Infektion von primären nasalen Epithelzellen, die an einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche gezüchtet wurden, zur Charakterisierung menschlicher Coronavirus-Wirt-Interaktionen

Zusammenfassung

Das Nasenepithel ist die primäre Barrierestelle, auf die alle respiratorischen Krankheitserreger treffen. In dieser Arbeit skizzieren wir Methoden zur Verwendung von primären nasalen Epithelzellen, die als Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkulturen (ALI) gezüchtet wurden, um menschliche Coronavirus-Wirt-Interaktionen in einem physiologisch relevanten System zu charakterisieren.

Zusammenfassung

Drei hochpathogene humane Coronaviren (HCoVs) - SARS-CoV (2002), MERS-CoV (2012) und SARS-CoV-2 (2019) - sind aufgetaucht und haben in den letzten 20 Jahren erhebliche Krisen im Bereich der öffentlichen Gesundheit verursacht. Vier weitere HCoVs verursachen jedes Jahr einen signifikanten Anteil an Erkältungsfällen (HCoV-NL63, -229E, -OC43 und -HKU1), was die Bedeutung der Untersuchung dieser Viren in physiologisch relevanten Systemen unterstreicht. HCoVs dringen in die Atemwege ein und infizieren sich im Nasenepithel, dem primären Ort, an dem alle respiratorischen Krankheitserreger auftreten. Wir verwenden ein primäres nasales Epithelkultursystem, bei dem von Patienten stammende Nasenproben an einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche (ALI) gezüchtet werden, um Wirt-Pathogen-Interaktionen an diesem wichtigen Sentinel-Ort zu untersuchen. Diese Kulturen rekapitulieren viele Merkmale der In-vivo-Atemwege , einschließlich der vorhandenen Zelltypen, der Ziliarfunktion und der Schleimproduktion. Wir beschreiben Methoden zur Charakterisierung der viralen Replikation, des Wirtszelltropismus, der virusinduzierten Zytotoxizität und der Induktion des angeborenen Immunsystems in nasalen ALI-Kulturen nach HCoV-Infektion, wobei wir aktuelle Arbeiten zum Vergleich von letalen und saisonalen HCoVs als Beispiel verwenden¹. Ein besseres Verständnis der Wirt-Pathogen-Interaktionen in der Nase hat das Potenzial, neue Angriffspunkte für antivirale Therapeutika gegen HCoVs und andere Atemwegsviren zu liefern, die wahrscheinlich in Zukunft auftauchen werden.

Einleitung

Bisher wurden sieben humane Coronaviren (HCoVs) identifiziert, die eine Reihe von Atemwegserkrankungen verursachen². Die häufigen oder saisonalen HCoVs (HCoV-NL63, -229E, -OC43 und -HKU1) sind typischerweise mit der Pathologie der oberen Atemwege assoziiert und verursachen jährlich schätzungsweise 10 % bis 30 % der Erkältungsfälle. Obwohl dies der typische klinische Phänotyp ist, der mit den häufigen HCoVs assoziiert ist, können diese Viren in Risikopopulationen, einschließlich Kindern, älteren Erwachsenen und immungeschwächten Personen, signifikantere Erkrankungen der unteren Atemwege verursachen ^3,4. In den letzten 20 Jahren sind drei pathogene HCoVs aufgetaucht und haben erhebliche Notlagen im Bereich der öffentlichen Gesundheit verursacht, darunter das schwere akute respiratorische Syndrom (SARS)-CoV, das Atemwegssyndrom des Nahen Ostens (MERS)-CoV und SARS-CoV-2. Tödliche HCoVs sind mit schwereren Atemwegserkrankungen assoziiert, was durch die Sterblichkeitsrate von >34 % im Zusammenhang mit MERS-CoV-Fällen (894 Todesfälle bei über 2.500 Fällen seit dem Auftreten im Jahr 2012) deutlich ^wird5,6. Es ist wichtig zu beachten, dass die tödlichen HCoVs auch eine Reihe von Atemwegserkrankungen verursachen, von asymptomatischen Infektionen bis hin zu tödlichen Lungenentzündungen, wie bei der anhaltenden COVID-19-Pandemie^{zu sehen ist 7}.

HCoVs gelangen wie andere respiratorische Erreger in die Atemwege und etablieren eine produktive Infektion im Nasenepithel⁸. Es wird angenommen, dass die Ausbreitung in die unteren Atemwege mit der Aspiration von der Mund-/Nasenhöhle in die Lunge verbunden ist, wo HCoVs eine bedeutendere Pathologie der unteren Atemwege verursachen 9,10,11. Somit dient die Nase als Ausgangspforte für den Viruseintritt und ist mit ihrer robusten mukoziliären Clearance-Maschinerie und einzigartigen angeborenen Immunmechanismen, die darauf abzielen, eine weitere Ausbreitung des Virus in die unteren Atemwege zu verhindern, die primäre Barriere für Infektionen^12,13. Zum Beispiel wurde berichtet, dass Nasenepithelzellen überdurchschnittlich hohe basale Konzentrationen von antiviralen Interferonen und Interferon-stimulierten Genen exprimieren, was darauf hindeutet, dass Nasenzellen auf frühe Reaktionen auf Atemwegsviren vorbereitet sein könnten^14,15,16.

Wir haben zuvor von Patienten stammende primäre Nasenepithelzellen, die an einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche (ALI) gezüchtet wurden, verwendet, um HCoV-Wirt-Interaktionen in der Nase zu modellieren, wo HCoV-Infektionen beginnen. Nasale ALI-Kulturen sind sowohl für pathogene (SARS-CoV-2 und MERS-CoV) als auch für gängige HCoVs (HCoV-NL63 und HCoV-229E) permissiv und bieten verschiedene Vorteile gegenüber herkömmlichen Atemwegsepithelzelllinien wie A549 (eine Lungenadenokarzinom-Zelllinie)^16,17. Nach der Differenzierung enthalten nasale ALI-Kulturen eine heterogene zelluläre Population und weisen viele der Funktionen auf, die vom in vivo Nasenepithel erwartet werden, wie z. B. die mukoziliäre Clearance-Maschinerie¹⁸. Nasenzellen bieten auch Vorteile gegenüber Kultursystemen der unteren Atemwege (z. B. humane Bronchialepithelzellen, HBECs), da die Gewinnung von Nasenepithelzellen durch zytologisches Zähneputzen im Vergleich zur Verwendung von Techniken wie der Bronchoskopie zur Erzielung von HBECs deutlich weniger invasiv ist 19,20,21.

In dieser Arbeit werden Methoden zur Nutzung dieses nasalen ALI-Kultursystems zur Charakterisierung von HCoV-Wirt-Interaktionen im Nasenepithel beschrieben. Wir haben diese Methoden in kürzlich veröffentlichten Arbeiten angewendet, um SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63 und HCoV-229E 1,16,17 zu vergleichen. Obwohl diese Methoden und repräsentativen Ergebnisse die Untersuchung von HCoVs in diesem nasalen Zellmodell hervorheben, ist das System in hohem Maße anpassungsfähig an andere HCoVs sowie andere respiratorische Krankheitserreger. Darüber hinaus können diese Methoden breiter auf andere ALI-Kultursysteme angewendet werden, um die virale Replikation und den zellulären Tropismus sowie die Zytotoxizität und die Induktion des angeborenen Immunsystems nach einer Infektion zu untersuchen.

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Protokoll

Die Verwendung von Nasenproben wurde vom University of Pennsylvania Institutional Review Board (Protokoll # 800614) und dem Philadelphia VA Institutional Review Board (Protokoll # 00781) genehmigt.

1. Infektion von nasalen ALI-Kulturen

ANMERKUNG: Die Gewinnung klinischer Proben sowie das Wachstum und die Differenzierung von nasalen ALI-Kulturen liegen außerhalb des Rahmens dieser Arbeit. Spezifische Methoden zur Kultivierung primärer nasaler Epithelzellen finden sich in kürzlich veröffentlichten Arbeiten, in denen diese Kulturen verwendet werden 18,22,23. Die folgenden Protokolle können auf Wunsch zusätzlich auf kommerziell erhältliche nasale epitheliale ALI-Kulturen angewendet werden. Die unten aufgeführten Protokolle und Volumina gelten für 24-Well-Plattentranswell-Einsätze (6,5 mm Durchmesser, 0,33^cm2 Membranoberfläche). Wenn Sie ALI-Kulturen verwenden, die auf größeren Transwells (d. h. 12-Well-Platten, 12 mm Durchmesser, 1,12^cm2 Oberfläche) gezüchtet wurden, passen Sie die Volumina proportional an, um die Transwell-Größe widerzuspiegeln.

1. Tag vor der Infektion:
   1. ALI-Kulturen 3x mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) apikal waschen (~200 μl erwärmtes PBS zugeben, 5 min in einen 37 °C warmen Inkubator geben, PBS absaugen und wiederholen).
   2. Basalmedium (500 μl) ersetzen.
   3. Lassen Sie die Kulturen bei der Temperatur, bei der Infektionen durchgeführt werden, über Nacht ausbalancieren (d. h. bei einer Infektion bei 33 °C sollten die Kulturen nach dem Waschen von PBS in einen 33 °C-Inkubator gegeben werden).
      HINWEIS: HCoV, die mit einer Erkältung in Verbindung gebracht werden, wie HCoV-229E und HCoV-NL63, replizieren sich bei 33 °C effizienter. Darüber hinaus beträgt die Temperatur des in vivo Nasenepithels 33 °C (dies unterscheidet sich von der Temperatur der Lunge, die 37 °C beträgt).
2. Verdünnen Sie das Virus nach Bedarf in serumfreiem Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), um die gewünschte Infektionsvielfalt (MOI) in einem Gesamtinokulumvolumen von 50 μl zu erreichen.
   HINWEIS: Infektionen wurden in der Regel bei MOI = 5 (hohes MOI) durchgeführt; Infektionen mit MOI = 0,5 (niedriges MOI) wurden jedoch auch für SARS-CoV-2 und Erkältungs-assoziierte HCoVs verwendet, und diese führen zu vergleichbaren Virushöchsttitern, jedoch mit variabler Kinetik (beide MOI sind akzeptabel).
3. Intrakulum apikal zugeben und die Kulturen für 1 Stunde zurück in den Inkubator geben.
4. Platten während der Infektion alle 15 Minuten vorsichtig rocken (Platte fest in beiden Händen halten, nach vorne und hinten und von einer Seite zur anderen wippen, um eine gleichmäßige Adsorption des Virusinokulums zu gewährleisten).
5. Nach 1 Stunde Inkubation wird das Virusinokulum abgesaugt und jede infizierte Kultur 3x mit PBS gewaschen, um sicherzustellen, dass das virale Inokulum entfernt wird (für jedes Waschen 200 μl PBS hinzufügen, 5 Minuten inkubieren und mit einer Pipette aspizieren oder entfernen).
6. Falls gewünscht, entnehmen Sie die dritte PBS-Wäsche, um eine ausreichende Entfernung des eingebrachten Virus zu bestätigen.
7. Ersetzen Sie das Basalmedium bei infizierten ALIs während der Infektion alle 72 Stunden durch frisches Medium.

2. Entnahme der apikalen Oberflächenflüssigkeit (ASL) und Titration des ausgeschiedenen Virus

1. Zu vorbestimmten Zeitpunkten nach der Infektion werden 200 μl PBS in die apikale Kammer jedes infizierten Transwells gegeben.
   HINWEIS: Relevante Zeitpunkte variieren je nach HCoV und reichen von 24 Stunden bis 192 Stunden nach der Infektion (siehe Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" für virale Replikationsdaten für verschiedene HCoVs).
2. Pipettieren Sie PBS 5x nach oben und unten, um eine maximale Sammlung des apikal ausgeschiedenen Virus zu gewährleisten, und sammeln Sie das gesamte Volumen in einem Mikrozentrifugenröhrchen (dies ist die ASL-Probe).
   HINWEIS: ASL enthält neben Schleim und anderen Produkten, die apikal aus ALI-Kulturen abgesondert werden, auch ausgeschiedene Viruspartikel.
3. Quantifizierung infektiöser Viren bei ASL mittels Standard-Virusplaque-Assay (serielle Verdünnung virushaltiger Proben, um die Konzentration von Viruspartikeln zu quantifizieren).
   HINWEIS: Die Zelltypen und die Inkubationszeit, die für den Plaque-Assay verwendet werden, hängen vom verwendeten Virus ab: SARS-CoV-2 (VeroE6-Zellen); MERS-CoV (VeroCCL81-Zellen); HCoV-NL63 (LLC-MK2-Zellen); HCoV-229E (Huh7-Zellen). Einzelheiten zur Durchführung von viralen Plaque-Assays gehen über den Rahmen dieses Manuskripts hinaus, wurden aber bereits in einer Veröffentlichung des Journal of Visualized Experiments (JoVE)²⁴ beschrieben.
4. Falls gewünscht, sammeln Sie das Basalmedium zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion, um die Abwesenheit von basal freigesetztem Virus zu bestätigen. HCoVs werden in der Regel apikal aus nasalen Epithelzellen freigesetzt, bestätigen dies jedoch durch einen Plaque-Assay mit unverdünntem Basalmedium.
5. ASL-Proben bei −80 °C lagern, wenn am Tag der Entnahme keine Quantifizierung mittels Plaque-Assay erfolgt.

3. Quantifizierung des intrazellulären Virus

1. Nach der Entnahme der ASL-Probe wird jedes Transwell in eine saubere 24-Well-Platte gelegt, die mit 500 μl DMEM vorgeladen ist, die basal 2 % fötales Kälberserum (FBS) enthält.
   HINWEIS: DMEM mit 2 % FBS wird verwendet, um das Virus während der nachfolgenden Gefrier-Auftau-Zyklen zu stabilisieren.
2. Waschen Sie jedes Transwell 3x apikal mit PBS, um sicherzustellen, dass das apikal ausgeschiedene Virus vollständig entfernt wird.
3. Nach dem Absaugen, um die letzte PBS-Wäsche zu entfernen, geben Sie 100 μl DMEM mit 2 % FBS in das apikale Kompartiment.
4. Bringen Sie die Platte mit Transwells mit apikalen und basalen Medien in einen Gefrierschrank von −80 °C und führen Sie drei aufeinanderfolgende Gefrier-Auftau-Zyklen durch, um die Zellen zu lysieren.
5. Nach dem letzten Gefrier-Auftau-Zyklus apikale (100 μl) und basale (500 μl) Medien in ein sauberes Röhrchen geben.
6. Bei 500 × g 10 min bei 4 °C zentrifugieren, um Zelltrümmer zu pelletieren.
7. Sammle den Überstand ein. Dies ist die intrazelluläre Virusprobe für die Titration mittels Standard-Plaque-Assay.
   HINWEIS: Während des Entnahmeprozesses erfolgt eine dreifache Verdünnung im Vergleich zur ASL-Entnahme. ASL-Proben werden in 200 μl PBS gesammelt, während intrazelluläre Virusproben in einem Gesamtvolumen von 600 μl gesammelt werden.

4. Messung des transepithelialen elektrischen Widerstands (TEER)

HINWEIS: Für die TEER-Messung sollte PBS mit Kalzium und Magnesium (PBS + Ca 2+/Mg²⁺) ergänzt werden. Es wird ein Epithelvolt/Ohmmeter verwendet, das auf die Ablesung in Ohm eingestellt ist (siehe Materialtabelle).

1. Reinigen, balancieren und leeren Sie das EVOM-Instrument gemäß den Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie ein "leeres" Transwell ohne zugesetzte Nasenzellen zum Ausblenden. Zeichnen Sie die TEER-Messung des Blindwerts auf.
   HINWEIS: Wenn mehrere Viren verwendet werden, muss das EVOM-Gerät zwischen den Bedingungen streng gereinigt werden, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden (Waschen mit 70 % Ethanol, gefolgt von deionisiertem Wasser ist ausreichend).
2. Legen Sie jedes infizierte Transwell in eine vorbeschriftete, saubere 24-Well-Platte mit 500 μl PBS + Ca 2+/Mg²⁺ basal, um das restliche Basalmedium aus den Transwells zu waschen.
3. 200 μl PBS + Ca 2+/Mg²⁺ in das apikale Kompartiment jedes Transwells geben.
4. 1 ml PBS + Ca 2+/Mg²⁺ in die Endohm-6 Messkammer geben.
5. Bewegen Sie jedes Transwell in die Endohm-6-Messkammer und setzen Sie den Deckel der Kammer wieder auf, so dass die apikale Elektrode in den 200 μl PBS im apikalen Kompartiment ruht. Die Basalelektrode ist in den Boden der Endohm-6-Kammer eingebaut.
6. Warten Sie, bis sich der EVOM-Messwert stabilisiert hat, und zeichnen Sie die TEER-Rohmessung auf.
7. Entnehmen Sie die ASL-Probe wie oben beschrieben nach der TEER-Messung, wenn eine Titrierung gewünscht ist (sammeln Sie die 200 μl PBS + Ca 2+/Mg²⁺, die für die TEER-Messung hinzugefügt wurden).
   HINWEIS: Die ASL-Probenentnahme kann Mikrorisse in der Epithelbarriere verursachen, die die TEER-Messwerte verfälschen können, daher muss ASL nach der TEER-Messung entnommen werden. Darüber hinaus darf das Basalmedium nicht unmittelbar vor den TEER-Messungen gewechselt werden, da dies auch die TEER-Werte beeinflussen kann.
8. Um die TEER-Rohwerte in endgültige Messungen in Ohm/cm² umzurechnen, subtrahieren Sie den leeren TEER-Wert und multiplizieren Sie diesen Wert mit der Oberfläche der Transwell-Membran unter Verwendung von Gleichung (1):
   TEER = [TEER-Messwert - leerer TEER-Wert] × (Oberfläche des Transwells) (1)
9. Bei HCoVs sollte TEER alle 24 Stunden oder 48 Stunden nach der Infektion ausgewertet werden. Die Kinetik von TEER-Veränderungen variiert oft zwischen Viren und erfordert eine Fehlerbehebung zu verschiedenen Zeitpunkten.
10. Bei der TEER-Messung sollten immer simulierte infizierte Kulturen einbezogen und zu jedem Zeitpunkt ausgewertet werden (Negativkontrolle).
    HINWEIS: Bei Scheinkulturen sollten die TEER-Messungen stabil bleiben oder können nach Abschluss der Differenzierung der Kulturen leicht gegenüber dem Ausgangswert ansteigen. Die Oberfläche der Membranstützen variiert je nach Größe und Hersteller der Transwellen. 24-Well-Transwells haben typischerweise eine Oberfläche von 0,33^cm2.

5. Messung der Zytotoxizität während der Infektion mittels Laktatdehydrogenase (LDH)-Assay

HINWEIS: In dieser Arbeit wurde der LDH-Gehalt in ASL-Proben mit einem kommerziell erhältlichen Zytotoxizitätsnachweiskit quantifiziert. Das LDH-Signal im basalen Medium lag oft unter der Nachweisgrenze und war oft weniger reproduzierbar als LDH, das in ASL-Proben aus HCoV-infizierten Kulturen quantifiziert wurde.

1. Bereiten Sie zusätzliche Kontrollen vor, die für den LDH-Assay erforderlich sind.
   1. Hintergrundkontrolle: PBS verwenden (PBS verwenden, das Kalzium und Magnesium enthält, wenn ASL-Proben auf diese Weise entnommen wurden).
   2. Positivkontrolle (Obergrenze): ALIs apikal mit Triton X-100 behandeln. Sammeln Sie Triton-Kontrollwellen (verwenden Sie dafür in der Regel drei ALI-Kulturen zu jedem Zeitpunkt).
      1. 200 μl 2%iges Triton X-100 in PBS direkt in das apikale Kompartiment des Transwells geben.
      2. 10-15 Minuten inkubieren, damit die Zellen vollständig lysieren können.
      3. Sammeln Sie das gesamte Volumen als Triton-Deckenprobe.
   3. Negativkontrolle (niedrige Kontrolle/LDH-Freisetzung zu Studienbeginn): ASL wird aus simulierten infizierten ALI-Kulturen gesammelt, die vom gleichen Spender wie infizierte Kulturen stammen.
      1. Sammeln Sie Negativkontroll-Mock-ASL gemäß dem oben beschriebenen ASL-Erfassungsverfahren.
         HINWEIS: Für diese Negativkontrolle können für alle Zeitpunkte die gleichen Transwells verwendet werden, während für die Triton-Kontrolle für jeden Zeitpunkt neue Transwells erforderlich sind.
2. Um zusätzlich zu den LDH-Messwerten aus jeder ASL-Probe auch die Quantifizierung des abgestoßenen Virus zu ermöglichen, laden Sie eine optisch klare, schwarze 96-Well-Platte mit flachem Boden wie folgt:
   1. Verdünnen Sie alle Proben in PBS mit 45 μl Probe und 55 μl PBS (100 μl Gesamtvolumen).
   2. Behandeln Sie Triton-Positivkontroll- und simulierte Hintergrundkontrollproben auf die gleiche Weise.
      HINWEIS: Diese Verdünnung ermöglicht eine dreifache Beladung jeder experimentellen Probe (45 μl x 3) und ein ausreichendes ASL-Restvolumen für die Titrierung mittels Plaque-Assay.
   3. Laden Sie die LDH-Platte in dreifacher Ausfertigung: Triton-Decke, simulierte Hintergrundsteuerung, PBS-Kontrolle und experimentelle Proben.
   4. Bereiten Sie die Reaktionsmischung nach Herstellerangaben vor (Farbstofflösung + Katalysator).
      1. Geben Sie 100 μl Reaktionsmischung in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur 20 Minuten lang lichtgeschützt.
   5. Nach 20 min wird die Absorption bei 492 nm gemessen.
   6. Berechnen Sie die prozentuale Zytotoxizität relativ zum Triton-Grenzwert mit Gleichung (2).
      Zytotoxizität (%) (2)

6. Präparation von nasalen ALI-Kulturen für die Immunfluoreszenz-Bildgebung (IF)

1. Legen Sie das Transwell in eine frische 24-Well-Platte und waschen Sie es 3x apikal mit PBS (sammeln Sie die erste PBS-Wäsche als ASL, wenn Sie titerieren; führen Sie dann zwei weitere PBS-Wäschen durch, um überschüssige abgestoßene Viren zu entfernen, die die IF-Qualität beeinträchtigen könnten)
2. Nach der letzten PBS-Wäsche wird der Transwell apikal und basal mit 4 % PFA bedeckt.
3. 30 Minuten lang inkubieren, um 4% PFA einzubinden, dann entfernen und 3x mit PBS waschen.
4. Schneiden Sie die Transwell-Stütze, die die Zellen enthält, mit einer geschärften Rasierklinge oder Schere heraus.
5. Um die Anzahl der IF-Targets für jedes Transwell zu erhöhen, schneiden Sie jede Membran in zwei Hälften und färben Sie jede Hälfte mit verschiedenen Antikörperkombinationen.
6. Permeabilisieren mit 0,2% Triton X-100 in PBS für 10 min.
7. Blockieren Sie mit 10 % normalem Eselsserum und 1 % BSA in PBST (PBS + 0,2 % Triton X-100) für 60 Minuten bei Raumtemperatur.
   HINWEIS: Schützen Sie die Proben ab diesem Schritt vor Lichteinwirkung.
8. In Primärantikörperlösung über Nacht bei 4 °C inkubieren. Verdünnen Sie alle Antikörper im Verhältnis 1:1.000 in Blockierungspuffer.
   HINWEIS: Repräsentative Antikörper für die HCoV-Nukleokapsidfärbung sowie Epithelzelltypmarker und Zytoskelettfärbungen sind unten aufgeführt (Herstellerinformationen und Katalognummern finden Sie in der Materialtabelle ).
   1. Verwenden Sie für die HCoV-Antigenfärbung Antikörper, die gegen SARS-CoV-2-Nukleokapsid, MERS-CoV-Nukleokapsid und HCoV-NL63-Nukleokapsid gerichtet sind.
   2. Um Epithelzelltypen zu identifizieren, verwenden Sie Antikörper, die gegen den Becherzellmarker MUC5AC und den Zilienzellmarker Typ IV β-Tubulin gerichtet sind.
   3. Verwenden Sie für Zytoskelett-Marker Antikörper, die gegen Phalloidin (bindet F-Aktin) und Epithelzelladhäsionsmarker EpCAM (CD326) gerichtet sind.
9. 60 Minuten bei Raumtemperatur in sekundärer Antikörperlösung inkubieren; Verwenden Sie Sekundärantikörperfarbstoffe, die im Verhältnis 1:1.000 in Blocking-Puffer verdünnt sind.
10. Nachdem die Färbung abgeschlossen ist, übertragen Sie die Membran mit einem Spatel auf einen Objektträger, richten Sie das Transwell mit der apikalen Seite in Richtung des Objektträgers aus und fügen Sie die Montagelösung hinzu. 15-30 Minuten einwirken lassen, bevor Sie den klaren Nagellack an den Rändern auftragen.
11. Aufnahme von Bildern mit einem konfokalen Mikroskop (Z-Achsenschritt: 0,5 μm; sequentielles Scannen)1,16,17.
    HINWEIS: Nach der Fixierung der Kulturen in 4% PFA und dem Waschen mit PBS können fixierte Kulturen vor der Färbung und Vorbereitung für die Bildgebung Wochen bis Monate bei 4 °C gelagert werden. Nach der Färbung und Einbettung der Membranen können die Proben langfristig (>2 Jahre) bei 4 °C im Dunkeln gelagert werden.

7. Sammlung von intrazellulärem Protein für das Western Immunoblotting oder RNA für die RT-qPCR-Analyse

1. Sammeln Sie ASL wie oben beschrieben, wenn Sie virale Titer quantifizieren (Protokollabschnitt 2).
2. Schieben Sie das Transwell auf eine saubere 24-Well-Platte, da das Schaben der Membran zum Bruch des Einsatzes führen kann.
3. Für die Western-Blot-Analyse wird das Gesamtproteinlysat in 125 μl RIPA-Puffer (50 mM Tris, pH 8, 150 mM NaCl, 0,5 % Desoxycholat, 0,1 % SDS, 1 % NP40) gesammelt, ergänzt mit Protease-Inhibitoren und Phosphatase-Inhibitoren.
4. Geben Sie 125 μl RIPA-Puffer in das apikale Kompartiment und inkubieren Sie 5-10 Minuten.
5. Kratzen Sie die Membran mit einer P200-Pipettenspitze ab, um alle verbleibenden anhaftenden Zellen zu entfernen, und sammeln Sie das gesamte Volumen (kratzen Sie kräftig über die gesamte Oberfläche der Membran und pipettieren Sie dann mehrmals auf und ab, um die gesamte Probe zu sammeln).
6. Proteinlysatproben werden 10 Minuten lang auf Eis inkubiert und dann 10 Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit (20.000 × g) bei 4 °C zentrifugiert.
7. Mischen Sie den Überstand mit 4x Laemmli Probenpuffer mit β-Mercaptoethanol (Reduktionsmittel) gemäß den Herstellerprotokollen.
8. Kochen Sie Proteinproben 5 Minuten lang bei 95 °C und lassen Sie sie dann mit den traditionellen Western-Blotting-Protokollen 1,16,17 laufen.
9. Verwenden Sie für die Entnahme von Gesamt-RNA ein handelsübliches RNA-Extraktionskit Ihrer Wahl.
   HINWEIS: Das apikale Kompartiment von 24-Well-Transwell-Inserts hat ein maximales Volumen von ~200 μl; Daher führen wir zwei aufeinanderfolgende Waschungen an jeder Kultur durch, um das empfohlene Gesamtvolumen zu erreichen. Die folgenden Angaben entsprechen der empfohlenen Entnahme von RNA-Proben in einem Gesamtvolumen von 350 μl.
10. 200 μl Lysepuffer werden in das apikale Kompartiment des infizierten Transwells gegeben.
11. Lassen Sie es 5-10 Minuten einwirken, kratzen Sie alle verbleibenden Zellen mit einer Pipettenspitze von der Membran ab und sammeln Sie das gesamte Volumen in einem beschrifteten Mikrozentrifugenröhrchen.
12. Geben Sie 150 μl zusätzlichen Lysepuffer in das apikale Kompartiment des Transwell und pipettieren Sie es auf und ab, bevor Sie es in dasselbe Mikrozentrifugenröhrchen sammeln.
13. Extrahieren Sie die RNA gemäß dem Protokoll des Herstellers.

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Ergebnisse

Die repräsentativen Abbildungen sind teilweise aus Daten adaptiert, die im Manuskript Otter et ^al.1 zu finden sind. Nasale ALI-Kulturen, die von vier oder sechs Spendern stammten, wurden gemäß den oben beschriebenen Protokollen mit einem von vier HCoVs (SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63 und HCoV-229E) infiziert, und die durchschnittlichen apikal ausgeschiedenen Virustiter für jedes Virus sind in Abbildung 1A dargestellt. Während sich alle vier HCoVs produktiv in na...

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Diskussion

Die hier beschriebenen Methoden beschreiben ein primäres Epithelkultursystem, in dem von Patienten stammende Nasenepithelzellen an einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche gezüchtet und zur Untersuchung von HCoV-Wirt-Interaktionen eingesetzt werden. Nach der Differenzierung rekapitulieren diese nasalen ALI-Kulturen viele Merkmale des in vivo Nasenepithels, einschließlich einer heterogenen Zellpopulation mit Flimmer-, Kelch- und Basalzellen sowie einer intakten mukoziliären Funktion mit robust schlagenden Zilien...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor secondary antibodies (488, 594, 647)	Invitrogen	Various
BSA (bovine serum albumin)	Sigma-Aldrich	A7906
cOmplete mini EDTA-free protease inhibitor	Roche	11836170001
Cytotoxicity detection kit	Roche	11644793001
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media)	Gibco	11965-084
DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)	Gibco	14190136
DPBS + calcium + magnesium	Gibco	14040-117
Endohm-6G measurement chamber	World Precision Instruments	ENDOHM-6G
Epithelial cell adhesion marker (EpCAM; CD326)	eBiosciences	14-9326-82
Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM)	World Precision Instruments	300523
FBS (Fetal Bovine Serum)	HyClone	SH30071.03
FV10-ASW software for imaging	Olympus	Version 4.02
HCoV-NL63 (Human coronavirus, NL63)	BEI Resources	NR-470
HCoV-NL63 nucleocapsid antibody	Sino Biological	40641-V07E
Hoescht stain	Thermo Fisher	H3570
Laemmli sample buffer (4x)	BIO-RAD	1610747
LLC-MK2 cells	ATCC	CCL-7	To titrate HCoV-NL63
MERS-CoV (Human coronavirus, Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV), EMC/2012)	BEI Resources	NR-44260
MERS-CoV nucleocapsid antibody	Sino Biological	40068-MM10
MUC5AC antibody	Sigma-Aldrich	AMAB91539
Olympus Fluoview confocal microscope	Olympus	FV1000
Phalloidin-iFluor 647 stain	Abcam	ab176759
PhosStop easy pack (phosphatase inhibitors)	Roche	PHOSS-RO
Plate reader	Perkin Elmer	HH34000000	Any plate reader or ELISA reader is sufficient; must be able to read absorbance at 492 nm
RIPA buffer (50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; 0.5% deoxycholate; 0.1% SDS; 1% NP40)	Thermo Fisher	89990	Can prep in-house or purchase
RNeasy Plus Kit	Qiagen	74134
SARS-CoV-2 (SARS-Related Coronavirus 2, Isolate USA-WA1/2020)	BEI Resources	NR-52281
SARS-CoV-2 nucleocapsid antibody	Genetex	GTX135357
Triton-X 100	Fisher Scientific	BP151100
Type IV β- tubulin antibody	Abcam	ab11315
VeroCCL81 cells	ATCC	CCL-81	To titrate MERS-CoV
VeroE6 cells	ATCC	CRL-1586	To titrate SARS-CoV-2