsten drücken Biochemiker jedoch Affinitätsbeziehungen in Form der Gleichgewichtsdissoziationskonstante Kd des bimolekularen Komplexes aus, die als Kd = 1/Ka (Kd und ist der Kehrwert von Ka) definiert ist. Je niedriger der Kd-Wert, desto stärker ist die Bindungsstärke zwischen dem Protein und dem Liganden. Der Vorteil der Verwendung von Kd zum Vergleich der Bindungsaffinität verschiedener Liganden für dasselbe Protein (und umgekehrt) hängt mit der Tatsache zusammen, dass die Einheiten von Kd für einen bimolekularen Komplex mol/L (d. h. die Konzentrationseinheit) sind. Unter den meisten experimentellen Bedingungen entspricht der Kd-Wert der Ligandenkonzentration, die zu einer 50%igen Sättigung der verfügbaren Bindungsstellen auf dem Target im Gleichgewichtführt 17,18. Die Dissoziationskonstante wird typischerweise durch Analyse der Rezeptorfraktionsbelegung (FO) extrahiert, die als das Verhältnis zwischen den besetzten Bindungsstellen und den insgesamt verfügbaren Bindungsstellen in Abhängigkeit von der Ligandenkonzentration definiert ist. Dies kann unter der Voraussetzung erfolgen, dass ein analytischer Assay verfügbar ist, der in der Lage ist, die Menge des gebundenen Liganden zu unterscheiden und zu messen.
In-vitro-Ligandenbindungsassays können mit verschiedenen bioanalytischen Methoden durchgeführt werden, darunter optische Photometrie, Radioligandenmethoden, Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-MS) und Oberflächenplasmonenresonanz (SPR). Unter den photometrischen Methoden erfordern diejenigen, die auf Fluoreszenzemission basieren, typischerweise die Markierung von Liganden oder Proteinen mit Fluorophoren, um die Empfindlichkeit zu erhöhen und die Nachweisgrenze des Assays zu verbessern. Chelate bestimmter Lanthanid(III)-Ionen, wie z. B. Eu(III), sind als Fluorophore sehr attraktiv, da sie große Stokes-Verschiebungen, schmale Emissionsbanden (für ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis), begrenztes Photobleaching und lange Emissionslebensdauern aufweisen. Wichtig ist, dass die letztere Eigenschaft die Verwendung der zeitaufgelösten Fluoreszenz (TRF) von Eu(III)-Fluorophoren ermöglicht, um die Hintergrund-Autofluoreszenzaufzuheben 19. In der dissoziationsverstärkten Lanthanid-Fluoreszenz-Immunoassay (DELFIA)-Version des Eu(III)-basierten TRF-Assays werden Liganden, die mit einem nicht-lumineszierenden Eu(III)-Chelat markiert sind, inkubiert, wobei der Rezeptor auf Mikrotiterplatten immobilisiert ist. Der markierte Liganden/Rezeptor-Komplex wird von dem ungebundenen Liganden getrennt, und die Eu(III)-Fluoreszenz wird durch Dissoziation des Eu(III)-Komplexes bei einem sauren pH-Wert aktiviert, gefolgt von einer Re-Komplexierung mit einem fluoreszenzverstärkenden Chelator, um einen in Mizellen eingebetteten, stark fluoreszierenden Eu(III)-Komplex20 zu bilden.
Der Dekomplexierungsschritt kann vernünftigerweise mit Chelatoren wie Diethylentriaminpentaacetat (DTPA) erreicht werden, die eine schnelle Dekomplexierungskinetik aufweisen. Eu(III)-Komplexe mit bestimmten makrozyklischen Chelatoren, wie z. B. DOTA (1,4,7,10-Tetraazacyclododecan1,4,7,10-Tetraessigsäure) und seine Monoamidderivate (DO3AAm), weisen jedoch eine hohe thermodynamische Stabilität und eine sehr hohe kinetische Inertheit auf. In diesem Fall müssen die Dekomplexierungsschritte genau optimiert werden, um eine ausreichende und reproduzierbare Aktivierung von Eu(III)-basiertem TRF21 zu erreichen. Es ist erwähnenswert, dass Lanthanid (Ln(III))-DOTA und Ln(III)-DO3AAm-Komplexe diejenigen sind, die am häufigsten als Kontrastmittel für die molekulare In-vivo-Bildgebung mittels Magnetresonanztomographie (MRT) eingesetzt werden22. Daher ist der Ln(III)-basierte TRF-Assay das Werkzeug der Wahl, um in vitro die Bindungsaffinität von molekularen MRT-Sonden zu ihren beabsichtigten biologischen Zielen zu untersuchen. Derzeit fehlen umfassende und reproduzierbare Protokolle für die Immobilisierung von Typ-I- und Typ-III-Kollagen und eine reproduzierbare Pipeline für die Durchführung von in vitro bindenden Eu(III)-TRF-Experimenten. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden reproduzierbare Methoden zur Selbstorganisation und Immobilisierung von Typ-I- und Typ-III-Kollagen und zur Erzeugung stabiler Gele bzw. Filme mit der für In-vitro-Bindungsassays erforderlichen ausreichenden Kollagenkonzentration entwickelt. Es wird ein optimiertes Protokoll für Eu(III)-TRF von hochinerten Eu(III)-DO3Aam-basierten Komplexen vorgestellt. Schließlich wird ein optimierter in vitro Mikrotiterplatten-Eu(III)-TRF-Assay zur Messung des Kd von Eu(III)-markierten Liganden gegenüber immobilisiertem Typ-I- und Typ-III-Kollagen demonstriert (Abbildung 1).
HINWEIS: Alle Produktinformationen, die für diese Arbeit verwendet werden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Kollagen-Immobilisierung
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass in jeder Vertiefung der Mikroplatte, die während des Bindungsassays verwendet wird, benachbarte Vertiefungen frei sind, um Kreuzfluoreszenz zu vermeiden. Führen Sie diesen Teil des Protokolls auf Eis durch, da sich Kollagen bei steigenden Temperaturen und pH-Werten selbst zusammensetzt. Führen Sie dieses Verfahren in einer Gewebekulturhaube und unter sterilen Bedingungen durch, da die Mikrotiterplatten anschließend in einem Gewebekultur-Inkubator (TC) inkubiert werden.
2. Beurteilung der Stabilität der immobilisierten Kollagengele/-filme
3. Europium(III) TRF-Ligandenbindungsassay (Abbildung 1)
HINWEIS: Bei der verwendeten Verbindung handelt es sich um ein kollagenbindendes Peptid (CBP), das mit einem einzigen Eu(III)-DO3AAm-Komplex markiert ist, der als Eu(III)-DO3AAm-CBP bezeichnet wird (Abbildung 4).
4. Datenanalyse
Beurteilung der Stabilität und Konzentration von Typ-I- und Typ-III-Kollagen, das in Gelen/Filmen immobilisiert ist
Die Quantifizierung der immobilisierten Kollagenkonzentration pro Vertiefung erfolgte unter drei verschiedenen Bedingungen: a) in Vertiefungen ohne Waschen mit PBS nach Immobilisierung der Proteine (keine Wäsche); b) in Vertiefungen mit einem Waschschritt (zweimal mit PBS) nach der Immobilisierung, um unbeschichtetes Protein zu entfernen; c) in Vertief...
In dieser Arbeit wird eine reproduzierbare Methode zur Immobilisierung von Kollagen vom Typ I und Typ III vorgestellt. Es demonstriert auch ein Protokoll zur Erfassung, Analyse und Interpretation von in vitro Eu(III)-TRF-Bindungsdaten, um die Bindungseigenschaften eines Kandidatenliganden gegenüber Kollagen vom Typ I und III zu charakterisieren. Die hier vorgestellten Protokolle zur Immobilisierung von Typ-I- und Typ-III-Kollagen wurden unter Berücksichtigung zuvor veröffentl...
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Wir danken den folgenden Geldgebern für die Unterstützung dieser Arbeit: (1) dem UK Medical Research Council (MR/N013700/1) und dem King's College London, Mitglied der MRC Doctoral Training Partnership in Biomedical Sciences; (2) Zuschuss des BHF-Programms RG/20/1/34802; (3) BHF-Projektzuschuss PG/2019/34897; (4) Zuschuss des King's BHF Centre for Research Excellence RE/18/2/34213; (5) das ANID Millennium Science Initiative Program - ICN2021_004; und (6) ANID Basal Grant FB210024.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10x PBS | Gibco | 14200075 | Use this to make 1x PBS by diluting in water (1:10) |
10x PBS | Gibco | 14200075 | Use this to make 1x PBS by diluting in water (1:10) |
2M HCL | Made in house and details are in the supporting document | ||
2M HCL | Made in house and details are in the supporting document | ||
2M Sodium hydroxide +2M Glycine | Made in house and details are in the supporting document | ||
2M Sodium hydroxide +2M Glycine | Made in house and details are in the supporting document | ||
Cell-star 96 well microplate | Greiner Bio-One | 655 160 | |
Cell-star 96 well microplate | Greiner Bio-One | 655 160 | |
DELFIA enhacement solution | Perkin Elmer | 1244-104 | |
DELFIA enhacement solution | Perkin Elmer | 1244-104 | |
Ice | |||
Ice | |||
Infinite 200 PRO NanoQuant microplate reader | TECAN | ||
Infinite 200 PRO NanoQuant microplate reader | TECAN | ||
Non-binding (NBS) 96 well microplates | Corning | 3641 | |
Non-binding (NBS) 96 well microplates | Corning | 3641 | |
pH electrode Inlab Routine | Mettler Toledo | 51343050 | |
pH electrode Inlab Routine | Mettler Toledo | 51343050 | |
pH meter (sevenCompact) | Mettler Toledo | ||
pH meter (sevenCompact) | Mettler Toledo | ||
Pierce BCA protein assay kit | Thermofisher | 23227 | |
Pierce BCA protein assay kit | Thermofisher | 23227 | |
Tissue culture incubator (37 °C, 5% CO2) | |||
Type I bovine collagen, 3 mg/mL | Corning | 354231 | |
Type III human placenta collagen, 0.99 mg/mL | Advanced Biomatrix | 5021 |
Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden
Genehmigung beantragenThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten