Hochauflösende Fluoro-Respirometrie der Skelettmuskulatur von Pferden

Zusammenfassung

Pferde verfügen über eine außergewöhnliche aerobe Trainingskapazität, was die Skelettmuskulatur von Pferden zu einem wichtigen Gewebe sowohl für die Untersuchung der Trainingsphysiologie von Pferden als auch für die mitochondriale Physiologie von Säugetieren macht. Dieser Artikel beschreibt Techniken zur umfassenden Beurteilung der mitochondrialen Funktion in der Skelettmuskulatur von Pferden.

Zusammenfassung

Die Funktion der Mitochondrien - oxidative Phosphorylierung und die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies - ist sowohl für die Gesundheit als auch für die Krankheit von entscheidender Bedeutung. Daher ist die Messung der mitochondrialen Funktion von grundlegender Bedeutung für die biomedizinische Forschung. Die Skelettmuskulatur ist eine robuste Quelle für Mitochondrien, insbesondere bei Tieren mit einer sehr hohen aeroben Kapazität, wie z. B. Pferden, was sie zu idealen Objekten für die Untersuchung der mitochondrialen Physiologie macht. Dieser Artikel demonstriert die Verwendung von hochauflösender Respirometrie mit gleichzeitiger Fluorometrie mit frisch entnommenen Mitochondrien der Skelettmuskulatur, um die Fähigkeit zur Oxidation von Substraten in verschiedenen mitochondrialen Zuständen zu quantifizieren und die relativen Kapazitäten verschiedener Elemente der mitochondrialen Atmung zu bestimmen. Tetramethylrhodaminmethylester wird verwendet, um die Produktion des mitochondrialen Membranpotentials zu demonstrieren, das sich aus der Substratoxidation ergibt, einschließlich der Berechnung der relativen Effizienz der Mitochondrien durch Berechnung des relativen Membranpotentials, das pro Einheit des gleichzeitigen Sauerstoffflusses erzeugt wird. Die Umwandlung von ADP in ATP führt zu einer Änderung der Magnesiumkonzentration in der Reaktionskammer, die auf unterschiedliche Affinitäten der Adenylate zu Magnesium zurückzuführen ist. Daher kann Magnesiumgrün verwendet werden, um die Rate der ATP-Synthese zu messen, was eine weitere Berechnung der oxidativen Phosphorylierungseffizienz (Verhältnis von Phosphorylierung zu Oxidation [P/O]) ermöglicht. Schließlich ermöglicht die Verwendung von Amplex UltraRed, das in Kombination mit Wasserstoffperoxid ein fluoreszierendes Produkt (Resorufin) erzeugt, die Quantifizierung der Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies während der mitochondrialen Atmung sowie die Beziehung zwischen ROS-Produktion und gleichzeitiger Atmung. Diese Techniken ermöglichen die robuste Quantifizierung der mitochondrialen Physiologie unter einer Vielzahl unterschiedlicher simulierter Bedingungen und geben so Aufschluss über den Beitrag dieser kritischen zellulären Komponente zu Gesundheit und Krankheit.

Einleitung

Die Mitochondrien eukaryotischer Zellen produzieren den Großteil des ATP, das von den Zellen für Arbeit und Wartung verwendet wird¹. Ein wichtiger Schritt in der mitochondrialen Produktion von ATP ist die Umwandlung von Sauerstoff in Wasser, und daher wird die Stoffwechselkapazität der Mitochondrien und der zugehörigen Zellen häufig durch die Messung des Sauerstoffverbrauchs quantifiziert². Die mitochondriale Physiologie ist jedoch komplexer als der einfache Prozess des Sauerstoffverbrauchs, und die ausschließliche Abhängigkeit von diesem Endpunkt ermöglicht eine unvollständige Bewertung der Auswirkungen der mitochondrialen Funktion und Dysfunktion auf die Zellgesundheit. Die vollständige Charakterisierung der mitochondrialen Funktion erfordert nicht nur die Beurteilung des Sauerstoffverbrauchs, sondern auch der Produktion von ATP sowie reaktiven Sauerstoffspezies (ROS).

Zusätzliche Messungen wichtiger mitochondrialer Funktionen können gleichzeitig mit der Messung der Atmung durch den Einsatz spezifischer Fluorophore durchgeführt werden. Tetramethylrhodaminmethylester (TMRM) ist ein kationischer Fluorophor, der sich in der mitochondrialen Matrix proportional zum mitochondrialen Transmembranspannungspotential anreichert, was aufgrund dieser Akkumulation zu einer Abnahme der Fluoreszenzintensität führt³. TMRM kann als Indikator für relative Änderungen des mitochondrialen Membranpotentials verwendet werden, oder kann verwendet werden, um präzise Änderungen der Transmembranspannung mit zusätzlichen Experimenten zu quantifizieren, um Konstanten zu bestimmen, die eine Umwandlung des Fluoreszenzsignals in mV ermöglichen. Magnesiumgrün (MgG) ist ein Fluorophor, der fluoresziert, wenn er an Mg²⁺ gebunden ist, und wird für Messungen der ATP-Synthese verwendet, die auf der differentiellen Affinität von ADP und ATP für das zweiwertige Magnesiumkation⁴ basieren. Die Forscher müssen die spezifischen Affinitäts-/Dissoziationskonstanten (Kd) sowohl für ADP als auch für ATP unter bestimmten analytischen Bedingungen bestimmen, um die Änderungen der MgG-Fluoreszenz in eine Änderung der ATP-Konzentration umzuwandeln. Amplex UltraRed (AmR) ist der Fluorophor, der zur Messung der Produktion von Wasserstoffperoxid und anderen ROS während der mitochondrialen Atmung verwendet wird⁵. Durch die Reaktion zwischen_H2O2und AmR (das durch Meerrettichperoxidase katalysiert wird) entsteht Resorufin, das durch Fluoreszenz bei 530 nM nachweisbar ist. Jeder dieser Assays kann einzeln zu Assays der mitochondrialen Atmung in Echtzeit hinzugefügt werden, um gleichzeitige Messungen der jeweiligen Aspekte der mitochondrialen Physiologie zu ermöglichen und so eine direkte Verbindung zwischen Atmung und mitochondrialem Output herzustellen.

Pferde sind in der Lage, einen sehr hohen massespezifischen Sauerstoffverbrauch zu erzielen, was zum Teil auf den sehr hohen mitochondrialen Gehalt der Skelettmuskulatur von Pferden zurückzuführen ist, was dieses Gewebe für die Untersuchung der mitochondrialen Physiologie von großer Bedeutung macht. Mit der Entwicklung der hochauflösenden Respirometrie haben Studien mit dieser neuartigen Technologie dazu beigetragen, den Beitrag der Mitochondrien der Skelettmuskulatur von Pferden sowohl zur bemerkenswerten körperlichen Leistungsfähigkeit von Pferden als auch zur Pathophysiologie von Skelettmuskelerkrankungen zu definieren 6,7,8,9,10,11,12,13,14 . Untersuchungen der mitochondrialen Funktion der Skelettmuskulatur von Pferden sind besonders vorteilhaft, da die Gewinnung großer Mengen dieses Gewebes nicht terminal ist. So können Pferde nicht nur ausreichend Gewebe für die vollständige Charakterisierung der mitochondrialen Funktion bereitstellen, sondern auch als Längsschnittkontrollen für qualitativ hochwertige, mechanistische Studien zur mitochondrialen Physiologie dienen. Aus diesem Grund wurden zusätzliche Assays zur Quantifizierung des mitochondrialen Membranpotentials, der ATP-Synthese und der Produktion von ROS entwickelt, die die Messung des Sauerstoffverbrauchs in diesem Gewebe ergänzen, um eine robustere Charakterisierung der mitochondrialen Physiologie in der Skelettmuskulatur von Pferden zu ermöglichen.

Protokoll

Diese Studie wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee der Oklahoma State University genehmigt. Vier Vollblutwallache (17,5 ± 1,3 Jahre, 593 ± 45 kg) wurden in dieser Studie verwendet, um die repräsentativen Ergebnisse zu generieren.

1. Entnahme einer Skelettmuskelbiopsie

1. Entnahme von Skelettmuskelbiopsien (sterile Technik) aus der Mitte des Semitendinosusmuskels (oder eines anderen Muskels von Interesse) unter Verwendung einer 12-G-Biopsienadel des University College Hospital (UCH) (siehe Materialtabelle) unter leichter Sedierung und unter örtlicher Betäubung nach einem zuvor veröffentlichten Bericht¹¹.
2. Die Biopsieproben werden sofort in Durchstechflaschen mit eiskalter Biopsie-Transportmedienlösung (2,77 mM CaK2-EGTA, 7,23 mM K 2-EGTA, 20 mM Imidazol, 20 mM Taurin, 50 mM K-MES, 0,5 mM Dithiothreitol, 6,56 mM MgCl ₂, 5,77 mM ATP und 15 mM Phosphokreatin, eingestellt auf pH 7,1; siehe Materialtabelle) überführt. Transport zur Analyse ins Labor.
   HINWEIS: In Doerrier et ^al.15 finden Sie spezifische Anweisungen zur Vorbereitung des Biopsie-Transportmediums.
3. Isolieren Sie Mitochondrien aus den Biopsieproben mit einem handelsüblichen Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle). Der endgültige Lagerpuffer sollte keine Substrate wie ADP, ATP und Succinat enthalten, die Teil des Respirometrie-Assays sind.
4. Das endgültige Pellet der isolierten Mitochondrien wird mit 80 μl Suspensionsmedien (225 mM Mannitol, 75 mM Saccharose und 1 mM EGTA; siehe Materialtabelle) pro 100 mg Muskel, der für die Isolierung der Mitochondrien verwendet wird, resuspendiert.
5. Minimieren Sie das Intervall vom Zeitpunkt der Biopsie bis zur Isolierung der Mitochondrien und halten Sie die Proben während der gesamten Verarbeitungsschritte bei 0-4 °C, bis sie in die hochauflösenden Respirometer gegeben werden.
   HINWEIS: Vorläufige Studien haben ergeben, dass Suspensionen isolierter Mitochondrien nach ca. 2 h an Funktionsfähigkeit verlieren, wenn sie bei 0-4 °C gehalten werden.

2. Einrichten des hochauflösenden Respirometers

1. Hochauflösende Respirometer werden verwendet, um die mitochondriale Atmung und die damit verbundenen Prozesse zu quantifizieren. Verwenden Sie das vom Hersteller bereitgestellte Software-Steuerungsprogramm (siehe Materialtabelle), um das Respirometer zu steuern, die Sensoren zu kalibrieren und Rohdaten zu erfassen. Analysieren Sie die Proben für jede Testbedingung in zweifacher Ausfertigung.
   HINWEIS: In allen Fällen basieren die empfohlenen Titrationen und endgültigen Reagenzkonzentrationen, die in diesem Protokoll beschrieben sind, auf einer 2-ml-Respirometriekammer.
2. Bestimmen Sie den Hintergrund-O2-Fluss und den Nullpunkt des_O2-Sensors alle 2-4 Wochen durch die serielle Titration von Dithionit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Behalten Sie diese Kalibrierkonstanten für nachfolgende Assays bei, bis die Kalibrierung wiederholt wird.
   HINWEIS: Im Gegensatz zu bisher publizierten Verfahren mit permeabilisierten Muskelfasern^11,12,13,16, bei denen eine Hyperoxie (250-500 μM) notwendig ist, um eine Diffusionsbegrenzung von O2 zu den Mitochondrien zu vermeiden^, können isolierte Mitochondrien mit einem Bereich von 50-200 μM ^O2 bewertet werden. Dies kann einfach dadurch erreicht werden, dass sich das Atmungsmedium vor der Zugabe der mitochondrialen Suspension (d. h. nach täglicher Einzelpunktkalibrierung) mit der Raumluft ausgleicht. In ähnlicher Weise kann eine Reoxygenierung der Beatmungskammer durch einfaches Öffnen der Kammer erreicht werden, bis sich genügend Umgebungssauerstoff in den Respirometriemedien gelöst hat, um die Sauerstoffkonzentration auf das gewünschte Niveau zu erhöhen.
3. Füllen Sie die Respirometerkammern mit magnesiumfreien Medien (0,5 mM EGTA, 60 mM K-Lactobionat, 20 mM Taurin, 10 mM_KH2PO4, 20 mM HEPES, 110 mM Saccharose und 1 g/L Rinderserumalbumin [BSA], im Wesentlichen fettsäurefrei, eingestellt auf pH 7,1; siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: In Komlodi et ^al.17 finden Sie spezifische Anweisungen zur Vorbereitung des Beatmungsmediums.
   1. Stellen Sie die Inkubationstemperatur des Instruments auf 38 °C ein, um die Basaltemperatur der Skelettmuskulatur des Pferdes darzustellen, und stellen Sie das Mischen des Beatmungsmediums auf 800 U/min ein, indem Sie einen Magnetrührer verwenden, der sich im Boden der Respirometerkammer dreht.
   2. Schalten Sie die Kammerbeleuchtung aus, um Interferenzen mit Leuchtstoffsensoren zu vermeiden.
   3. Versorgen Sie die Sauerstoffelektrode mit einer Polarisationsspannung von 800 mV und verstärken Sie das resultierende Signal mit einer Verstärkungseinstellung von 1.
   4. Notieren Sie die Sauerstoffkonzentration alle 2 s, berechnen Sie den Sauerstofffluss als negative Steigung der Sauerstoffmessung über die vorangegangenen 40 s (20 Datenpunkte) und geben Sie sie als pmol x ^s-1 x ml Inkubationslösung an.
4. Kalibrieren Sie den Lambdasonden, indem Sie das Medium mit der Raumluft ausgleichen lassen. Berechnen Sie den Referenzsauerstoffpartialdruck, basierend auf dem mit dem hochauflösenden Respirometer gemessenen Luftdruck und der Standardsauerstoffkonzentration in der Atmosphäre.

3. Messung des mitochondrialen Membranpotentials mittels TMRM

1. Verwenden Sie "grüne" Fluoreszenzsensoren (530 nm dominante Wellenlänge), um das Fluoreszenzsignal aus der Beatmungskammer zu quantifizieren. Versorgen Sie die Sensoren mit 400-500 mV; Das resultierende Signal wird mit einer Verstärkung von 1:1.000 verstärkt.
   HINWEIS: Spezifische Einstellungen müssen für einzelne Geräte optimiert werden, um das erwartete Signal innerhalb des linearen Bereichs des Sensors zu erfassen.
2. TMRM (4 μL 1 mM Lösung für eine Endkonzentration von 2 μM; siehe Materialtabelle) vor der Zugabe von Mitochondrien zugeben.
3. Kalibrieren Sie das Fluoreszenzsignal mit einer einfachen Zwei-Punkt-Kalibrierung des Fluoreszenzsignals (Spannung) im Vergleich zur Menge des hinzugefügten Fluorophors (mM), bevor die Mitochondrien hinzugefügt werden.
   Anmerkungen: Verwenden Sie die Kalibrierungsfunktion für Fluoreszenzsignale in der Maschinensteuerungssoftware, um dieses Signal zu kalibrieren. Es kann 30 Minuten oder länger dauern, bis sich das Rohsignal der Fluoreszenzsonde stabilisiert hat, um den zweiten Punkt der Kalibrierung aufzuzeichnen.
4. Führen Sie die endgültige Kalibrierung des TMRM-Signals nach Abschluss des Respirometrie-Titrationsprotokolls durch, indem Sie mehrere Titrationen des Entkopplungsmittels (Carbonylcyanid-m-Chlorphenylhydrazon; 2 μl pro Titration) durchführen, bis keine weiteren Anstiege des TMRM-Fluoreszenzsignals beobachtet werden, was auf einen vollständigen Zusammenbruch des mitochondrialen Membranpotentials hinweist (Abbildung 1).
   Anmerkungen: Dieser Fluoreszenzsignalwert wird als gleich 0 mV Transmembranpotential betrachtet und als Referenzpunkt für die relativen Membranpotentialwerte verwendet, die während des Respirometrie-Titrationsprotokolls aufgezeichnet wurden.

4. Messung der ATP-Produktion mit Magnesiumgrün (MgG)

1. Verwenden Sie "blaue" Fluoreszenzsensoren (465 nm dominante Wellenlänge), um das Fluoreszenzsignal aus der Beatmungskammer zu quantifizieren. Versorgen Sie diese Sensoren für einzelne Instrumente, um das erwartete Signal innerhalb des linearen Bereichs des Sensors zu erfassen.
2. Führen Sie den chemischen Aufbau und die Kalibrierung des MgG-Fluoreszenzsignals nach der Zugabe der Mitochondrien, aber vor der Zugabe von Substraten durch. Geben Sie 8 μl 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in die Respirometriekammer, um Kationen (insbesondere Ca 2+) zu chelatisieren, die mit Mg²⁺ um die Bindung an MgG konkurrieren würden, und fügen Sie dann 4 μl 1 mM MgG (1,1 μM) in die Beatmungskammer hinzu.
3. Kalibrieren Sie das rohe Fluoreszenzsignal mit sequenziellen 10 x 2 μL-Titrationen von 100 mM_MgCl2 und lassen Sie zwischen den Titrationen 1 Minute zur Stabilisierung des Fluoreszenzsignals (Abbildung 2).
   HINWEIS: Dieser Prozess, der nach Abschluss des Assays offline abgeschlossen wird und Vorlagen verwendet, die vom Hersteller des Geräts und der zugehörigen Software zur Verfügung gestellt werden, erzeugt eine Kurve zweiter Ordnung von Magnesiumkonzentration zu Fluoreszenzsignal (erwartetes r² > 0,98), die mit einer bekannten Menge ADP, die der Respirometriekammer zugesetzt wird, und den zuvor ermittelten K_d-Werten verwendet wird, um die entsprechende Konzentration von ATP¹¹ zu bestimmen.
4. Bestimmen Sie die Rate der ATP-Synthese, d. h. die Steigung der ATP-Konzentration im Laufe der Zeit im gesamten Protokoll (Abbildung 3).

5. Messung der mitochondrialen Produktion von ROS mit Amplex UltraRed (AmR)

1. Verwenden Sie "grüne" Fluoreszenzsensoren (530 nm dominante Wellenlänge), um das Fluoreszenzsignal aus der Beatmungskammer zu quantifizieren. Versorgen Sie die Sensoren mit 300-400 mV; Das resultierende Signal wird mit einer Verstärkung von 1:1.000 verstärkt. Optimieren Sie spezifische Einstellungen für einzelne Instrumente, um das erwartete Signal innerhalb des linearen Bereichs des Sensors zu erfassen.
   HINWEIS: Wenn Sie Beatmungsmedien ohne MgCl 2 verwenden, sollte dies vor der Zugabe von Reagenzien für den AmR-Assay hinzugefügt werden (20-60 μl 100 mM MgCl 2, um 1-3 μM MgCl₂ zu erzeugen).
2. Führen Sie den chemischen Aufbau und die Erstkalibrierung des AmR-Assays durch, bevor Sie die Mitochondrien hinzufügen. Fügen Sie 30 μMol DTPA (6 μl einer 5-mM-Lösung) hinzu, um Kationen zu chelatisieren, die die Reaktion stören könnten, und fügen Sie dann Superoxiddismutase hinzu (2 μl einer 5.000 U/ml-Stammlösung zur Umwandlung von Superoxid-Anionen in_H2O2für einen umfassenderen Nachweis der reaktiven Sauerstofferzeugung), Meerrettichperoxidase (5 μl einer 500 U/ml-Stammlösung), und Amplex UltraRed (2 μl einer 10-mM-Stammlösung) (siehe Materialtabelle) zur Herstellung von 5 U/ml, 1 U/ml bzw. 10 μM in der Respirometriekammer.
3. Lassen Sie das Fluoreszenzsignal stabilisieren und fügen Sie dann zweimal im Abstand von etwa 5 Minuten 0,2 μMol Wasserstoffperoxid (5 μl einer täglich frisch hergestellten 40-μM-Lösung) hinzu.
   HINWEIS: Das Fluoreszenzsignal vor und nach den beiden Titrationen von H2O2 liefert eine lineare Dreipunkt-Kalibrierungskurve des Systems (erwartete r² > 0,95), deren Steigung die Gesamtreaktionsfähigkeit des Systems bei der Meldung der Beziehung zwischen dem Fluoreszenzsignal und der Erzeugung (oder Zugabe) von_H2O2widerspiegelt. Verwenden Sie die Fluoreszenzsignalkalibrierungsfunktion in der Maschinensteuerungssoftware, um dieses Signal zu kalibrieren.
4. Führen Sie während des gesamten Assays zusätzliche Zwei-Punkt-Kalibrierungen durch (5 μl einer täglich frisch hergestellten 40-μM-Lösung), um die Reaktionsfähigkeit des Assays anpassen zu können, wenn sich die Chemie der Respirometrie während des Assays ändert, wobei der spezifische Zeitpunkt dieser Kalibrierungspunkte im Ermessen des Prüfers liegt (Abbildung 4).

6. Messung der mitochondrialen Atmung

1. In jede 2-ml-Inkubationskammer werden 15 μl isolierte Mitochondriensuspension (Schritt 1.4) gegeben, so dass die Ergebnisse der mitochondrialen Ausbeute von 18,75 mg Muskelmasse entsprechen. Verschließen Sie die Inkubationskammer. Verschieben Sie die Probe zwischen den einzelnen Titrationen, um eine gleichmäßige Suspension der Probe aufrechtzuerhalten.
2. Messen Sie den Restsauerstoffverbrauch (ROX) vor der Zugabe von Substraten. Subtrahieren Sie diesen Wert (typischerweise weniger als 0,2 pmol_O2 x s-1 x mL-1) von den Sauerstoffverbrauchswerten jedes Schritts im Substrat-/Entkuppler-/^{Inhibitor-Titrationsprotokoll 11} nach Abschluss des Protokolls.
   HINWEIS: Es ist wichtig, dass sich die Signale sowohl des Sauerstoffsensors als auch des Fluoreszenzsensors mindestens 1 Minute lang stabilisieren (gemessen an der stabilen berechneten Steigung der primären Sensorsignale), da der Gesamtatmungszustand durch die Titrationen verändert wird, um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten. Dies gilt für alle Titrationsschritte.
3. Verwenden Sie einen Allzweck-SUIT, der die anfängliche Charakterisierung der mitochondrialen Funktion der Skelettmuskulatur des Pferdes ermöglicht. Beginnen Sie mit sequenziellen Titrationen von Pyruvat (5 μl von 2 M wässriger Lösung), Glutamat (10 μl von 2 M wässriger Lösung) und Malat (10 μl von 0,4 M wässriger Lösung) in jede Kammer, um Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NADH) herzustellen und die nicht-phosphorylierende (Leck-) Atmung zu stimulieren, unterstützt durch NADH, das durch Komplex I (L_N) oxidiert wird (Abbildung 1, Abbildung 3 und Abbildung 4).
4. Fügen Sie ADP (20 μl 500 mM wässrige Lösung; siehe Materialtabelle) hinzu, um die phosphorylierende Atmung durch Komplex I (P_N) zu stimulieren.
5. Fügen Sie Succinat (20 μl 1 M wässrige Lösung; siehe Materialtabelle) hinzu, um durch die Kombination von Komplex I und Komplex II (P_N+S) eine phosphorylierende Atmung zu erzeugen.
   Anmerkungen: Bei der Kombination der Atmung durch Komplex I und Komplex II kann der Sauerstoffverbrauch hoch genug sein, um den größten Teil des im Inkubationsmedium gelösten Sauerstoffs zu verbrauchen. Wenn die O2-Konzentration unter 50 μM sinkt, reoxygenieren Sie das Inkubationsmedium, indem Sie die Inkubationskammer entsiegeln, bis die gemessene _{O2-Konzentration} über 150 μM angestiegen ist. Wiederholen Sie diesen Schritt nach Bedarf, um genügend O 2 für die mitochondriale Atmung aufrechtzuerhalten.
6. Fügen Sie Rotenon (2 μl 0,1 mM Ethanollösung; siehe Materialtabelle) hinzu, um den Komplex I zu blockieren. Der resultierende Sauerstofffluss repräsentiert die Fähigkeit von Komplex II, den mitochondrialen Sauerstoffverbrauch durch die Oxidation von Succinat allein (P_S) zu unterstützen.
   ACHTUNG: Rotenon ist eine giftige Substanz. Verwenden Sie die Standard-Laborsicherheit und vermeiden Sie das Verschlucken oder Einatmen.
7. Berechnen Sie den Mittelwert für eine gegebene Versuchsbedingung über einzelne Respirometriekammern, die Aliquots einer einzelnen Biopsie enthalten.
   HINWEIS: Abgeleitete Berechnungen, wie z. B. Flusskontrollverhältnisse (FCRs), sind wertvoll bei der Identifizierung relativer Änderungen in verschiedenen Pfaden und umfassen FCR-Leck (L N/P N), FCR N (P _N/P N+S) und FCR S (P S/P_N+S). Die berechnete oxidative Phosphorylierungseffizienz (1-L_N/P_N+S) liefert eine Schätzung der Gesamtauswirkungen der Leckatmung, bereinigt um die Gesamtrespirationskapazität.

Ergebnisse

Der vorgeschlagene Referenzzustand ist der eines gesunden, sesshaften Vollbluts (keine erhöhte Fitness durch Zwangsbewegung) und einer frischen Muskelprobe, die aus dem Zentrum eines Haltungsmuskels entnommen wurde, einen hohen Anteil an mitochondrienreichen Typ-I-Skelettmuskelfasern enthält und unter Bedingungen inkubiert wurde, die dem Ruhestoffwechsel nahe kommen (d. h. 38 °C und pH 7,0). Unter diesen Bedingungen kann der Untersucher mit L-N-Werten von 2,71 ± 0,90,_P-N-Werten von 62,40 ± 26,22, P-N+S-We...

Diskussion

Die Hinzufügung von Fluoreszenzsignalen zum Standardausgang des hochauflösenden Respirometers liefert wertvolle Informationen über die mitochondriale Physiologie, aber eine sorgfältige Kalibrierung des Fluoreszenzsignals ist entscheidend für die Qualität der Daten. Die ursprünglichen Protokolle für die Verwendung von MgG deuten darauf hin, dass die Kalibrierkurven, die bei der Berechnung der Magnesium-Adenylat-Dissoziationskonstanten erzeugt wurden, auf nachfolgende Assays angewendet werden könnten

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
ADP	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	A5285
Amplex UltraRed	Life Technologies	A36006
ATP	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	A2383
BSA	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	A6003
Calcium carbonate	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	C4830
CCCP	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	C2759
DatLab 7.0	Oroboros Inc		Software to operate O2K fluororespirometer
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	D0632
DTPA	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	D1133
EGTA	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	E4378
Glutamate	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	G1626
HEPES	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	H7523
Horseradish peroxidase	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	P8250
Hydrogen peroxide	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	516813	Must be made fresh daily prior to assay
Imidazole	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	I2399
K-MES	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	M8250
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	M9272
Magnesium Green	Thermo Fisher Scientific	M3733
Malate	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	M1000
Mannitol	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	M9647
Mitochondrial isolation kit	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	MITOISO1
O2K fluororespirometer	Oroboros Inc		Multiple units required to run full spectrum of assays concurrently.
Phosphocreatine	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	P7936
Potassium hydroxide	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	P1767
Potassium lactobionate	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	L2398
Potassium phosphate	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	P0662
Pyruvate	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	P2256	Must be made fresh daily prior to assay
Rotenone	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	R8875
Succinate	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	S2378
Sucrose	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	84097
Superoxide dismutase	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	S8160
Taurine	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	T0625
Titration pump	Oroboros Inc
Titration syringes	Oroboros Inc
TMRM	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	T5428
UCH biopsy needle	Millenium Surgical Corp	72-238067	Available in a range of sizes