Isolierung und Aufreinigung von Pilz-β-Glucan als Immuntherapiestrategie beim Glioblastom

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Reinigungsschritte und anschließenden Studien von vier verschiedenen pilzlichen β-Glucanen als potentielle immunmodulatorische Moleküle, die die antitumoralen Eigenschaften von Mikroglia gegen Glioblastomzellen verbessern.

Zusammenfassung

Eine der größten Herausforderungen bei der Entwicklung wirksamer Therapien gegen das Glioblastom ist die Überwindung der starken Immunsuppression in der Tumormikroumgebung. Die Immuntherapie hat sich als wirksame Strategie herausgestellt, um die Reaktion des Immunsystems gegen Tumorzellen zu richten. Gliom-assoziierte Makrophagen und Mikroglia (GAMs) sind wichtige Treiber solcher entzündungshemmenden Szenarien. Daher könnte die Verstärkung des antikanzerösen Ansprechens bei GAMs eine potenzielle co-adjuvante Therapie zur Behandlung von Glioblastom-Patienten darstellen. In diesem Sinne sind pilzliche β-Glucan-Moleküle seit langem als starke Immunmodulatoren bekannt. Ihre Fähigkeit, die angeborene Immunaktivität zu stimulieren und das Ansprechen auf die Behandlung zu verbessern, wurde beschrieben. Diese modulierenden Eigenschaften werden zum Teil auf ihre Fähigkeit zurückgeführt, an Mustererkennungsrezeptoren zu binden, die interessanterweise in GAMs stark exprimiert werden. Daher konzentriert sich diese Arbeit auf die Isolierung, Reinigung und anschließende Verwendung von pilzlichen β-Glucanen zur Verbesserung der tumoriziden Reaktion von Mikroglia gegen Glioblastomzellen. Die Maus-Zelllinien Glioblastom (GL261) und Mikroglia (BV-2) werden verwendet, um die immunmodulatorischen Eigenschaften von vier verschiedenen pilzlichen β-Glucanen zu testen, die aus Pilzen extrahiert werden, die in der aktuellen biopharmazeutischen Industrie stark verwendet werden: Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus und Ganoderma lucidum. Um diese Verbindungen zu testen, wurden Co-Stimulations-Assays durchgeführt, um die Wirkung eines voraktivierten Mikroglia-konditionierten Mediums auf die Proliferation und Apoptose-Aktivierung in Glioblastomzellen zu messen.

Einleitung

Trotz neuer Errungenschaften auf dem Gebiet der Neuroonkologie ist die Lebenserwartung von Glioblastom-Patienten nach wie vor gering. Goldstandard-Therapien gegen Hirntumore basieren auf der Verschmelzung von Operation, Strahlentherapie und Chemotherapie. In den letzten zehn Jahren hat sich die Immuntherapie jedoch zu einer wirksamen Strategie zur Behandlung verschiedener Krebsarten entwickelt¹. So ist die Möglichkeit, die körpereigene Immunantwort gegen Tumorzellen nutzbar zu machen, in jüngster Zeit zur vierten Säule der Onkologie geworden.

Es ist seit langem bekannt, dass eine der größten Herausforderungen auf diesem Gebiet darin besteht, die starke Immunsuppression in der Tumormikroumgebung zu überwinden². Insbesondere im Fall des Glioblastoms, einer der häufigsten und aggressivsten Formen von Hirntumoren, könnte die Entschlüsselung wichtiger Signalwege, die solche pro-tumoralen Szenarien orchestrieren, und die Suche nach neuen Verbindungen, die der depressiven Reaktion des Immunsystems entgegenwirken könnten, den Weg für zukünftige Therapien gegen diese unheilbare Krankheit ebnen.

Das Gehirn besitzt eigene Zellen des Immunsystems, und der relevanteste Zelltyp sind Mikroglia. Es wurde nachgewiesen, dass diese Zellen ein ziemlich komplexes Verhalten bei verschiedenen zentralen Krankheiten aufweisen³. Bei primären Hirntumoren (z.B. Glioblastom) werden diese Zellen in Richtung eines antiinflammatorischen Phänotyps verschoben, der Tumorzellen bei der Besiedlung des Hirnparenchyms unterstützt³. Zahlreiche Veröffentlichungen belegen die wichtige Rolle dieser Zellen bei der Tumorprogression. Einer der Hauptgründe dafür ist, dass Gliom-assoziierte Mikroglia und infiltrierte Makrophagen (GAMs) ein Drittel der gesamten Tumormasse ausmachen, was auf den eindeutigen Einfluss ihrer Aktivierungszustände während der Progression von Hirntumoren hindeutet ^4,5.

In diesem Sinne wurden pilzliche β-Glucane als starke Moleküle beschrieben, die wirksame Immunreaktionen auslösen, einschließlich Phagozytose und Produktion entzündungsfördernder Faktoren, was zur Eliminierung schädlicher Stoffe führt 6,7,8,9,10. Pilze β-Glucane wurden im Allgemeinen mit Extrakten aus verschiedenen Pilzteilen untersucht. Die Zuordnung spezifischer Wirkungen erfordert jedoch eine Reinigung, um Mehrdeutigkeiten zu vermeiden und den Wirkmechanismus solcher Moleküle als immunmodulatorische Wirkstoffe verstehen zu können⁸.

In dieser Arbeit werden lösliche β-Glucane aus dem Fruchtkörper von vier verschiedenen Pilzen gereinigt, die regelmäßig als essbare (Pleurotus ostreatus und Pleurotus djamor) und als Heilpilze (Ganoderma lucidum und Hericium erinaceus) verwendet werden. Insbesondere in der Lebensmittel- und Pharmaindustrie finden diese vier Pilze große Verwendung und wurden im Rahmen einer umweltfreundlichen Kreislaufwirtschaft in einem Gewerbebetrieb hergestellt (siehe Materialtabelle).

Um den Grundstein für den zukünftigen Einsatz von Pilz-β-Glucanen in der Therapie von Hirntumoren zu legen, sind klar definierte Aufreinigungsstrategien und präklinische Studien, die sich mit ihrer mutmaßlichen Interaktion mit Zellen des Immunsystems befassen, unerlässlich, um ihre potenzielle Rolle als Anti-Tumor-Mediatoren zu bewerten. Diese Arbeit beschreibt die zahlreichen Schritte der Isolierung und Reinigung, die erforderlich sind, um die löslichen β-Glucane zu gewinnen, die in den Fruchtkörpern des ausgewählten Pilzes enthalten sind. Nach erfolgreicher Reinigung werden die Mikrogliazellen aktiviert, um ihren entzündlichen Phänotyp zu verstärken. Maus-Glioblastomzellen (GL261) werden mit einem anderen Mikroglia-konditionierten Medium beschichtet, das zuvor mit diesen Extrakten behandelt wurde, und dann wird seine Wirkung auf das Verhalten der Tumorzellen untersucht. Interessanterweise haben Pilotstudien aus unserem Labor (Daten nicht gezeigt) aufgedeckt, wie entzündungsfördernde Mikroglia die Migration von Tumorzellen und die Invasionseigenschaften nicht nur in Glioblastomzellen, sondern auch in anderen Krebszelllinien verlangsamen können. Diese multidisziplinäre Arbeit könnte ein nützliches Werkzeug für Onkologieforscher sein, um vielversprechende Wirkstoffe zu testen, die in der Lage sind, die Immunantwort bei vielen verschiedenen Tumorarten zu verstärken.

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Protokoll

Die vier verschiedenen Pilzvarianten, die in diesem Protokoll beschrieben werden, wurden aus einer kommerziellen Quelle gewonnen (siehe Materialtabelle).

1. Isolierung von pilzlichen β-Glucanen

1. Extraktion und Isolierung von löslichen Pilzpolysacchariden
   HINWEIS: Lösliche Pilzpolysaccharide (SMPs) wurden gemäß dem in Abbildung 1 schematisch dargestellten Verfahren erhalten.
   1. Spülen Sie frische Fruchtkörper von P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus und G. lucidum (ca. 2.000 g/Pilz) fünfmal vorsichtig in destilliertem Wasser ab.
   2. Trocknen Sie die Fruchtkörper bei 50 ± 2 °C in einem konventionellen Lufttrockner, bis ein konstantes Gewicht erreicht ist (~24 h).
   3. Mahlen Sie die getrockneten Pilze in einer Messermühle und erhalten Sie von jedem Pilz etwa 200 g Pulver.
   4. 100 g Pilzpulver (MP) (P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus und G. lucidum) in 1.000 ml_H2Od suspendieren. Dann 15 Minuten bei 121 °C autoklavieren und schließlich 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen.
   5. Die resultierende Suspension wird bei 6.000 x g 10 min bei 4 °C zentrifugiert.
   6. Trocknen Sie den Niederschlag mit unlöslichen Pilzpolysacchariden (IMPs) bei 50 ± 2 °C in einem Lufttrocknungsofen für 24 h.
   7. Entsorgen Sie den Niederschlag und bewahren Sie den Überstand auf. Konzentrieren Sie den Überstand 10 Mal in einem Rotationsverdampfer.
   8. Das SMP-haltige Konzentrat mit Ethanol (80 % Endkonzentration) wird über Nacht bei 4 °C ausgefällt.
   9. Zentrifugieren Sie die Ethanolsuspension bei 6.000 x g für 15 min bei 4 °C, halten Sie das Pellet zurück (Niederschlag) und entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette.
   10. Waschen Sie den Niederschlag dreimal mit 80 % Ethanol, bevor Sie ihn in H₂O_d (10 % w/v) auflösen. Stellen Sie den pH-Wert auf 6,5/7 und die Temperatur auf 37 °C ein und behandeln Sie mit 2 U bzw. 4 U α-Amylase und Glucoamylase, um α-Glucane gemäß den Anweisungen des Herstellers zu lösen (siehe Materialtabelle).
   11. Nach der Behandlung mit α-Amylase/Glucoamylase den pH-Wert und die Temperatur auf 8,0 bzw. 50 °C einstellen und mit Alcalase (2,5 E/g Protein) behandeln (siehe Materialtabelle), um die Proteine zu lösen.
       HINWEIS: Bei dieser sequenziellen enzymatischen Behandlung werden die meisten α-Glucane und Proteine entfernt, die zusammen mit β-Glucanen in der Ethanolfällung ausfallen.
   12. Nach der Hydrolyse wird das Hydrolysat bei 6.000 x g für 15 min bei 4 °C zentrifugiert und der saubere Überstand fünfmal in einem Rotationsverdampfer konzentriert. Erneut mit 80%igem Ethanol ausfällen.
   13. Den resultierenden Niederschlag in H2O_d auflösen und 24 h lang in destilliertem Wasser dialysieren, wobei Zelluloseschlauchmembranen (_12.000Da Cut-off-Membranen; siehe Materialtabelle) verwendet werden, um niedermolekulare Moleküle zu entfernen. Gewinnen Sie den wasserlöslichen Teil zurück und trocknen Sie ihn gefrier, um lösliche β-Glucane (SβGs) herzustellen.
2. Zucker- und Proteinmessung
   1. Messen Sie den Gesamtzuckergehalt jeder Fraktion mit der Phenol-Schwefelsäure-Methode, wobei Glukose als Standard verwendet^{wird 8}.
      ANMERKUNG: Die Quantifizierung des β-Glucan-Gehalts kann auch mit dem β-Glucan-Assay-Kit (Pilz und Hefe; siehe Materialtabelle) erfolgen, das auf enzymatischer Hydrolyse und der Aktivität von Oxidoreduktasen basiert: nämlich exo-1,3-β-Glucanase, Glucoseoxidase, β-Glucosidase und Peroxidase, mit anschließender Bildung des Chinonimins. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers mit geringfügigen Änderungen.
   2. Verwenden Sie 18 MH 2SO 4 anstelle von 12 MH₂SO₄.
   3. Bewerten Sie den Gehalt der Gesamtglucane und der α-Glucane separat.
   4. Messen Sie die resultierenden β-Glucan-Werte als Differenz zwischen den Gesamt-Glucan- und α-Glucan-Werten (dreifach) nach dem Kjeldahl-Protokoll. In bestimmten Fällen kann der Proteingehalt mit der Lowry-Methode bestimmt werden, wobei Albumin verwendet wird, um die Kalibrierungskurve^11,12 aufzuzeichnen.
3. Analyse der Ultraviolett-Absorptionsspektroskopie
   1. Erhalten Sie die ultravioletten (UV) SβG-Spektren mit einem UV-sichtbaren Spektralphotometer (siehe Materialtabelle), indem Sie die Proben im Bereich von 200-400 nm scannen (Abbildung 2).
   2. Bereiten Sie 1,0 mg/ml jedes SβG in_H2Od vor, übertragen Sie die Lösung in eine Quarzküvette und scannen Sie sie bei Raumtemperatur.
4. Analyse der Molekulargewichtsverteilung
   1. Abschätzung der Homöogenität von SβGs und des Molekulargewichts von Polymeren mittels Größenausschlusschromatographie (SEC) unter Verwendung eines Hochleistungsflüssigkeitschromatographiesystems (HPLC) (siehe Materialtabelle), das mit einem Brechungsindexdetektor und einer linearen Ultra-Hydrogel-Gelfiltrationssäule (300 mm x 7,8 mm; Abbildung 3).
   2. Führen Sie den Test bei 40 °C mit deionisiertem Wasser als Laufmittel mit einer Durchflussrate von 0,5 ml/^min-1 und Dextran (110, 80 und 50 kDa) als Standard durch (siehe Materialtabelle). Sammeln Sie eine 5-ml-Fraktion.
5. Fourier-Transformations-Infrarot (FTIR)-Analyse
   1. Nehmen Sie die Infrarotspektren (Abbildung 4) mit einem FTIR-Spektrometer im Bereich von 4000-500 ^cm-1 auf. Die Proben sollten zuvor mit KBr gemischt werden, um Filme zu bilden (Standard-FTIR-Verfahren; siehe Herstelleranweisung und Materialtabelle).
6. Analyse der molekularen Zusammensetzung
   1. Schätzung der molekularen Zusammensetzung von SβGs mittels Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie (HPTLC) sowie Gaschromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie (GC-MS) nach Standardverfahren¹².

2. In-vitro-Studie zur β-Glucan-induzierten Mikroglia-Stimulation

1. Zellkultur von Maus-Glioblastom- und Mikrogliazellen in 8-Well-Kammerobjektträgern
   HINWEIS: Dieses Protokoll ist spezifisch für GL261 (Glioblastom) und BV2 (Mikroglia) Zelllinien. Mit leichten Modifikationen könnten diese Schritte jedoch möglicherweise zur Untersuchung anderer Krebs- und Immunzelllinien verwendet werden.
   1. Bereiten Sie das modifizierte Eagle's Medium (DMEM) von Dulbecco zu, das mit L-Glutamin, 4,5 g/L D-Glukose und ohne Pyruvat modifiziert ist. Fügen Sie 10 % fötales Kälberserum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin hinzu (siehe Materialtabelle). Das Material im Wasserbad bei 37 °C für 15 min vorwärmen.
   2. Tauen Sie gefrorene BV2- und GL261-Aliquots 2 Minuten lang in einem Wasserbad (37 °C) auf und tragen Sie sie kurz vor dem vollständigen Auftauen in eine Laminar-Flow-Haube und plattieren Sie die Zellen in zwei verschiedene sterile T25-Kolben (einen für jede Zelllinie).
   3. Inkubieren Sie die T25-Kolben bei 37 °C, 5 % CO₂ , bis die Kultur konfluent ist.
      HINWEIS: Abhängig von den Gefrierbedingungen und der Zeit der Kryokonservierung kann die Zeit bis zum Zusammenfluss variieren. Diese Zelllinien benötigen in der Regel zwischen 3 und 5 Tagen, um die Konfluenz in einem T75-Kolben zu erreichen.
   4. Nachdem die BV2-Zellkultur konfluiert ist, wird sie in Objektträger mit 8 Wells und 0,6 x 10⁶ Zellen/Well überführt. Bewahren Sie die Objektträger mit 8 Wells 24 Stunden im Inkubator auf.
   5. Sobald die Mikrogliazellen in die 8-Well-Kammer-Objektträger eingebracht sind, wiederholen Sie das gleiche Protokoll mit den GL261-Zellen.
2. Aktivierung von Mikroglia mit β-Glucanen
   1. Beschichten Sie die BV2-Zellen 72 h lang mit vier verschiedenen β-Glucanen (P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum und H. erinaceus) in einer Konzentration von 0,2 mg/ml. Eine Versuchsbedingung muss unbehandelt bleiben (normales Medium) und als Kontrollgruppe fungieren.
   2. Den Überstand nach 72 h mit einer Pipette auffangen und das restliche Volumen durch einen 0,20 μm Spritzenvorsatzfilter leiten. Anschließend wird der Überstand bei -80 °C für mindestens 24 h eingefroren.
3. Behandlung von GL261 mit voraktiviertem Mikroglia-konditioniertem Medium
   1. Sobald der GL261 zu 80 % in den Objektträgern mit 8 Wells zusammenfließt, wird β-Glucan-behandeltes Mikrogliamedium (Schritt 2.2.2) mit einer Endvolumenkonzentration von 25 % für 72 h (Gesamtvolumen: 250 μl/Well) zugegeben.
   2. Entfernen Sie das Medium nach 72 h Inkubation und entsorgen Sie es.
   3. Waschen Sie die Zellen dreimal 5 Minuten lang mit Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS; pH 7,4, 0,1 M).
   4. Fixieren Sie die Zellen durch Zugabe von 200 μl 4%igem Paraformaldehyd (PFA) bei 4 °C für 15 min.
      HINWEIS: Abhängig von den verschiedenen Antikörpern, die für die Immunfluoreszenz verwendet werden können, können die Fixierungsmethoden von der typischen 4%igen PFA abweichen. Fixiermittel auf Alkoholbasis können bei der Erhaltung bestimmter Epitope effizienter sein.
4. Immunfluoreszenz-Studie
   1. Waschen Sie die Proben dreimal mit PBS mit Triton X (PBST; 0,01 %) für 10 Minuten.
   2. Entfernen Sie das PBST und fügen Sie Rinderserumalbumin (BSA) Blockierungspuffer 10 % in PBST (Tabelle 1) für 30 min bei Raumtemperatur hinzu.
   3. Entfernen Sie den Blockierungspuffer und fügen Sie 200 μl PBS pro Vertiefung hinzu, die die primäre Antikörpermischung enthält (1:500 monoklonaler Ki-67-Antikörper der Ratte und 1:500 gespaltener Caspase-3-Antikörper des Kaninchens; siehe Materialtabelle). Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
   4. Nach 24 h Inkubation bei 4 °C lassen Sie die Proben 30 min bei Raumtemperatur.
   5. Waschen Sie die Vertiefungen dreimal für 10 Minuten mit PBS auf einem Shaker (niedrige Geschwindigkeit).
   6. Entfernen Sie das PBS und ersetzen Sie es durch 200 μl PBS pro Vertiefung, das die Mischung aus Sekundärantikörpern (1:200 Esel-Anti-Ratten-IgG (H + L) stark kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488 und 1:200 Esel-Anti-Kaninchen-IgG (H + L) hoch-kreuzadsorbiertem Sekundärantikörper, Alexa Fluor 647; siehe Materialtabelle) für 45 min bei Raumtemperatur im Dunkeln enthält.
   7. Waschen Sie die Proben 10 Minuten lang mit PBS auf einem Mehrzweckschüttler.
   8. Entfernen Sie das PBS und fügen Sie 200 μl pro Vertiefung von 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI), verdünnt in PBS (1:5,000), für 1 Minute hinzu.
   9. Entfernen Sie DAPI (siehe Materialtabelle) und waschen Sie die Zellen 5 Minuten lang in PBS.
   10. Entfernen Sie den Well-Rahmen und geben Sie 50 μl PBS:Glycerin (1:1) auf jede Vertiefung und decken Sie sie mit einem Deckglas ab.
   11. Versiegeln Sie die Objektträger mit Nagellack.
   12. Erfassen Sie Bilder mit 20-facher Vergrößerung mit einem konfokalen Mikroskopsystem (siehe Materialtabelle).

3. Quantifizierung und Analyse der Tumorzellproliferation und Apoptose

HINWEIS: Um die potenzielle Wirkung der verschiedenen β-Glucane auf die Proliferation und Apoptose von Tumorzellen zu messen, wurde ein internes Skript in der ImageJ-Software verwendet, um die Anzahl der positiven Pixel von Ki67 (Proliferation) und cCasp3 (Apoptose)¹³ zu quantifizieren.

1. Öffnen Sie ImageJ. Klicken Sie auf die Schaltfläche Plugins . Klicken Sie auf Coloc2, ein Plugin, das zuvor im Plugin-Ordner installiert wurde, und wählen Sie schließlich das zu analysierende Bild^{aus 11}.
   HINWEIS: Dieses Plugin war nach einem vorherigen Kontakt mit Dr. Vasiliki Economopoulos (veconom@uwo.ca) verfügbar. Anstelle des Skripts verfügen sowohl ImageJ als auch Fiji Software über unterschiedliche Werkzeuge für die Kolokalisierungsanalyse (siehe Materialtabelle) mit ähnlichen Eigenschaften.
2. Legen Sie die Schwellenwerte entsprechend den Kontrollbedingungen (unbehandelt, nur DMEM) fest. Klicken Sie auf die Schaltfläche OK .
   HINWEIS: Um Hintergrund- und Intensitätsdiskrepanzen zu vermeiden, müssen alle Bilder unter den gleichen Bedingungen aufgenommen werden. Vorzugsweise sollten Bildgebungssitzungen am selben Tag durchgeführt werden, und die Mikroskopparameter sollten über die Bilder hinweg unverändert bleiben.
3. Stellen Sie sicher, dass die resultierenden Bilder der kolokalisierten Pixel und ein Zusammenfassungsfenster mit dem Prozentsatz oder der Rohanzahl der Pixel über dem Schwellenwert angezeigt werden. Normalisieren Sie die Ergebnisse in Bezug auf die Kontrollbedingungen (unbehandelt).
   HINWEIS: Alle Daten sind als Mittelwert ± REM angegeben. Die statistische Analyse wurde mit Hilfe von Grafik- und Analysesoftware durchgeführt (siehe Materialtabelle). Es wurde eine einfaktorielle ANOVA mit dem Mehrfachvergleichstest von Tukey verwendet. Fehler werden als Standardfehler des Mittelwerts (s.e.m.) dargestellt (*p < 0,05, **p < 0,01).

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Ergebnisse

Erfolgreiche Aufreinigung von β-Glucanen
Die Masse an MP, SMPs und SβGs, die aus den Fruchtkörpern von P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum und H. erinaceus nach dem Extraktions- und Reinigungsprozess gewonnen werden, ist in Tabelle 1 zusammengefasst. Die grundlegende Zusammensetzung (Gesamtkohlenhydrate, β-Glucane und Protein) von MP, SMPs und SβGs, die aus den Pilzen gewonnen werden, ist in Tabelle 2 dargestellt. Diese Ergebni...

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Diskussion

Diese Arbeit beschreibt die Verwendung etablierter Techniken zur erfolgreichen Isolierung, Reinigung und Charakterisierung des Gehalts an SβGs aus vier verschiedenen Pilzen. Die Ergebnisse zeigten, wie nach der Heißwasserextraktion von SMPs, die aus P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum und H. erinaceus gewonnen wurden, gefolgt von einer hydrolytischen Behandlung mit α-Amylase, Glucosidase und Protease, der Gehalt an α-Glucan und Protein reduziert wurde, wodurch die Menge an reinen S...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-well chamber slides	Thermo Fisher, USA	171080
Air-drying oven	J.P. Selecta S.A., Spain	2000210
Albumin	Sigma-Aldrich, St. Louis	A7030
Alcalase	Novozymes, Denmark	protease
Alexa Fluor 488	Thermofisher, USA	A32731
Alexa Fluor 647	Thermofisher, USA	A32728
Blade mill	Retsch, Germany	SM100
Bovine Serum Albumin	MERK, Germany	A9418
Cellulose tubing membrane	Sigma-Aldrich, St. Louis	D9402
Centrifuge	MERK, Germany	Eppendorf, 5810R
Colocalisation pluggins	ImageJ		(https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis )
DAPI	MERK, Germany	28718-90-3
Dextrans	Pharmacosmos, Holbalk, Denmark	Dextran 410, 80, 50
Dulbecco´s modified Eagle´s medium, Gluta MAXTM	Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA	10564011
Extenda (α- Amylase/Glucoamylase)	Novozymes, Denmark
Fetal bovine serum	Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA	A4736301
FT-IR spectromete	Bruker-Vertex, Switzerland	VERTEX 70v
Graphing and analysis software	GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.)
H2SO4
HPLC system	Waters Corp, Milford, MA, USA	Waters 2695 HPLC
Incubator	Eppedorf	Galaxy 170S
Mass Spectometer	Q Exactive GC, Thermo Scientific	725500
Paraformaldehyde	MERK, Germany	P6148
Penicillin/streptomycin	Sigma-Aldrich, St. Louis	P4458
pH meter	Crison, Barcelona, Spain	Basic 20
Phosphate-buffered saline	Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA	1010-015
Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody	Abcam, UK	ab243998
Rat Ki-67 Monoclonal	Thermofisher, USA	MA5-14520
Rotary evaporator	Büchi Ibérica S.L.U., Spain	El Rotavapor R-100
Ultra-hydrogel linear gel-filtration column (300 mm x 7.8 mm)	Waters Corp, Milford, MA, USA	WAT011545
UV-Visible spectrophotometer	Amersham Bioscience, UK	Ultrospec 2100 pro
VectaMount	Vector Laboratories, C.A, USA	H-5000-60
Water bath	J.P. Selecta S.A., Spain
Zeiss LSM 7 DUO Confocal Microscope System.	Zeiss, Germany
β-glucan Assay Kit	Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland	K-BGLU
β-glucans	Setas y Hongos del Sur, S.L.		Supplied the four variants of mushrooms