Erforschung der Zwei-Kräuter-Kombinationsstrategie zur Behandlung verletzter PC12-Zellen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet eine Kombinationsstrategie von zwei Kräutern zur Behandlung verletzter PC12-Zellen. Das Protokoll bietet eine Referenz für die Optimierung der besten Applikationsweise der Traditionellen Chinesischen Medizin (TCM).

Zusammenfassung

Im Hinblick auf die Vorteile der Kombination der Traditionellen Chinesischen Medizin (TCM) bei der Behandlung der zerebralen Ischämie untersuchten wir die Unterschiede in der Wirksamkeit und dem Mechanismus zwischen der Präparatkombination und der Komponentenkombination, um die Zwei-Kräuter-Kombinationsstrategie zur Behandlung verletzter PC12-Zellen zu untersuchen. Kobaltchlorid (CoCl₂) in Kombination mit einem glukosefreien Medium wurde verwendet, um eine oxidative Schädigung von PC12-Zellen zu induzieren. Anschließend wurde die optimale Kombination aus Astragalus mongholicus (Ast) und Erigeron breviscapus (Eri ) ausgewählt und nach einheitlichen Designmethoden kombiniert, nachdem ihre sichere und wirksame Konzentration auf PC12-Zellen überprüft worden war. Ferner umfasst die gescreente Komponentenkombination 10 μM Astragalosid A, 40 μM Scutellarin und 75 μM Chlorogensäure in zwei Kräutern. Dann wurden MTT, Annexin V-FITC/PI, Immunfluoreszenz und Western-Blot-Analyse verwendet, um die Wirksamkeit und den Mechanismus der Präparatekombination und der Komponentenkombination auf verletzten PC12-Zellen zu bewerten. Die Ergebnisse zeigten, dass die optimale Präparationskombination für das Zellüberleben eine Ast-Injektion und eine Eri-Kapsel mit einer Konzentration von 6:1,8 (μM) war. Die Komponentenkombination (10 μM Astragalosid A, 40 μM Scutellarin und 75 μM Chlorogensäure) war wirksamer als die Zubereitungskombination. Beide Kombinationen reduzierten die apoptotische Rate, die Fluoreszenzintensität von Caspase-3 und den Gehalt an intrazellulären reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) erheblich. In der Zwischenzeit regulierten sie die Expressionsniveaus von p-Akt/Akt, Bcl-2/Bax und Nrf2 hoch. Diese Effekte waren in der Komponentenkombination deutlicher. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass beide Kombinationen die durch CoCl₂ in Kombination mit einem glukosefreien Medium auf PC12-Zellen induzierte Schädigung hemmen und so das Zellüberleben fördern können. Die Effizienz der Komponentenkombination gegenüber der Präparationskombination kann jedoch auf eine stärkere Regulation des PI3K/Akt/Nrf2-Signalwegs zurückzuführen sein, der mit oxidativem Stress und Apoptose zusammenhängt.

Einleitung

Chronische zerebrale Ischämie, verursacht durch zerebrale Hypoperfusion, ist eine häufige Erkrankung bei Menschen mittleren Alters und älteren Menschen¹. Als langfristige okkulte Ischämie kann es zu einer fortschreitenden oder anhaltenden neurologischen Dysfunktion kommen. Zu den wichtigsten pathologischen Mechanismen gehören Zellapoptose und oxidative Schäden, die zu einer fortschreitenden oder anhaltenden neurologischen Dysfunktion führen. Dies ist die pathologische Grundlage der Alzheimer-Krankheit, der vaskulären Demenz und anderer Krankheiten und beeinträchtigt die Lebensqualität der Patienten erheblich. In der modernen Medizin mangelt es jedoch immer noch an idealen Medikamenten zur Behandlung der chronischen zerebralen Ischämie². Gleichzeitig ist die Kombination von Astragalus mongholicus (Ast) und Erigeron breviscapus (Eri ) in der klinischen Praxis der Traditionellen Chinesischen Medizin (TCM^{) weit} verbreitet4. Die Kombinationsstrategie hat sich bemerkenswert verbessert, um die Wiederherstellung der Nervenfunktion nach zerebraler Ischämie zu fördern, die besser ist als die eines einzelnen Medikaments. Es gibt jedoch große Unterschiede im Dosierungsverhältnis in der Kombination der beiden Medikamente⁴. Die wirksamen Komponenten und der Wirkmechanismus sind nicht genau definiert, was das Hauptproblem ist, das die klinische Anwendung einschränkt.

Frühere Studien haben die synergistische Wirkung der Präparationskombination aus Ast-Injektion und Eri-Injektion bei der Behandlung von zerebraler Ischämie bei Ratten gezeigt. Es kann die Expression des p-Akt-Proteins hochregulieren und die Expression des Bcl-2-assoziierten Todespromotors (BAD)-Proteins^5,6 herunterregulieren^, das zu den Proteinen der B-Lymphoblastom-2-Familie (Bcl-2) gehört und die Apoptose fördert. Die materielle Grundlage und der Mechanismus seiner synergistischen Wirkung sind jedoch nicht klar. Darüber hinaus wurde das Verletzungsmodell von PC12-Zellen mit CoCl_{2-kombiniertem} glukosefreiem Medium erstellt, und die optimale Komponentenkombination in Ast und Eri wurde gescreent und definiert⁷.

In dieser Studie werden die wirksamen Dosen von Ast und Eri unter Verwendung des verletzten PC12-Zellmodells untersucht. Die optimale Kombination der beiden Wirkstoffe wird mit diesem Modell in Kombination mit der homogenen Designmethode gescreent. Das Zellmodell wird verwendet, um den Unterschied in den Wirkungen und Mechanismen der Präparationskombination und der Komponentenkombination in verletzten PC12-Zellen weiter zu bewerten. Diese Strategie zielt darauf ab, die Schutzwirkung und den Regulationsmechanismus der beiden Arten von Kombinationen auf verletzte PC12-Zellen durch den PI3K/Akt/Nrf2-Signalweg zu untersuchen, um den besten Kombinationsmodus zu bestimmen. Diese Studie liefert eine Referenz für die Optimierung der besten Applikationsweise der TCM.

Protokoll

1. Herstellung des Reagenzes

1. Das vollständige Medium wird durch Zugabe von 90 ml DMEM-Medium mit hohem Zuckergehalt, 10 ml fötalem Rinderserum (FBS) und 1 ml Penicillin-Streptomycin-Lösung in einem sterilen 125-ml-Kulturkolben hergestellt. Das gesamte Medium wird gemischt und bei 4 °C unter geschlossenen Bedingungen gelagert.
2. Bereiten Sie die CoCl 2-Lösung vor, indem Sie 0,02 g CoCl_2-Pulver (genau abgewogen) in 10 ml zuckerfreiem DMEM-Medium (vollständig gelöst) hinzufügen, um eine 8,4 mM Stammlösung zu erhalten. Die Lösung wird mit einem 0,22 μm Bakterienfilter filtriert, versiegelt und bei 4 °C lichtgeschützt gelagert.
   HINWEIS: CoCl₂ ist instabil und sollte in einem luftdichten, lichtgeschützten Behälter aufbewahrt werden. Die Gültigkeitsdauer der CoCl_2-Lösung beträgt 7 Tage.
3. Bereiten Sie Tris-Hcl gepufferte Salzlösung (TBST) vor.
   1. 8 g Natriumchlorid, 0,2 g Kaliumchlorid und 3 g Tris-Base genau wiegen. Geben Sie sie in ein 1-Liter-Becherglas und fügen Sie dann 1.000 ml RO-Wasser hinzu, um die Mischung aufzulösen.
   2. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein, fügen Sie 1 ml Tween 20 hinzu und mischen Sie gründlich, um die TBST-Lösung zu erhalten.
      HINWEIS: Tween 20 wirkt als Tensid, um die unspezifische Bindung von Antikörpern an Antigene zu reduzieren, und wirkt am besten bei einer Konzentration von 0,1%.
4. MTT-Lösung (3-(4,5-Dimethylthiazol-2)-2,5-diphenyltetrazoliumbromidsalz) wird durch Wiegen von 0,1 g MTT-Pulver in 20 ml PBS-Lösung hergestellt, um eine Stammlösung von 5 mg/ml zu erhalten. Die Lösung wird mit einem 0,22 μm Bakterienfilter filtriert, versiegelt und bei 4 °C lichtgeschützt in den Standby-Modus versetzt.
   HINWEIS: MTT-Pulver ist instabil und nimmt leicht Feuchtigkeit auf, daher sollte es an einem geschlossenen und trockenen Ort vor Licht geschützt gelagert werden. Die MTT-Lösung läuft nach 7 Tagen ab. MTT hat eine krebserregende Wirkung, daher vermeiden Sie direkten Kontakt mit der Haut.
5. Bereiten Sie die Eri-Kapsellösung vor, indem Sie die Kapselhülle entfernen und 0,18 g des Inhalts in 10 ml zuckerfreiem DMEM-Medium genau wiegen, um eine 100 μM Stammlösung (basierend auf der Konzentration von Scutellarin) herzustellen. Die Lösung wird mit einem 0,2 μm Bakterienfilter filtriert, verschlossen und in einem luftdichten Behälter bei 4 °C gelagert.
   HINWEIS: Scutellarin ist der Hauptwirkstoff in Erigeron breviscapus. Die Konzentration von Scutellarin in den Kapseln wurde mittels HPLC-UV auf 2,56 mg/g, d.h. 5,54 μmol/g⁸, bestimmt. Die Konzentration der Zubereitung wird auf der Grundlage der Scutellarinkonzentration berechnet. Dies ist zweckmäßig, um die pharmakologische Aktivität der Zubereitung und der Komponente zu bewerten.
6. Bereiten Sie die Lösung der Ast-Injektion vor, indem Sie 5 ml Injektion und 5 ml zuckerfreies DMEM-Medium in ein steriles 15-ml-Zentrifugenröhrchen geben, um eine 60 μM-Stammlösung (basierend auf der Konzentration von Astragalosid A) herzustellen. Die Lösung wird durch einen 0,2 μm Bakterienfilter filtriert und in einem luftdichten Behälter bei 4 °C gelagert.
   ANMERKUNG: Das Injektionsvolumen beträgt jeweils 10 ml, und die Konzentration von Astragalosid A in der Injektion wurde mittels HPLC-ELSD auf 0,094 mg/ml (d. h. 120 μM⁾ bestimmt9. Die Zubereitung sollte in einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt und durchgehend lichtdicht betrieben werden. Das Volumen der Injektionslösung und des zuckerfreien Mediums sollte genau gemessen und gut gemischt werden.
7. Bereiten Sie Astragalosid-A-Lösung vor, indem Sie 7,85 mg Astragalosid-A-Standard genau wiegen und vollständig in 2 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) auflösen, um eine 5.000 μM Stammlösung herzustellen. Mit einem 0,22 μm Bakterienfilter filtrieren und luftdicht bei 4 °C lagern.
   HINWEIS: Astragalosid-A-Pulver ist im zuckerfreien Medium unlöslich. Bei der Herstellung der Lösung ist diese mit der entsprechenden Menge DMSO aufzulösen, um die endgültige experimentelle Konzentration von DMSO unter 0,1 % zu halten, um sicherzustellen, dass keine Zytotoxizität entsteht.
8. Bereiten Sie die Scutellarin-Lösung vor, indem Sie 11,56 mg Scutellarin-Standard genau wiegen und vollständig mit 5 ml zuckerfreiem DMEM-Medium auflösen, um eine 5.000 μM Stammlösung herzustellen. Mit einem 0,22 μm Bakterienfilter filtrieren und luftdicht bei 4 °C lagern.
9. Bereiten Sie die Chlorogensäurelösung vor, indem Sie 8,86 mg Chlorogensäurestandard genau wiegen und vollständig mit 5 ml zuckerfreiem DMEM-Medium auflösen, um eine 5.000 μM Stammlösung herzustellen. Mit einem 0,22 μm Bakterienfilter filtrieren und luftdicht bei 4 °C lagern.
   HINWEIS: Chlorogensäurepulver ist instabil und absorbiert leicht Wasser. Es sollte verschlossen und bei 4 °C lichtgeschützt gelagert werden. Die Einwirkzeit während des Wiegens sollte minimiert werden.

2. Zelllebensfähigkeitstest

1. Gewinnen Sie PC12-Zellen und kultivieren Sie sie in DMEM, ergänzt mit 10% FBS, 100 U / ml Penicillin und 100 μg / ml Streptomycin.
   HINWEIS: In dieser Studie stammen die Zellen von der Chinesischen Akademie der Wissenschaften. PC12-Zellen sind adhärente Zellen, die die allgemeinen Eigenschaften neuroendokriner Zellen aufweisen und in der Neurophysiologie und Neuropharmakologie weit verbreitet sind.
2. Die Zellen werden bei 37 °C in einem mit 5%_CO2 angereicherten Inkubator kultiviert und alle 2-3 Tage subkultiviert. Verwenden Sie Zellen in den Passagen 4-8 für alle Experimente.
3. Zellkultur
   1. Behandeln Sie PC12-Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase (70%-80% Zellkonfluenz) mit 1 ml Trypsin (0,25%) und beobachten Sie die Zellen unter einem Mikroskop. Wenn die Zellen rund werden, stoppen Sie die Trypsin-Verdauung, indem Sie 3 ml des gesamten Mediums hinzufügen.
   2. Die Zellen werden in ein steriles 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführt und 5 Minuten lang bei 840 x g zentrifugiert. Verwerfen Sie den Überstand, resuspendieren Sie mit dem vollständigen Medium und überführen Sie die Zellsuspension in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Zählen Sie dann die Anzahl der Zellen mit einem Durchflusszytometer.
      1. Starten Sie die Durchflusszytometrie-Software, wählen Sie das entsprechende Verdünnungsvielfache der Zelllösung in der Zähleinstellung aus und klicken Sie auf Dichtediagramm , nachdem Sie die Zellprobe aus dem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen geladen haben.
      2. Kreisen Sie die Zellpopulation von der X- und Y-Achse weg, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Datentabelle unter der Abbildung, und wählen Sie X, Y, Anzahl und Anzahl Abs aus. Die Daten unter Abs Count in der Datentabelle geben das Ergebnis der Zellzählung an.
   3. Die Zellkonzentration wird auf 1 x 10 5 Zellen/ml eingestellt, 100 μl/Well in 96-Well-Platten beimpft und 24 h bei 37 °C und⁵ %_CO2 in einem Inkubator kultiviert.
4. Screening von sicheren Konzentrationen von zwei Medikamenten auf normalen PC12-Zellen
   1. Kultur der Zellen wie in den Schritten 2.1-2.2 beschrieben. Verwerfen Sie den Überstand und behandeln Sie die normalen Zellen mit unterschiedlichen Endkonzentrationen der Ast-Injektion (4, 8, 12, 16, 20 und 24 μM) und der Eri-Kapsel (0,625, 1,25, 2,5, 5, 10 und 20 μM). Behandeln Sie sechs Replikationswellen jeder Gruppe für 24 Stunden.
      ANMERKUNG: Die Wirkstoffe werden dem Medium zugesetzt, um die Endkonzentration des Arzneimittels zu erreichen (siehe Schritt 2.4.1), und dann wird jeder Vertiefung ein gleiches Medienvolumen zugesetzt. Beim Absaugen des Überstands sollte die Pipettenspitze vorsichtig gegen die Topfwand gelegt werden, um zu vermeiden, dass die Zellen am Boden der Vertiefung berührt werden. Wenn Sie verschiedene Lösungen hinzufügen, fügen Sie sie vorsichtig und schnell entlang der Ränder der Vertiefungen hinzu und achten Sie beim Wechseln des Pipettenpistolenkopfes darauf, die experimentellen Ergebnisse nicht zu beeinflussen.
   2. Verwerfen Sie den Überstand, geben Sie 120 μl MTT-Lösung (1 mg/ml) in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Zellen für 4 h bei 37 °C.
   3. Nach der Inkubation wird der Überstand wieder verworfen und in jede Vertiefung 150 μL DMSO gegeben. Schütteln Sie die Platte 10 Minuten lang mit einer Geschwindigkeit von 240 Mal/Minute (Anzahl der horizontalen Schwingungen pro Minute) mit einem Wirbeloszillator.
   4. Die Extinktion jeder Probe bei 490 nm wird mit einem Mikrotiterplatten-Reader gemessen. Berechnen Sie die Zelllebensfähigkeit (%), d.h. die Absorption der behandelten Gruppe/Absorption der normalen Gruppe (Kontrolle) x 100.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass sich die MTT-Lösung innerhalb des Gültigkeitszeitraums befindet. Wenn sich die Farbe geändert hat (zu dunkelgrün), kann sie nicht verwendet werden. Bei der Prüfung der Absorption von Zellen sollte eine Blindmulde (Kulturmedium und MTT, ohne Zellen oder Medikamente) eingestellt werden, um die Interferenz anderer Reagenzien zu eliminieren. Ein Volumen von 150 μL DMSO wird in jede Vertiefung gegeben und 10 min geschüttelt, um die blau-violetten Kristalle besser aufzulösen. Die Absorption sollte so schnell wie möglich nachgewiesen werden, um die Genauigkeit der Ergebnisse zu gewährleisten.
5. Screening von effektiven Konzentrationen von zwei Medikamenten auf verletzten PC12-Zellen
   1. Die Zellen werden 24 Stunden lang kultiviert, wie in den Schritten 2.1-2.2 beschrieben, der Überstand verworfen und dann die Zellen mit 20 μL/Well_CoCl2 (0,4 mM) in Kombination mit dem zuckerfreien Medium behandelt.
   2. Gleichzeitig werden die Zellen mit 100 μL/Well Ast-Injektion (Endkonzentrationen sind 2, 6, 8, 10 und 12 μM) oder 100 μL Eri-Kapsel (Endkonzentrationen sind 1, 2, 3, 4 und 5 μM) bei 37 °C für weitere 24 h behandelt. Fügen Sie der Kontrollgruppe 120 μL/Well des vollständigen Mediums hinzu.
      HINWEIS: CoCl₂ induziert hypoxische Zustände in den Zellen.
   3. Die Extinktion jeder Probe wird nach der MTT-Methode gemessen und die Lebensfähigkeit der Zelle berechnet, wie zuvor in den Schritten 2.4.2 und 2.4.3 beschrieben.
6. Screening der optimalen Kombination zweier Wirkstoffe auf Basis der homogenen Designmethode
   ANMERKUNG: Nach dem Erreichen des effektiven Konzentrationsbereichs der Astragalus-Injektion und der Breviscapus-Kapsel wurde die Tabelle U 7 (₇ ⁴) verwendet, um sechs verschiedene Kombinationen der beiden Arzneimittel zu erhalten. Ast-Injektion: Eri-Kapsel: 1) 2:2,6 μM, 2) 4:5 μM, 3) 6:1,8 μM, 4) 8:4,2 μM, 5) 10:1 μM und 6)12:3,4 μM.
   1. Die Zellen werden wie oben in Schritt 2.3.1 beschrieben kultiviert und die verletzten PC12-Zellen mit sechs Anteilskonzentrationen der Ast-Injektion:Eri-Kapsel wie oben erwähnt behandelt.
   2. Die Zellen werden 24 Stunden lang behandelt und die Lebensfähigkeit der Zellen berechnet, wie zuvor in den Schritten 2.4.2 und 2.4.3 beschrieben.
7. Bewertung der Schutzwirkung zweier optimaler Kombinationen auf verletzte PC12-Zellen
   HINWEIS: Nach Erhalt der optimalen Präparationskombination (Ast-Injektion: Eri-Kapsel von 6:1,8 μM) und der optimalen Komponentenkombination⁷ (10 μM Astragalosid A, 40 μM Scutellarin und 75 μM Chlorogensäure) wird eine weitere Bewertung durchgeführt, um ihre schützende Wirkung auf verletzte PC12-Zellen zu überprüfen.
   1. Die Zellen werden wie oben in Schritt 2.3.1 beschrieben kultiviert und die verletzten PC12-Zellen mit den beiden Arten von Kombinationen von Arzneimitteln behandelt, wie in der obigen ANMERKUNG beschrieben.
   2. Die Zellen werden 24 Stunden lang behandelt und die Lebensfähigkeit der Zellen berechnet, wie zuvor in den Schritten 2.4.2 und 2.4.3 beschrieben.

3. Annexin V-FITC/PI Assay für die Apoptoserate

1. Die PC12-Zellen werden in einer 12-Well-Platte in einer Konzentration von 1,3 x 10⁵ Zellen/Well ausgesät und bei 37 °C für 24 h kultiviert.
2. Gruppieren Sie die Zellen: Kontrollgruppe, Modellgruppe und zwei Kombinationen von Medikamenten. Fügen Sie der Kontrollgruppe 1,2 ml/Well des vollständigen Mediums hinzu, fügen Sie der Modellgruppe 1,2 mL/Well eines Mediums mit 0,4 mM CoCl2 hinzu und fügen Sie 1,2 mL/Well jeder der beiden Kombinationen mit 0,4 mM CoCl2_hinzu. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C für weitere 24 h.
3. Nach der medikamentösen Behandlung werden die Zellen mit 250 μl/Well Trypsin behandelt, in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführt und bei 840 xg für 5 min bei Raumtemperatur (RT) zentrifugiert. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 500 μL des Bindepuffers.
   1. Inkubieren Sie die Zellen im Dunkeln mit 5 μL Annexin V-FITC und 10 μL Propidiumiodid (PI) für 15 Minuten bei RT und überprüfen Sie dann die Apoptose durch Durchflusszytometrie. Legen Sie in jeder Gruppe drei Replikationsbrunnen fest.
      HINWEIS: Das in diesem Test verwendete Trypsin kann kein EDTA enthalten, da EDTA ein Metallionen-Chelatbildner ist, der mit Annexin V um die Bindung von Calciumionen konkurriert und die Affinität von Annexin zu PI beeinflusst. Wenn Apoptose auftritt, wendet sich Phosphoserin, ursprünglich auf der Innenseite der Zellmembran, nach außen zur Zelloberfläche, und Annexin V-FITC bindet selektiv an Phosphoserin außerhalb der Membran, um grüne Fluoreszenz zu zeigen.
   2. Klicken Sie im Startmenü auf Automatische Kompensation, wählen Sie im Kanal "Auswählen" die Option "FITC", "PE", "PerCP" und "APC" aus, und wählen Sie "Kompensation bei: Höhe" aus. Klicken Sie im Feld Statistikelement: Median auf OK. Sammeln Sie mit der gleichen Zellzählmethode, die in Schritt 2.3.2 erwähnt wurde, die Zellproben, klicken Sie auf die Dichtekarte und kreisen Sie die effektive Zellpopulation ein.
   3. Erstellen Sie mit der FITC-Fluoreszenz als X-Achsenparameter und anderen Fluoreszenzparametern als Y-Achsenparameter eine Dichtekarte. Klicken Sie im Startmenü auf Kompensationsmatrix und in der Überlaufmatrix auf Koeffizient. Die Dichtekarteninformationen werden für die Analyse der Apoptoserate angezeigt.

4. Immunfluoreszenzdetektion der Caspase-3-Generation

1. Die PC12-Zellen werden auf Deckgläser mit einer Dichte von 8 x 10⁴ Zellen/Deckglas gesät und 24 h lang bei 37 °C in 24-Well-Platten gelegt. Gruppieren Sie die Zellen wie oben in Schritt 3.2 beschrieben. Richten Sie für jede Gruppe drei Replikationsdeckgläser ein.
2. Nach medikamentöser Behandlung werden die Deckgläser zweimal mit PBS (37 °C) für jeweils 5 min gespült, mit 4 % Paraformaldehyd für 15 min fixiert und mit 0,5 % Triton X-100 für 20 min bei RT permeabilisiert.
3. Spülen Sie die Zellen erneut und blockieren Sie sie mit 10% Ziegenserum für 1 h bei RT.
4. Inkubieren Sie jedes Deckglas mit 200 μL primärem Antikörper Caspase-3 (ein wichtiges exekutives Protein der Apoptose), verdünnt in einer Konzentration von 1:250 in 1x TBST, über Nacht bei 4 °C. Mit 1x TBST (dreimal à 3 min) waschen und mit 200 μL sekundärem Antikörper (1:300 Verdünnung in 1x TBST) für 1 h bei RT im Dunkeln inkubieren.
   HINWEIS: Die Fluoreszenz lässt sich leicht löschen; Daher sollten die Objektträger nach der Inkubation des sekundären Antikörpers lichtfern gehalten werden. Die primären und sekundären Antikörper sollten bei 4 °C lichtgeschützt gelagert werden.
5. Geben Sie 300 μL DAPI (0,5 μg/ml) für 10 min in die Deckgläser (zum Nachweis der Zellkerne) und waschen Sie die Zellen dreimal mit 1x TBST für jeweils 5 Minuten.
6. Beobachten Sie die Deckgläser unter dem Fluoreszenzmikroskop und nehmen Sie Bilder^{auf 10}. Führen Sie eine statistische Analyse der Fluoreszenzintensität mit der Bildgebungssoftware durch.
   HINWEIS: Die verwendeten Objektträger und Deckgläser sollten sauber und steril sein. Achten Sie beim Färben auf den pH-Wert, die Konzentration und die Temperatur der Färbelösung und vermeiden Sie eine Fluoreszenzlöschung. Das Leuchtstoffmikroskop sollte mindestens 15 Minuten vorher eingeschaltet werden, um die Quecksilberlampe vorzuheizen, und für 30 Minuten ausgeschaltet werden, bevor es wieder eingeschaltet wird. Bei der Aufnahme von Bildern sollten die Belichtungsparameter desselben Farbstoffs in derselben Reihe von Experimenten konsistent sein, um die Genauigkeit der Ergebnisse zu gewährleisten.

5. Immunfluoreszenz-Assay des ROS-Spiegels

1. Kultur und Behandlung der Zellen wie in Schritt 4.1 beschrieben.
2. Nach der medikamentösen Behandlung wird jedes Deckglas dreimal mit PBS für 3 min gewaschen und mit 400 μL DCFH-DA (10 μM) bei 37 °C für 20 min inkubiert.
   HINWEIS: DCFH-DA ist ein universeller Indikator für oxidativen Stress. Es hat eine Durchlässigkeit der Zellmembran und keine Fluoreszenz. Sobald es in die Zelle gelangt, wird es durch Esterase hydrolysiert, um 2',7'-Dichlordihydrofluorescein (DCFH) zu produzieren, und dann schnell oxidiert, um ein stark fluoreszierendes Produkt zu erzeugen.
3. Waschen Sie die Zellen erneut mit serumfreiem DMEM (zweimal für je 3 Minuten) und beobachten Sie das Deckglas sofort nach Zugabe des Fluoreszenzlöschmittels unter dem Fluoreszenzmikroskop. Berechnen Sie die relative Fluoreszenzintensität mit der Bildgebungssoftware.
   HINWEIS: Reinigen Sie nach dem Laden der DCFH-DA-Sonde unbedingt die Restsonde, die nicht in die Zelle eindringt, da sonst der Hintergrund hoch wird.

6. Western-Blot-Nachweis der Proteinexpression von Nrf2, p-Akt, Akt, Bcl-2 und Bax^11,12

1. PC12-Zellen werden in 6-Well-Platten mit einer Konzentration von 1 x 10⁶ Zellen/Well beimpft und bei 37 °C für 24 h kultiviert. Gruppieren und behandeln Sie die Zellen wie in Schritt 4.1 beschrieben, und stellen Sie in jeder Gruppe drei Replikationstöpfe ein.
2. Nach einer medikamentösen Behandlung für 24 h werden die Zellen dreimal mit PBS für jeweils 5 Minuten gewaschen und 30 Minuten in einem vorbereiteten Lysepuffer auf Eis inkubiert. Nach der Lyse werden die Zellen für 20 min bei 16.000 x g und 4 °C zentrifugiert und die Überstände gesammelt.
3. Ermitteln Sie die Proteinkonzentration und stellen Sie sie gemäß den Anweisungen durch den Bradford-Assay ein. Die Proben werden verdünnt und bei 100 °C für 10 min denaturiert.
   ANMERKUNG: Der Lysepuffer besteht aus Phosphatase-Inhibitor, Protease-Inhibitor und RIPA-Lysat in einem Volumenverhältnis von 1:1:50. In der Kontrollgruppe sind 200 μL/Well Lysepuffer und in den anderen Gruppen 100 μL/Well Lysepuffer erforderlich. Im Allgemeinen betragen die Proteinkonzentrationen der Kontroll-, Modell- und zwei Arten von Kombinationsgruppen 0,45 mg/ml, 0,25 mg/ml bzw. 0,32-0,39 mg/ml; ihre Proteinkonzentrationen nach Verdünnung mit dem Beladungspuffer betragen 0,36, 0,2 bzw. 0,256-0,312 mg/ml.
4. Um Proteine mit unterschiedlichen Molekulargewichten nachzuweisen, laden Sie 25 μg Protein in jede Spur, führen Sie eine 12% SDS-PAGE-Elektrophorese durch und übertragen Sie das Gel auf PVDF-Membranen.
   HINWEIS: Während der Herstellung von SDS-Gel muss es vollständig ohne Blasen oder unlösliche Partikel gemischt werden. Andernfalls können ungleichmäßige oder unregelmäßige Bänder auftreten. Achten Sie beim Übertragen der Membranen darauf, dass sich keine Blasen zwischen der PVDF-Membran und dem Gel befinden. Andernfalls erscheinen weiße Flecken im Streifen. Darüber hinaus muss dieser Schritt bei niedrigen Temperaturen durchgeführt werden, und der Eisbeutel sollte alle 30 Minuten gewechselt werden.
5. Die Membranen werden mit 5% fettfreier Milch für 1,5 h bei RT blockiert und mit 5 ml der entsprechenden primären Antikörper (Nrf2 1:1.000, Akt 1:2.000, p-Akt 1:2.000, Bcl-2 1:5.000 und Bax 1:1.000) für 24 h bei 4 °C inkubiert. Verwenden Sie β-Aktin-Antikörper (1:5.000) als interne Kontrolle.
6. Waschen Sie die Membranen mit TBST (dreimal für jeweils 10 Minuten) und inkubieren Sie dann mit 5 ml sekundären HPR-konjugierten Antikörpern (1:5.000) bei RT für 2 h.
   HINWEIS: Das Verdünnungsverhältnis der Antikörper sollte nicht willkürlich geändert werden, und die Membranen sollten in strikter Übereinstimmung mit den Anforderungen ausreichend mit TBST gewaschen werden, um zu vermeiden, dass die Hintergrundfarbe der Bande zu schwarz wird.
7. Zum Schluss waschen Sie die Membran erneut mit TBST und behandeln Sie sie mit chemilumineszierendem HRP-Substrat (gemäß den Anweisungen des Herstellers) zum Nachweis von Proteinbanden. Erfassen Sie die Bilder mit dem Chemilumineszenz-Bildgebungssystem und quantifizieren Sie die Grauwerte der Proteine mit der Bildgebungssoftware, wobei β-Aktin als vergleichende interne Kontrolle dient.

Ergebnisse

Das Screening der optimalen Kombination von Ast-Injektion und Eri-Kapsel ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Zellüberlebensrate von Ast-Injektion und Eri-Kapsel auf den normalen PC12-Zellen ist in Abbildung 1A dargestellt. Die Zelllebensfähigkeit lag unter 95 % bei Ast-Injektion bei Konzentrationen von mehr als 12 μM (Abbildung 1A) und Eri-Kapsel bei Konzentrationen von mehr als 5 μM (Abbildung 1A), was darauf hindeutet, dass d...

Diskussion

In der modernen klinischen Praxis mangelt es immer noch an idealen Medikamenten zur Behandlung der zerebralen Ischämie². Unter der Leitung der Ergänzung des Qi und der Aktivierung der Durchblutungsmethode wurden Ast, Eri und andere Präparate in Kombination in der klinischen Praxis der TCM verwendet und haben gute umfassende Vorteile erzielt^13,14,15. Eine große Anzahl von Studien hat gezeigt, dass Ast ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1300 series class II biosafety cabinet	Thermo Fisher Scientific Instruments Company	1374
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide	Guangzhou saiguo biotech Company	1334GR001	MTT
ACEA NovoExpress 1.4.0	ACEA Biosciences, Inc	-
Akt	Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc	10176-2-AP
Analytical flow cytometry	Thermo Fisher Scientific Instruments Company	62-2-1810-1027-0
Annexin V-FITC apoptosis detection kit	Beyotime Biotechnology Company	C1062L
Astragalus injection	Heilongjiang Zhenbao Island Pharmaceutical Company	A03190612144	Ast injection
Astragaloside A	Chongqing Gao Ren Biotechnology Company	84687-43-4
Bax	Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc	60267-1-Ig
BCA protein quantification kit	Beyotime Biotechnology Company	P0012
Bcl-2	Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc	26593-1-AP
Carbon dioxide incubators	Thermo Fisher Scientific Instruments Company	0816-2014
Caspase-3	Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc	19677-1-AP
Chlorogenic acid	Chongqing Gao Ren Biotechnology Company	327-97-9
Cobalt chloride hexahydrate	Merck Biotechnology, Inc.	7791-13-1	CoCl2
Dimethyl sulfoxide	Guangzhou saiguo biotech Company	2020112701	DMSO
Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate	Chengdu Kolon Chemical Company	2020090101
DMEM high sugar medium	Thermo scientific Hyclone	2110050
DMEM sugar free medium	Beijing Solarbio life sciences Company	2029548
ECL luminous fluid	Lianshuo Biological Company	WBKLS0500
Electronic balance	Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China	FA1204
Electrophoresis instrument	Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd	1658026
Erigeron breviscapus capsule	Yunnan Biogu Pharmaceutical Company	Z53021671	Eri capsule
Fetal bovine serum	Four Seasons Institute of Biological Engineering	20210402	FBS
Fluorescent microscope	Olympms Corporation	IX71-F32PH
Gel imager	Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd	1708265
Goat anti-mouse secondary antibody	Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc	SA00001-1
Goat anti-rabbit secondary antibody	Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc	SA00001- 2
IBM SPSS Statistics version 26.0	International Business Machines Corporation, USA	-
ImageJ 1.8.0	National Institutes of Health, USA	-	imaging software
Immunol fluorescence staining kit	Beyotime Biotechnology Company	P0196
KCl	Chengdu Kolon Chemical Company	2021070901
Marker	Thermo Fisher Scientific Instruments Company	26616
Microplate reader	Perkin Elmer Corporate Management (Shanghai) Co.	HH35L2018296
Motic Inverted microscope	Nanda Scientific Instruments Co.	AE2000LED
NaCl	Chengdu Kolon Chemical Company	2014081301
Nonfat milk	Beyotime Biotechnology Company	P0216
Nrf2	Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc	16396-1-AP
P-Akt	Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc	66444-1-Ig
PC12 cells	Chinese Academy of Sciences	CBP60430
Penicillin-Streptomycin solution	Thermo scientific Hyclone	SV30010
Phosphatase protease inhibitor mixture	Beyotime Biotechnology Company	P1045
Potassium dihydrogen phosphate	Chengdu Kolon Chemical Company	2015082901
Reactive oxygen species assay kit	Beyotime Biotechnology Company	S0033S
RI-PA lysis solution	Beyotime Biotechnology Company	P0013B
Scutellarin	Chongqing Gao Ren Biotechnology Company	27740-01-8
SDS-PAGE sample loading buffer, 5x	Beyotime Biotechnology Company	P0015L
Sterile filter tips (0.22 µm)	Merck Biotechnology, Inc.	SLGP033RB
Tris-base	Guangzhou saiguo biotech Company	1115GR500	TBS
Trypsin	Thermo scientific Hyclone	J190013
Tween-20	Chengdu Kolon Chemical Company	2021051301
Vortex oscillator	OHAUS International Co., Ltd., Shanghai, China	VXMNAL
β-actin	Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc	66009-1-Ig