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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Die aktuellen Methoden beschreiben einen nicht-ratiometrischen Ansatz für die hochauflösende, subkompartimentelle Kalziumbildgebung in vivo in Caenorhabditis elegans unter Verwendung leicht verfügbarer genetisch kodierter Kalziumindikatoren.

Zusammenfassung

Die Bildgebung von Kalzium (Ca 2+) wurde bisher weitgehend zur Untersuchung der neuronalen Aktivität eingesetzt, aber es wird immer deutlicher, dass die subzelluläre Ca2+-Handhabung eine entscheidende Komponente der intrazellulären Signalübertragung ist. Die Visualisierung der subzellulären Ca2+-Dynamik in vivo, bei der Neuronen in ihren nativen, intakten Schaltkreisen untersucht werden können, hat sich in komplexen Nervensystemen als technisch anspruchsvoll erwiesen. Die Transparenz und das relativ einfache Nervensystem des Fadenwurms Caenorhabditis elegans ermöglichen die zellspezifische Expression und in vivo Visualisierung von fluoreszierenden Tags und Indikatoren. Darunter befinden sich Fluoreszenzindikatoren, die für den Einsatz im Zytoplasma modifiziert wurden, sowie verschiedene subzelluläre Kompartimente, wie z.B. die Mitochondrien. Dieses Protokoll ermöglicht eine nicht-ratiometrische Ca 2+ Bildgebung in vivo mit einer subzellulären Auflösung, die die Analyse der Ca2+ Dynamik bis auf die Ebene einzelner dendritischer Dornen und Mitochondrien ermöglicht. In dieser Arbeit werden zwei genetisch kodierte Indikatoren mit unterschiedlichen Ca 2+-Affinitäten verwendet, um die Verwendung dieses Protokolls zur Messung relativer Ca2+-Spiegel innerhalb des Zytoplasmas oder der mitochondrialen Matrix in einem einzigen Paar exzitatorischer Interneuronen (AVA) zu demonstrieren. Zusammen mit den genetischen Manipulationen und Längsschnittbeobachtungen, die in C. elegans möglich sind, könnte dieses Bildgebungsprotokoll nützlich sein, um Fragen zu beantworten, wie der Umgang mit Ca2+ die neuronale Funktion und Plastizität reguliert.

Einleitung

Calcium-Ionen (Ca2+) sind in vielen Zelltypen sehr vielseitige Informationsträger. In Neuronen ist Ca2+ für die aktivitätsabhängige Freisetzung von Neurotransmittern, die Regulierung der Zytoskelettmotilität, die Feinabstimmung von Stoffwechselprozessen sowie viele andere Mechanismen verantwortlich, die für eine ordnungsgemäße Aufrechterhaltung und Funktion der Nervenzellen erforderlich sind 1,2. Um eine effektive intrazelluläre Signalübertragung zu gewährleisten, müssen Neuronen einen niedrigen basalen Ca2+-Spiegel in ihrem Zytoplasmaaufrechterhalten 3. Dies wird durch kooperative Ca 2+-Handhabungsmechanismen erreicht, einschließlich der Aufnahme von Ca2+ in Organellen wie das Endoplasmatische Retikulum (ER) und Mitochondrien. Diese Prozesse, zusätzlich zur Anordnung von Ca 2+-permeablen Ionenkanälen in der Plasmamembran, führen zu heterogenen Konzentrationen von zytoplasmatischem Ca2+ im gesamten Neuron.

Die Ca 2+-Heterogenität während der Ruhephase und der neuronalen Aktivierung ermöglicht die vielfältige, ortsspezifische Regulation von Ca2+-abhängigen Mechanismen1. Ein Beispiel für die konzentrationsspezifischen Effekte von Ca 2+ ist die Freisetzung von Ca2+ aus dem ER durch Inositol-1,4,5-trisphosphat (InsP3)-Rezeptoren. NiedrigeCa2+-Spiegel in Kombination mit InsP3 sind für die Öffnung der kalziumdurchlässigen Pore des Rezeptors erforderlich. Alternativ hemmen hoheCa2+-Spiegel sowohl direkt als auch indirekt den Rezeptor4. Die Bedeutung der Ca 2+-Homöostase für die ordnungsgemäße neuronale Funktion wird durch Hinweise gestützt, die darauf hindeuten, dass eine gestörte intrazelluläre Ca2+-Handhabung und -Signalübertragung ein früher Schritt in der Pathogenese neurodegenerativer Erkrankungen und des natürlichen Alterns ist 5,6. Insbesondere die abnorme Aufnahme und Freisetzung von Ca2+ durch das ER und die Mitochondrien wird mit dem Auftreten neuronaler Dysfunktion bei der Alzheimer-Krankheit, der Parkinson-Krankheit und der Huntington-Krankheit in Verbindung gebracht 6,7.

Die Untersuchung der Ca 2+ Dyshomöostase während des natürlichen Alterns oder der Neurodegeneration erfordert die longitudinale Beobachtung der Ca2+ Spiegel mit subzellulärer Auflösung in einem lebenden, intakten Organismus, in dem die native zelluläre Architektur (d.h. die Anordnung der Synapsen und die Verteilung der Ionenkanäle) erhalten bleibt. Zu diesem Zweck bietet dieses Protokoll eine Anleitung für den Einsatz von zwei leicht verfügbaren, genetisch kodierten Ca 2+ Sensoren zur Erfassung der Ca2+ Dynamik in vivo mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung. Die repräsentativen Ergebnisse, die mit der beschriebenen Methode in C. elegans gewonnen wurden, zeigen, wie die Expression von Ca 2+-Indikatoren im Zytoplasma oder in der mitochondrialen Matrix einzelner Neuronen die schnelle Aufnahme von Fluoreszenzbildern (bis zu 50 Hz) ermöglichen kann, die die Ca 2+-Dynamik veranschaulichen, mit der zusätzlichen Fähigkeit, die Ca 2+-Spiegel innerhalb einzelner stachelähnlicher Strukturen und einzelner Mitochondrien zu erkennen.

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Protokoll

1. Erzeugung transgener Stämme

  1. Klonieren Sie Expressionsvektoren unter Verwendung einer Klonierungsmethode Ihrer Wahl8,9 so, dass sie den Pflp-18- oder Prig-3-Promotor (für AVA-spezifisches Signal im ventralen Nervenstrang) enthalten, gefolgt vom Ca2+-Indikator der Wahl und dann einer 3'-UTR (siehe Diskussion für weitere Informationen)10. Eine Liste der Plasmide und ihrer Quellen finden Sie in der ergänzenden Tabelle 1.
  2. Befolgen Sie das etablierte Protokoll für die Erzeugung transgener Stämme durch Mikroinjektion einer DNA-Mischung (<100 ng/μl; siehe ergänzende Tabelle 1 für die Konzentrationen der einzelnen Plasmide), die das Ca2+-Indikatortransgen (~20 ng/μl) und die Rettungs-DNA lin-15+ (Selektionsmarker) enthält, in die Keimdrüse eines 1 Tag alten erwachsenen C. elegans10 (Genotyp: LIN-15(N765TS); Phänotyp: Multi-Vulva)10,11.
    ANMERKUNG. Die lin-15(n765ts)- Eltern sollten bei 15 °C gehalten werden, um die temperaturempfindliche Mutation zu unterdrücken.
  3. Halten Sie die injizierten Eltern bei 20 °C, bis die F1-Nachkommen das Erwachsenenalter erreichen, um eine transgene Selektion unter Ausnutzung des Fehlens des Multivulva-Phänotyps zu ermöglichen.
  4. Klonale Passage13 adulter F1-Nachkommen, die nicht den Multivulva-Phänotyp aufweisen, da dies auf die Expression des extrachromosomalen Arrays hinweist, das den Ca2+ -Indikator11 enthält.
  5. Beurteilen Sie die Expression des Ca2+ -Indikators bei den F2- oder F3-Nachkommen, die nicht den Multivulva-Phänotyp aufweisen, indem Sie 1 Tag alte erwachsene Tiere wie weiter unten in Abschnitt 3 beschrieben montieren und bildgeben.
    ANMERKUNG. Eine relativ hohe Ausprägung des Indikators ist für die schnelle Aufnahme von Bildern erforderlich, wie hier beschrieben (siehe die Diskussion für weitere Details).
  6. Durchführung von Experimenten an nachfolgenden Generationen der transgenen Stämme mit einer optimalen Expression des Ca 2+-Indikators (siehe Diskussion für weitere Details) und Beibehaltung der Stämme unter Standardbedingungen (20 °C auf NGM-Platten)12.

2. Optischer Aufbau

  1. Verwenden Sie ein Mikroskop, das Langzeitaufnahmen im Zeitraffer ermöglicht.
    ANMERKUNG. Die repräsentativen Daten wurden mit einem konfokalen inversen Spinning-Disk-Mikroskop aufgenommen, das mit 488 nm und 561 nm Anregungslasern ausgestattet ist.
  2. Verwenden Sie ein Objektiv mit geringer Vergrößerung (z. B. 10x/0,40) für die grobe Lokalisierung des Wurms.
  3. Um eine subzelluläre Auflösung zu erreichen, schalten Sie auf die Neuronen um und lokalisieren Sie sie mit einem Objektiv mit hoher Vergrößerung.
    ANMERKUNG. Ein 100x/1,40 NA Ölobjektiv wurde verwendet, um die repräsentativen Daten in dieser Studie zu erfassen.
  4. Nehmen Sie die Bilder mit einer hochempfindlichen Kamera auf, die eine schnelle Bildaufnahme (>50 fps) ermöglicht.
  5. Verwenden Sie einen Standard-Emissionsfilter für den Ca2+ -Indikator Ihrer Wahl (d. h. einen 525-nm- ± 50-nm-Emissionsfilter für GCaMP6f und mitoGCaMP).
  6. Fügen Sie einen Z-Drift-Korrektor (ZDC) für die Aufnahme von Bildströmen hinzu, die länger als 10 s sind, da die Austrocknung des Agar-Pads während der Bildgebungssitzung dazu führt, dass der Neurit innerhalb weniger Sekunden unscharf driftet.
    ANMERKUNG. Wenn ein Mikroskopie-Setup keine ZDC zulässt oder wenn lange Bildgebungszeiten (>20 Minuten) gewünscht werden, tragen Sie einen Rand aus Silikonfett oder geschmolzener Vaseline um das Agar-Pad auf, um die Austrocknung zu verlangsamen.

3. Vorbereitung der Würmer für die Bildgebung

  1. Vorbereiten der Agar-Pads
    1. Stellen Sie 3 ml 10%iges Agar her, indem Sie molekularen Agar in M912 in einem 13 mm x 100 mm großen Glaskulturröhrchen auflösen und einige Sekunden lang in der Mikrowelle erhitzen (siehe Materialtabelle).
      ANMERKUNG. Geschmolzener Agar kann bis zu 1 Stunde auf einem Heizblock aufbewahrt oder jedes Mal frisch zubereitet werden, wenn Agarpads benötigt werden.
    2. Legen Sie einen Objektträger zwischen zwei zusätzliche Objektträger, die jeweils zwei Lagen Laborklebeband aufweisen (siehe Abbildung 1A-i).
    3. Schneiden Sie die Spitze einer 1.000-μl-Pipettenspitze (ohne Filter) ab und pipettieren Sie damit einen kleinen Tropfen Agar auf das mittlere Deckglas (Abbildung 1A-i).
    4. Glätten Sie den Agar, indem Sie einen weiteren Schieber auf den Agar drücken (Abbildung 1A-ii).
    5. Schneiden Sie den Agar nach dem Abkühlen mit der Öffnung eines 13 mm x 100 mm großen Glaskulturröhrchens in eine kleine Scheibe (Abbildung 1A-iii) und entfernen Sie dann den umgebenden Agar.
  2. Aufbereitung der Schneckenwalzlösung
    1. Lösen Sie Muscimol-Pulver in M9 auf, um eine 30-mM-Brühe zu erhalten. In 50-μl-Aliquots trennen und bei 4 °C lagern.
    2. Alle 3-5 Tage ein neues Aliquot von 30 mM Muscimol auftauen (und während der Anwendung bei 20 °C lagern).
    3. Verdünnen Sie eine 30 mM Muscimol-Brühe im Verhältnis 1:1 mit Styroporperlen, um die Walzlösung herzustellen.
  3. Positionieren eines Wurms für die Bildgebung
    1. Geben Sie 1,6 μl der Rollenlösung auf die Mitte des Agarpads.
      Anmerkungen: Die Flüssigkeitsmenge sollte für die Aufnahme jüngerer (weniger) oder älterer Tiere (mehr) angepasst werden.
    2. Übertragen Sie mit dem bevorzugten Wurmstich (d. h. einem Glas- oder Platindrahtpickel)13 einen Wurm des gewünschten Alters ohne den Multivulva-Phänotyp11 in die rollende Lösung auf dem Agarkissen (Abbildung 1A-iv).
      ANMERKUNG. Die repräsentativen Daten stammen von 1 Tag alten Hermaphroditen (GCaMP6f-Stamm = FJH185; mitoGCaMP-Stamm; FJH597; siehe Ergänzende Tabelle 1), die durch das Vorhandensein von nur einer Reihe von Eiern identifiziert werden kann. Weitere Informationen zur Arbeit mit Würmern unterschiedlichen Alters finden Sie in der Diskussion.
    3. Warten Sie ~5 Minuten, bis das Muscimol die Wurmbewegung reduziert hat, und lassen Sie dann ein 22 mm x 22 mm großes Deckglas auf das Agar-Pad fallen, wodurch die Bewegung des Wurms physisch eingeschränkt wird.
    4. Um Neuriten im ventralen Nervenstrang abzubilden, rollen Sie den Wurm durch leichtes Schieben des Deckglases in die in Abbildung 1B,C gezeigte Ausrichtung.
      ANMERKUNG. Um den ventralen Nervenstrang zu visualisieren, positionieren Sie den Wurm mit dem Kopf nach oben und rollen Sie den Wurm, bis sich der Darm auf der rechten Seite des proximalen Abschnitts und auf der linken Seite des distalen Teils des Wurms befindet (aus der Perspektive des Betrachters). Kehren Sie diese Orientierung um (Abbildung 1C), um Neuriten im dorsalen Nervenstrang abzubilden.
  4. Den Wurm auf ein Mikroskop montieren
    1. Geben Sie einen Tropfen Immersionsöl auf das Deckglas, bevor Sie es auf den Mikroskoptisch montieren.
    2. Finden Sie den Wurm mit einem Objektiv mit geringer Vergrößerung (10x) im Hellfeld.
    3. Wechseln Sie zum 100x-Objektiv und passen Sie den Fokus an.
    4. Lokalisieren Sie den AVA-Neuriten mit der Beleuchtung des GCaMP oder mitoGCaMP mit dem 488-nm-Bildgebungslaser.
      Anmerkungen: Verwenden Sie kleine Anpassungen, um zu verhindern, dass der Wurm gequetscht oder das Deckglas abgezogen wird.

4. Aufnahme von hochauflösenden Bildströmen

  1. Im lebenden Organismus GCaMP-Bildgebung
    1. Stellen Sie die Belichtungszeit auf 20 ms ein.
    2. Passen Sie den Bildgebungslaser und die Aufnahmeeinstellungen an, bis die basale GCaMP-Fluoreszenz im mittleren Bereich des Dynamikbereichs der Kameraliegt 14. In der Diskussion finden Sie Vorschläge zur Optimierung der Bildgebungsparameter mit anderen Mikroskopie-Setups.
      ANMERKUNG. Stellen Sie für den in dieser Studie verwendeten optischen Aufbau den 488-nm-Bildgebungslaser auf die folgenden Ausgangseinstellungen ein: Laserleistung = 50 % und Dämpfung = 1. Ändern Sie die zusätzlichen Erfassungseinstellungen wie folgt: EM-Verstärkung = 200 und Vorverstärkerverstärkung = 1.
    3. Nachdem der AVA-Neurit mit der GCaMP-Fluoreszenz bei 100-facher Vergrößerung lokalisiert wurde, stellen Sie den ZDC (siehe Materialtabelle) auf einen Bereich von ±30 μm ein und starten Sie den kontinuierlichen Autofokus. Korrigieren Sie die Fokusebene vor der Bildgebung nach Bedarf manuell.
    4. Erfassen Sie einen Strom von Bildern mit 100-facher Vergrößerung. Mit dem in dieser Studie verwendeten Aufbau können Dauern von bis zu 10 Minuten erreicht werden.
  2. In-vivo-mitoGCaMP-Bildgebung
    1. Befolgen Sie die Schritte 4.1.1-4.1.2 nach Bedarf, um die basale mitoGCaMP-Fluoreszenz im mittleren Bereich für den Dynamikbereichder Kamera zu erfassen 14.
      ANMERKUNG. Stellen Sie für den in dieser Studie verwendeten optischen Aufbau den 488-nm-Bildgebungslaser auf die folgenden Ausgangseinstellungen ein: Laserleistung = 20 % und Dämpfung = 10. Ändern Sie die Erfassungseinstellungen wie folgt: EM-Verstärkung = 100 und Vorverstärkerverstärkung = 2.
    2. Nachdem die Mitochondrien im AVA-Neuriten mit Hilfe der mitoGCaMP-Fluoreszenz lokalisiert wurden, stellen Sie den ZDC wie oben in Schritt 3.3 beschrieben ein.
    3. Erfassen Sie einen Strom von Bildern mit 100-facher Vergrößerung.

5. Analyse des Bildstroms

  1. Öffnen Sie den Bildstrom in einer geeigneten Bildsoftware, um die Pixelwerte in einer Bildserie zu analysieren (siehe Materialtabelle).
  2. Definieren Sie mit dem Werkzeug Polygonauswahl die subzelluläre Region of Interest (ROI), die GCaMP oder mitoGCaMP enthält.
  3. Klicken Sie auf Analyze > Tools > ROI Manager. Klicken Sie im ROI-Manager auf Hinzufügen und dann auf Mehr > Multi-Kennzahl. Klicken Sie im Fenster "Multi Measure" auf "OK ", um automatisch die durchschnittliche, minimale und maximale Pixelintensität des oben definierten ROI für jedes Bild des Bildstreams zur weiteren Analyse zu erfassen.
    ANMERKUNG. Es wird empfohlen, die durchschnittliche Pixelintensität (Favg) für jede ROI auf die minimale Intensität (F min) zu normalisieren, wobei das Verhältnis Favg/Fmin verwendet wird, um Fluoreszenzunterschiede aufgrund der Positionierung in der z-Ebene zu berücksichtigen. Verwerfen Sie die Bildströme mit Wurmbewegung während der Bildgebung, da dies auch die Fluoreszenzmessungen beeinflussen würde.

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Ergebnisse

Diese beiden Protokolle ermöglichen die schnelle Erfassung von differentiellen Ca2+-Spiegeln innerhalb der subzellulären Regionen und Organellen einzelner Neuriten in vivo mit hoher räumlicher Auflösung. Das erste Protokoll ermöglicht die Messung von zytoplasmatischem Ca2+ mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung. Dies wird hier anhand der zellspezifischen Expression von GCaMP6f in den glutamatergen AVA-Befehlsinterneuronen15 demonstriert, deren Neuriten ...

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Diskussion

Die erste Überlegung bei der Implementierung der beschriebenen Methode betrifft die Auswahl eines Ca2+ Indikators mit idealen Eigenschaften für die gegebene Forschungsfrage. Zytoplasmatische Ca 2+-Indikatoren haben typischerweise eine hohe Affinität zu Ca 2+, und die Sensitivität dieser Indikatoren gegenüber Ca 2+ steht in umgekehrtem Verhältnis zur Kinetik (Ein-/Ausschaltrate)16,17. Dies bedeutet, dass entweder d...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (NIH) unterstützt (R01- NS115947 verliehen an F. Hoerndli). Wir bedanken uns auch bei Dr. Attila Stetak für das pAS1-Plasmid.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
100x/1.40 Oil objective  Olympus  UPlanSApo
10x/0.40 Objective Olympus  UPlanSApo
22 mm x 22 mm Cover glass VWR 48366-227 
Agarose SFR VWR J234-100G 
Beam homogenizerAndor TechnologiesBorealis upgrade to CSU-X1
CleanBench laboratory table TMC With vibration control
Disposable culture tubesVWR 47729-572 13 mm x 100 mm
Environmental chamberThermo Scientific3940Set to 20 °C
Filter wheel or sliderASIFor 25 mm diameter filters
FJH 185Caenorhabditis Genetics Center FJH 185Worm strain
FJH 597Caenorhabditis Genetics CenterFJH 597Worm strain
GFP bandpass emission filter Chroma 525 ± 50 nm (25 mm diameter)
ILE laser combiner Andor Technologies 4 laser lines 
ILE solid state 488 nm laserAndor Technologies 50 mW
ImageJNational Institutes of HealthVersion 1.52a
IX83 Spinning disk confocal microscope Olympus With Yokogawa CSU-X1 spinning disc
iXon Ultra EMCCD camera Andor Technologies 
Low auto-fluorescence immersion oil Olympus Z-81226
MetaMorph Molecular Devices Version 7.10.1 
Microscope control boxOlympusIX3-CBH
Muscimol MP Biomedical / Sigma02195336-CF 
pAS1AddGene194970Plasmid
pBSKSStratagene
pCT61Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pJM23Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pKK1 AddGene 194969Plasmid
Polybead microspheres Polysciences Inc. 00876-15 0.094 µm
Stability chamberNorlake ScientificNSRI241WSW/8HSet to 15 °C
Stage controllerASIWith filter wheel control
Standard microscope slidePremiere9108W-E75 mm x 25 mm x 1 mm
Touch panel controllerOlympusI3-TPC
Z-drift corrector Olympus IX3-ZDC2

Referenzen

  1. Berridge, M. J. Neuronal calcium signaling. Neuron. 21 (1), 13-26 (1998).
  2. Brini, M., Calì, T., Ottolini, D., Carafoli, E. Neuronal calcium signaling: Function and dysfunction. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).
  3. Brini, M., Calì, T., Ottolini, D., Carafoli, E. Intracellular calcium homeostasis and signaling. Metal Ions in Life Sciences. 12, 119-168 (2013).
  4. Berridge, M. J. The inositol trisphosphate/calcium signaling pathway in health and disease. Physiological Reviews. 96 (4), 1261-1296 (2016).
  5. Schrank, S., Barrington, N., Stutzmann, G. E. Calcium-handling defects and neurodegenerative disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (7), 035212(2020).
  6. Pchitskaya, E., Popugaeva, E., Bezprozvanny, I. Calcium signaling and molecular mechanisms underlying neurodegenerative diseases. Cell Calcium. 70, 87-94 (2018).
  7. Jadiya, P., et al. Impaired mitochondrial calcium efflux contributes to disease progression in models of Alzheimer's disease. Nature Communications. 10 (1), 3885(2019).
  8. Zeiser, E., Frøkjær-Jensen, C., Jorgensen, E., Ahringer, J. MosSCI and gateway compatible plasmid toolkit for constitutive and inducible expression of transgenes in the C. elegans germline. PLoS One. 6 (5), 20082(2011).
  9. Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-FusionTM assembly: Seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).
  10. Evans, T. C. Transformation and Microinjection. WormBook. , (2006).
  11. Giordano-Santini, R., Dupuy, D. Selectable genetic markers for nematode transgenesis. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (11), 1917-1927 (2011).
  12. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  13. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans: Transferring worms grown on NGM plates. WormBook. , (2006).
  14. Ogama, T. A beginner's guide to improving image acquisition in fluorescence microscopy. The Biochemist. 42 (6), 22-27 (2020).
  15. Mellem, J. E., Brockie, P. J., Madsen, D. M., Maricq, A. v Action potentials contribute to neuronal signaling in C. elegans. Nature Neuroscience. 11 (8), 865-867 (2009).
  16. Zhang, Y., et al. Fast and sensitive GCaMP calcium indicators for imaging neural populations. bioRxiv. , (2021).
  17. Kerruth, S., Coates, C., Dürst, C. D., Oertner, T. G., Török, K. The kinetic mechanisms of fast-decay red-fluorescent genetically encoded calcium indicators. Journal of Biological Chemistry. 294 (11), 3934-3946 (2019).
  18. de Juan-Sanz, J., et al. Axonal endoplasmic reticulum Ca2+ content controls release probability in CNS nerve terminals. Neuron. 93 (4), 867-881 (2017).
  19. Bhatla, N. C. elegans neural network. , Available from: http://wormweb.org/neurainet#c=BAG&m=1 (2014).
  20. Fung, W., Wexler, L., Heiman, M. G. Cell-type-specific promoters for C. elegans glia. Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 335-346 (2020).
  21. Ali, F., Kwan, A. C. Interpreting in vivo calcium signals from neuronal cell bodies, axons, and dendrites: a review. Neurophotonics. 7 (1), 011402(2019).
  22. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  23. Mank, M., et al. A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging. Nature Methods. 5 (9), 805-811 (2008).
  24. Birkner, A., Tischbirek, C. H., Konnerth, A. Improved deep two-photon calcium imaging in vivo. Cell Calcium. 64, 29-35 (2017).
  25. Ryan, K. C., Laboy, J. T., Norman, K. R. Deregulation of mitochondrial calcium handling due to presenilin loss disrupts redox homeostasis and promotes neuronal dysfunction. Antioxidants. 11 (9), 1642(2022).
  26. Yang, H. H., et al. Subcellular imaging of voltage and calcium signals reveals neural processing in vivo. Cell. 166 (1), 245-257 (2016).
  27. Takahashi, N., Oertner, T. G., Hegemann, P., Larkum, M. E. Active cortical dendrites modulate perception. Science. 354 (6319), 1587-1590 (2016).
  28. Nicoletti, M., et al. Biophysical modeling of C. elegans neurons: Single ion currents and whole-cell dynamics of AWCon and RMD. PLoS One. 14 (7), 0218738(2019).
  29. Church, P. J., Stanley, E. F. Single L-type calcium channel conductance with physiological levels of calcium in chick ciliary ganglion neurons. The Journal of Physiology. 496, 59-68 (1996).
  30. O'Hare, J. K., et al. Compartment-specific tuning of dendritic feature selectivity by intracellular Ca 2+ release. Science. 375 (6586), (2022).
  31. Mclntire, S. L., Jorgensen, E., Horvitz, H. R. Genes required for GABA function in Caenorhabditis elegans. Nature. 364 (6435), 334-337 (1993).
  32. Doser, R. L., Amberg, G. C., Hoerndli, F. J. Reactive oxygen species modulate activity-dependent AMPA receptor transport in C. elegans. The Journal of Neuroscience. 40 (39), 7405-7420 (2020).
  33. Wu, J., et al. A long Stokes shift red fluorescent Ca2+ indicator protein for two-photon and ratiometric imaging. Nature Communications. 5, 5262(2014).
  34. Cho, J. -H., et al. The GCaMP-R family of genetically encoded ratiometric calcium indicators. ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).
  35. Smith, J. J., et al. A light sheet fluorescence microscopy protocol for Caenorhabditis elegans larvae and adults. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1012820(2022).
  36. Müller, M., et al. Mitochondria and calcium regulation as basis of neurodegeneration associated with aging. Frontiers in Neuroscience. 12, 470(2018).
  37. Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Calcium homeostasis in aging neurons. Frontiers in Genetics. 3, 200(2012).
  38. Chen, C. -H., Chen, Y. -C., Jiang, H. -C., Chen, C. -K., Pan, C. -L. Neuronal aging: Learning from C. elegans. Journal of Molecular Signaling. 8 (1), 14(2013).
  39. Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans. Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).
  40. Sridhar, N., Fajrial, A. K., Doser, R. L., Hoerndli, F. J., Ding, X. Surface acoustic wave microfluidics for repetitive and reversible temporary immobilization of C. elegans. Lab on a Chip. 22 (24), 4882-4893 (2022).

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