Brain Mapping mit einem Graphen-Elektroden-Array

Zusammenfassung

Wir stellen ein Graphen-Array-basiertes Brain-Mapping-Verfahren vor, um die Invasivität zu reduzieren und die räumlich-zeitliche Auflösung zu verbessern. Graphen-Array-basierte Oberflächenelektroden weisen eine langfristige Biokompatibilität, mechanische Flexibilität und Eignung für die Kartierung des Gehirns in einem gewundenen Gehirn auf. Dieses Protokoll ermöglicht es, mehrere Formen von sensorischen Karten gleichzeitig und sequentiell zu erstellen.

Zusammenfassung

Kortikale Karten stellen die räumliche Organisation ortsabhängiger neuronaler Reaktionen auf sensomotorische Reize in der Großhirnrinde dar und ermöglichen die Vorhersage physiologisch relevanter Verhaltensweisen. Verschiedene Methoden wie Durchdringungselektroden, Elektroenzephalographie, Positronen-Emissions-Tomographie, Magnetoenzephalographie und funktionelle Magnetresonanztomographie wurden verwendet, um kortikale Karten zu erhalten. Diese Methoden sind jedoch durch eine schlechte raumzeitliche Auflösung, ein niedriges Signal-Rausch-Verhältnis (SNR), hohe Kosten und mangelnde Biokompatibilität eingeschränkt oder verursachen physische Schäden am Gehirn. Diese Studie schlägt eine Graphen-Array-basierte somatosensorische Mapping-Methode als Merkmal der Elektrokortikographie vor, die eine überlegene Biokompatibilität, eine hohe räumliche und zeitliche Auflösung, ein wünschenswertes SNR und eine minimierte Gewebeschädigung bietet und die Nachteile früherer Methoden überwindet. Diese Studie demonstrierte die Machbarkeit eines Graphen-Elektrodenarrays für die somatosensorische Kartierung bei Ratten. Das vorgestellte Protokoll kann nicht nur auf den somatosensorischen Kortex, sondern auch auf andere Kortexe wie den auditiven, visuellen und motorischen Kortex angewendet werden und bietet eine fortschrittliche Technologie für die klinische Umsetzung.

Einleitung

Eine kortikale Karte ist eine Reihe von lokalen Flecken, die Reaktionseigenschaften auf sensomotorische Reize in der Großhirnrinde darstellen. Sie sind eine räumliche Formation neuronaler Netze und ermöglichen Vorhersagen für Wahrnehmung und Kognition. Daher sind kortikale Karten nützlich, um neuronale Reaktionen auf externe Reize zu bewerten und sensomotorische Informationen zu verarbeiten 1,2,3,4. Für die kortikale Kartierung stehen invasive und nicht-invasive Methoden zur Verfügung. Eine der häufigsten invasiven Methoden ist die Verwendung von intrakortikalen (oder penetrierenden) Elektroden für die Kartierung 5,6,7,8.

Die Bewertung der hochauflösenden kortikalen On-Demand-Karten mit durchdringenden Elektroden stieß auf mehrere Hindernisse. Die Methode ist zu aufwendig, um eine anständige Karte zu erhalten, und zu invasiv, um sie für den klinischen Einsatz zu implementieren, was eine weitere Entwicklung verbietet. Neuere Technologien wie Elektroenzephalographie (EEG), Positronen-Emissions-Tomographie (PET), Magnetoenzephalographie (MEG) und funktionelle Magnetresonanztomographie (fMRT) haben an Popularität gewonnen, da diese weniger invasiv und reproduzierbar sind. Aufgrund ihrer unerschwinglichen Kosten und ihrer schlechten Auflösung werden sie jedoch in einer begrenzten Anzahl von Fällen verwendet 9,10,11. In jüngster Zeit haben flexible Oberflächenelektroden mit überlegener Signalzuverlässigkeit große Aufmerksamkeit erregt. Oberflächenelektroden auf Graphenbasis zeigen langfristige Biokompatibilität und mechanische Flexibilität und liefern stabile Aufzeichnungen in einem verschlungenen Gehirn 12,13,14,15,16. Unsere Gruppe hat kürzlich ein Graphen-basiertes Mehrkanal-Array für hochauflösende Aufzeichnungen und ortsspezifische Neurostimulation auf der kortikalen Oberfläche entwickelt. Diese Technologie ermöglicht es uns, die kortikalen Repräsentationen sensorischer Informationen über einen längeren Zeitraum zu verfolgen.

In diesem Artikel werden die Schritte beschrieben, die erforderlich sind, um eine Gehirnkarte des somatosensorischen Kortex mit einem 30-Kanal-Graphen-Multielektroden-Array zu erstellen. Um die Gehirnaktivität zu messen, wird ein Graphen-Elektroden-Array auf den subduralen Bereich des Kortex gelegt, während Vorderpfote, Vordergliedmaße, Hinterpfote, Hintergliedmaße, Rumpf und Schnurrhaare mit einem Holzstab stimuliert werden. Die somatosensorisch-evozierten Potentiale (SEPs) werden für somatosensorische Areale erfasst. Dieses Protokoll kann auch auf andere Gehirnbereiche angewendet werden, wie z. B. den auditiven, visuellen und motorischen Kortex.

Protokoll

Alle Verfahren zum Umgang mit Tieren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Incheon National University genehmigt (INU-ANIM-2017-08).

1. Vorbereitung des Tieres auf die Operation

HINWEIS: Verwenden Sie für dieses Experiment Sprague Dawley Rat (8-10 Wochen alt) ohne geschlechtsspezifische Voreingenommenheit.

1. Betäuben Sie die Ratte mit 90 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg Xylazin-Cocktail intraperitoneal. Um die gewünschte Anästhesietiefe während der gesamten Operation aufrechtzuerhalten, verabreichen Sie zusätzlich 45 mg/kg Ketamin und 5 mg/kg Xylazin-Cocktail, wenn die Ratte Anzeichen eines Aufwachens zeigt.
2. Vergewissern Sie sich, dass sich die Ratte unter Tiefennarkose befindet, und überprüfen Sie regelmäßig Körperreflexionen wie das Einklemmen der Zehen, das Einklemmen des Schwanzes und den Hornhautreflex.
3. Rasieren Sie das Fell zwischen den Augen und der Rückseite der Ohren mit einem Trimmer.
4. Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen auf, um sie vor dem Austrocknen zu schützen.

2. Chirurgie bei kortikaler Oberflächenexposition

1. Befestigen Sie den Rattenkopf mit einem stereotaktischen Adapter auf dem stereotaktischen Gerät. Um die Körpertemperatur während der Operation bei 37 °C zu halten, legen Sie die Ratte auf ein temperaturgesteuertes Heizkissen.
2. Sterilisieren Sie den rasierten Bereich dreimal abwechselnd mit Alkohol und Povidon-Jod.
3. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Kopfhaut fest zu greifen, und injizieren Sie 0,1 ml Lidocain (2%) mit einer Spritze direkt in die Kopfhaut, um eine Lokalanästhesie im Operationsbereich einzuleiten.
4. Machen Sie mit einem Skalpell einen 2-3 cm langen Mittellinienschnitt und ziehen Sie die Kopfhaut auseinander, um den Schädel freizulegen.
5. Klemmen Sie die Kopfhaut mit einer Moskitopinzette ein, um den Schädel freizulegen.
6. Kratzen Sie mit einer Pinzette an der Oberfläche des Schädels, um die Knochenhaut zu entfernen.
7. Sezieren Sie stumpf die Muskeln über dem Hinterhauptschädel, um die Cisterna magna über der Achse auf der Oberseite des Rückenmarks freizulegen.
8. Schneiden Sie die Cisterna magna mit der Klinge ein, um die Zerebrospinalflüssigkeit abzuleiten, und legen Sie eine sterile Gaze in den Einschnitt der Cisterna magna, um die Zerebrospinalflüssigkeit ständig zu absorbieren, um Hirnödeme zu verhindern und Entzündungen zu minimieren.
9. Markieren Sie mit einem Bleistift auf dem Schädel ein rechteckiges Fenster, das 3 mm in der anteroposterioren Achse und 6 mm in der rechten lateralen Richtung vom Bregma der rechten Hemisphäre misst.
   HINWEIS: Die Markierung muss einen Abstand von 1 mm von der Mittellinie gewährleisten, um eine Ruptur des Sinus sagittalis zu vermeiden.
10. Bohren Sie den markierten Bereich entsprechend der stereotaktischen Koordinate und entfernen Sie den Schädel mit einem Knochenrongeur.
11. Um die Dura mater zu entfernen, biegen Sie die Spitze der 26-G-Nadel um 90°, machen Sie ein Loch in die Dura mater, heben Sie die Dura mater an, führen Sie eine Pinzette in dieses Loch ein und reißen Sie sie mit einer Pinzette auf.
12. Lege mit Kochsalzlösung benetzte Gaze auf den somatosensorischen Kortex, um zu verhindern, dass er austrocknet.

3. Vorbereitung des an das Aufzeichnungssystem angeschlossenen Graphen-Elektrodenarrays

1. Bereiten Sie ein Graphen-Elektroden-Array mit einem Omnetics-Anschluss vor.
   1. Lösen Sie das Graphen-Multielektroden-Array, ohne es zu beschädigen, indem Sie die Kochsalzlösung auftragen.
   2. Entfernen Sie die äußere Abdeckung der Referenz- und Erdungskabel vom Stecker.
2. Verbinden Sie die Kopfstufe mit dem Graphen-Elektroden-Array mit dem Anschluss.
3. Schließen Sie das Schnittstellenkabel, das mit der Hauptstufe verbunden ist, an das Aufnahmesystem an.
4. Befestigen Sie den Graphen-Elektroden-Array-Komplex im stereotaktischen Arm.
5. Um neuronale Signale von allen Kanälen zu erfassen, positionieren Sie das Array auf dem somatosensorischen Kortex ohne Krümmung und folgen Sie den vorgegebenen stereotaktischen Koordinaten.
6. Platzieren Sie einen Referenzdraht unter dem Gewebe hinter dem Hinterhauptsbein und verbinden Sie das Erdungskabel mit dem geerdeten optischen Tisch.

4. Körperliche Stimulation und Aufzeichnung von SEPs für das Mapping

1. Öffnen Sie die Software zur Aufzeichnung neuronaler Signale.
2. Stellen Sie die Umgebung der Aufnahmesoftware ein: (1) Stellen Sie die Abtastrate für SEPs und den Notch-Filter (60 oder 50 Hz, eine Frequenz der elektrischen Leistung des Haushalts) ein, um das Rauschen aus der Stromleitung zu entfernen.
3. Für das Whisker-Mapping biegen Sie das Whisker mit einem feinen Stäbchen.
4. Stechen Sie ständig die Vorderpfote, die Vordergliedmaße, die Hinterpfote, die Hintergliedmaße und den Rumpf mit einem Holzstab an, um das Bodymapping zu ermöglichen.
5. Zeichnen Sie neuronale Signale im Datenerfassungssystem für die angegebene Zeit auf.

5. Euthanasie von Tieren

1. Nach allen Aufzeichnungsprozeduren werden die Ratten mit einer Anästhesie mit >5% Isofluran geopfert und eine Zervixdissektion durchgeführt.

6. SEP-Messung für kortikales Mapping

1. Öffnen Sie MATLAB mit dem Codenamen read_Intan_RHS2000_file.m für die Signalanalyse.
   HINWEIS: read_Intan_RHS2000_file.m kann von "https://intantech.com/downloads.html?tabSelect=Software" heruntergeladen werden.
2. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen , wählen Sie die Aufnahmedatei mit der Dateinamenerweiterung ".rhs" aus und warten Sie, bis die Datei verarbeitet und gelesen wurde.
3. Geben Sie den Befehl "plot (t, amplifier_data("Kanalnummer",:))" ein, um ein 2D-Liniendiagramm der Aufnahmedaten zu erstellen, die SEPs zu finden und die Amplitude der SEPs in allen Kanälen zu berechnen.
   HINWEIS: Geben Sie die Kanalnummer unter "Kanalnummer" ein. Beispiel: "plot(t, amplifier_data(1,:))" erstellt das 2D-Liniendiagramm von Kanal 1. Wenn der Versuchsleiter die Amplitude der Antwort berechnet, wählen Sie außerdem die Antwort aus, die von jedem Kanal aufgezeichnet wird.
4. Erhalten Sie Daten, indem Sie das Raster entsprechend der Amplitude der SEPs mit einem anderen Farbton einfärben.
   HINWEIS: Der MATLAB-Befehl "imagesc" hilft dabei, eine topografische Karte schneller zu erhalten.

Ergebnisse

Dieses Protokoll beschreibt, wie ein Graphen-Mehrkanal-Array auf der Oberfläche des Gehirns montiert wird. Die somatosensorische Karte wurde erstellt, indem neuronale Reaktionen auf physikalische Reize erfasst und die Amplitude der Reaktion berechnet wurden. Abbildung 1 zeigt das Schema dieses Experiments.

Abbildung 2A zeigt die strukturellen Eigenschaften eines Graphen-Elektrodenarrays. Zwischen den Elektroden befinden sich Durchgan...

Diskussion

Das vorgestellte Protokoll bietet einen detaillierten, schrittweisen Prozess, der erklärt, wie man mit einem Graphen-Elektroden-Array auf die somatosensorischen Reaktionen von Ratten zugreifen und sie abbilden kann. Bei den protokollerfassten Daten handelt es sich um SEPs, die somatosensorische Informationen liefern, die synaptisch mit jedem Körperteil verknüpft sind.

Mehrere Aspekte dieses Protokolls sollten berücksichtigt werden. Bei der Entnahme von Liquor cerebrospinalis zur Vorbeugung...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1mL syringe	KOREAVACCINE CORPORATION		injecting the drug for anesthesia
3mL syringe	KOREAVACCINE CORPORATION		injecting the drug for anesthesia
Bone rongeur	Fine Science Tools	16220-14	remove the skull
connector	Gbrain		Connect graphene electrode to headstage
drill	FALCON tool		grind the skull
drill bits	Osstem implant		grind the skull
Graefe iris forceps slightly curved serrated	vubu	vudu-02-73010	remove the tissue from the skull or hold wiper
graphene multielectrode array	Gbrain		records signals from neuron
isoflurane	Hana Pharm Corporation		sacrifce the subject
ketamine	yuhan corporation		used for anesthesia
lidocaine(2%)	Daihan pharmaceutical		local anesthetic
Matlab R2021b	Mathworks		Data analysis Software
mosquito hemostats	Fine Science Tools	91309-12	fasten the scalp
ointment	Alcon		prevent eye from drying out
povidone	Green Pharmaceutical corporation		disinfect the incision area
RHS 32ch Stim/Record headstage	intan technologies	M4032	connect connector to interface cable and contain intan RHS stim/amplifier chip
RHS 6-ft (1.8m) Stim SPI interface cable	intan technologies	M3206	connect graphene electrode to headstage
RHS Stim/Recording controller software	intan technologies		Data Acquisition Software
RHS stimulation/ Recording controller	intan technologies	M4200
saline	JW Pharmaceutical
scalpel	Hammacher	HSB 805-03
stereotaxic instrument	stoelting		fasten the subject
sterile Hypodermic Needle	KOREAVACCINE CORPORATION		remove the dura mater
Steven Iris Tissue Forceps	KASCO	50-2026	remove the dura mater
surgical blade no.11	FEATHER		inscise the scalp
surgical sicssors	Fine Science Tools	14090-09	inscise the scalp and remove the dura mater
wooden stick			whisker stimulation
xylazine	Bayer Korea		used for anesthesia