Quantifizierung der Fitnesskosten bei transgenen Aedes aegypti-Mücken

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt, wie gängige Lebensparameterdaten bei Aedes aegypti-Mücken gemessen werden, einschließlich Fruchtbarkeit, Flügelgröße, Fertilität, Geschlechterverhältnis, Lebensfähigkeit, Entwicklungszeiten, männlicher Beitrag und Langlebigkeit adulter Mücken. Diese Messungen können verwendet werden, um die Fitness transgener Stechmücken zu beurteilen.

Zusammenfassung

Transgene Mücken weisen im Vergleich zu ihren Wildtyp-Artgenossen oft Fitnesskosten auf. In diesem Zusammenhang geht es bei Fitnesskostenstudien darum, Lebensparameterdaten von genetisch veränderten Stechmücken zu sammeln und sie mit Stechmücken zu vergleichen, denen Transgene aus demselben genetischen Hintergrund fehlen. Dieses Manuskript zeigt, wie gemeinsame Merkmale der Lebensgeschichte der Mücke Aedes aegypti gemessen werden können, einschließlich Fruchtbarkeit, Flügelgröße und -form, Fruchtbarkeit, Geschlechterverhältnis, Lebensfähigkeit, Entwicklungszeiten, männlicher Beitrag und Langlebigkeit der adulten Mücke. Diese Parameter wurden gewählt, weil sie den Fortpflanzungserfolg widerspiegeln, einfach zu messen sind und in der Literatur häufig berichtet werden. Die repräsentativen Ergebnisse quantifizieren die Fitnesskosten, die entweder mit einem Gen-Knock-out oder einer einmaligen Insertion eines Gene-Drive-Elements verbunden sind. Die Standardisierung der Art und Weise, wie Lebensparameterdaten gesammelt werden, ist wichtig, da solche Daten verwendet werden können, um die Gesundheit transgener Mücken zu vergleichen, die in Studien erzeugt wurden, oder um die Transgen-Fixierungsrate in einer simulierten Wildtyp-Mückenpopulation zu modellieren. Obwohl dieses Protokoll spezifisch für transgene Aedes aegypti ist, kann es auch für andere Mückenarten oder andere experimentelle Behandlungsbedingungen verwendet werden, mit dem Vorbehalt, dass bestimmte biologische Kontexte besondere Anpassungen erfordern können.

Einleitung

Das Überleben des Stärkeren ist die darwinistische Idee, dass Individuen, die Gene besitzen, die am besten an ihre Umwelt angepasst sind, diese Gene an nachfolgende Generationen weitergeben¹. Das bedeutet, dass es die Fitness ist, die darüber entscheidet, ob ihre Gene überleben werden. Dieses mehr als 150 Jahre alte Konzept ist vielleicht die wichtigste Determinante für die Entwicklung eines erfolgreichen Gene Drives bei transgenen Mücken. Gene Drives, oder das super-Mendelsche Vererbungsmuster eines egoistischen genetischen Elements, das es ihm ermöglicht, sich in Populationen auszubreiten², werden für die genetische Schädlingsbekämpfung erforscht³. Im Rahmen der Vektorkontrolle zielt diese Strategie darauf ab, Wildtyp-Arthropoden (WT) entweder durch pathogenresistente Arthropoden zu ersetzen (Populationsmodifikation) oder sie ganz zu eliminieren (Populationssuppression)⁴. Transgene Mücken weisen jedoch im Vergleich zu ihren WT-Artgenossen oft Fitnesskosten (auch genetische Belastung genannt) auf, was bedeutet, dass das Transgen in Populationen, die sie übertreffen können, verloren geht. Die Kopplung von Transgenen mit einem Gene-Drive-System ist daher notwendig, um etwaige Fitnesskosten auszugleichen und das Transgen in der Population auf einem Niveau zu pushen, das größer ist als von typischer Mendelscher Vererbung erwartet⁴.

Laborstudien an Mückenvektorarten haben gezeigt, dass Transgene oft Fitnesskosten aufweisen ^5,6,7. Zum Beispiel Irvin et al. Es wurden verschiedene Lebensparameter in Aedes (Ae.) aegypti gemessen, die so konstruiert wurden, dass sie unter Drosophila-Aktin-5C oder synthetischen 3XP3-Promotoren ein verstärktes grün fluoreszierendes Protein (eGFP) oder Transposase-Gene exprimieren, und verglichen sie mit dem Wildtyp-Orlando-Stamm (dem gleichen genetischen Hintergrund, von dem sie abgeleitet wurden)⁵. Vor allem fanden sie heraus, dass alle transgenen Stämme eine signifikant reduzierte Fortpflanzungsfähigkeit aufwiesen⁵. Abhängig vom Transgen zeigten einige Anopheles (An.) Mücken, die Transgene exprimierten, die die Entwicklung des Plasmodium-Parasiten hemmten, auch Fitnesskosten⁶. Insbesondere legte An. stephensi, die eine Bienengiftphospholipase (PLA2) unter konstitutiven oder blutmehlinduzierbaren Promotoren exprimierte, signifikant weniger Eier im Vergleich zu den Kontrollen⁶. Diese Autoren stellten auch fest, dass transgene Anopheles, die ein anderes Transgen, ein SM1-Dodecapeptid-Tetramer, exprimierten, keine Fitnesskosten aufwiesen, was sie zu dem Schluss veranlasste, dass die transgenübertragenen Fitnesskosten zumindest wahrscheinlich teilweise von der Wirkung des produzierten transgenen Proteins abhängen⁶. In der Tat können die Fitnesskosten auf transgene Produkte, Positionseffekte, Off-Target-Effekte, Insertionsmutagenese oder Inzuchteffekte bei im Labor gezüchteten Stämmen zurückgeführt werden⁷. Gene Drives müssen daher robust genug sein, um diese transgeninduzierten Fitnesskosten auszugleichen und gleichzeitig die Entwicklung von Insertionen und Deletionen (Indels) zu vermeiden, die den Antrieb selbst blockieren.

Die Kosten für die Entwicklungs- oder Reproduktionsfitness können in Labor- oder Käfigstudien^{gemessen werden 7}, wobei der Vorbehalt darin besteht, dass unbekannte Faktoren in diesem Bereich ebenfalls eine Rolle spielen können. Nichtsdestotrotz sind kontrollierte Fitnessstudien ein wichtiger erster Schritt bei der Planung oder Bewertung gentechnisch veränderter Mückenfreisetzungen, wie z. B. ein Gene-Drive-Programm, um festzustellen, ob die transgene Linie über nachfolgende Generationen hinweg bestehen bleibt. Zum Beispiel Hammond et al. evaluiert Ein gambiae CRISPR/Cas9-basierter Gene Drives, die die für die weibliche Fertilität notwendigen Gene stören^{sollen 8}. In Käfigstudien, die über mindestens 25 Generationen durchgeführt wurden, fanden die Autoren heraus, dass die Mücken Gen-Drive-resistente Allele entwickelten, die die CRISPR-gezielte Spaltung blockierten und die weibliche Fruchtbarkeit wiederherstellten⁸. Ihre Modellierungsbemühungen deuteten darauf hin, dass die Fertilität bei Frauen, die heterozygot für den Gene Drive sind, die dramatischsten Auswirkungen auf die Gene-Drive-Fixierung unter simulierten Bedingungen hat⁸. In diesem Sinne zeigten Ae. aegypti (Higgs' White Eye Stamm, HWE), die so konstruiert wurden, dass sie autonome Gene-Drive-Kassetten unter verschiedenen Promotoren oder an verschiedenen intergenen Loci exprimieren, in simulierten Populationen unterschiedliche Raten der Gene-Drive-Fixierung⁹. Unter Verwendung der MGDrivE-Modellierung¹⁰, kombiniert mit gemessenen Raten der Indelbildung, maternalen Effekten und im Labor gesammelten Lebensparameterdaten, fanden die Autoren heraus, dass die Fitness der Mücken die Persistenz des Gene Drives unter simulierten Bedingungen am stärksten^{beeinflusste 9}. Die Fitnesskosten, die die Effizienz des Gene Drives am ehesten beeinträchtigen, sind auf die somatische Cas9-(Über-)Expression oder auf das Zielgen zurückzuführen, insbesondere bei Heterozygoten, und nicht auf den intrinsischen Antrieb selbst 11,12,13,14,15,16,17.

Aufgrund ihrer Bedeutung ist die Fitness ein wichtiger Faktor für die Fähigkeit einer transgenen Linie, über nachfolgende Generationen hinweg zu überleben, und sie kann als Indikator für physiologische Effekte verwendet werden, die mit einem Transgen verbunden sind. Zum Beispiel können Off-Target-Effekte mit Fitnesskosten verbunden sein. In diesem Fall empfiehlt sich die Rückkreuzung einer transgenen Linie über mehrere Generationen. Darüber hinaus kann es auch notwendig sein, die transgene Linie mit einer Linie zu überschreiten, die eine Feldpopulation widerspiegelt, um zu untersuchen, wie gut die transgene Population in der realen Welt konkurrieren kann. Um die Fitnesskosten so zu quantifizieren, dass sie vergleichbar sind, enthält dieses Manuskript einfache Protokolle zur Messung gemeinsamer Lebensgeschichtsmerkmale bei Ae. aegypti-Mücken, mit besonderem Schwerpunkt auf den Fitnesskosten im Zusammenhang mit Transgenen, damit solche Studien leichter reproduzierbar sind. Zu den Protokollen gehören Fruchtbarkeit, Fruchtbarkeit, Geschlechterverhältnis, Lebensfähigkeit, Entwicklungszeiten, männlicher Beitrag und Langlebigkeit bei Erwachsenen. Die Messung der Flügellänge und -fläche wurde ebenfalls als Fitnessmessung gewählt, da sie mit der Thoraxlänge ^18,19 und der Körpergröße korreliert, was in direktem Zusammenhang mit der Größe, Fruchtbarkeit und Immunität des Blutmehls steht^20,21. Obwohl es viele Möglichkeiten gibt, die Fitness zu beurteilen, wurden diese Parameter gewählt, weil sie den Fortpflanzungserfolg widerspiegeln, einfach zu messen sind und in der Literatur häufig berichtet werden.

Protokoll

HINWEIS: Dieses Protokoll wurde für transgene und Wildtyp-Ae . aegypti-Linien geschrieben, die zuvor validiert und etabliert wurden. Weitere Informationen zur Erzeugung transgener Ae. aegypti finden Sie bei Kistler et al.²² und Coates et al.²³. Alle nachstehend beschriebenen Versuche wurden nach Standardaufzuchtverfahren für Ae. aegypti durchgeführt. Die Mücken wurden bei 28 °C mit einer relativen Luftfeuchtigkeit von 75 % bis 80 % und einem 12-stündigen Licht-/12-Stunden-Dunkelzyklus gehalten. Zu statistischen Zwecken wird dringend empfohlen, mindestens 100 einzelne Eierpapiere pro Mückenfleck zu erzeugen. Umfassende Fitnessstudien dauern etwa 3 Monate (Abbildung 1).

1. Messung der Fruchtbarkeit bei weiblichen Mücken

1. Schlüpfen Sie transgene und WT-Mücken (mit dem gleichen genetischen Hintergrund, aber ohne Transgen), indem Sie Eipapier über Nacht im Insektarium in steriles Wasser legen, wobei die Standardaufzuchtbedingungen eingehalten werden. Lassen Sie die Larven ad libitum fressen, indem Sie mehrere Tropfen (jeweils ca. 50 μl) gemahlene Fischfutteraufschlämmung (Tetramin) (ca. 30 % w/v) zuführen. Die ersten Larven im Stadium sind 1 Tag nach dem Schlüpfen erkennbar. Setzen Sie die Larven in größere Behälter ein, damit kein Gedränge entsteht, in der Regel können 100-150 Larven in einem 1 L Wasservolumen mit einer Oberfläche von ca. 250 cm^aufgezogen werden. Stellen Sie weiterhin Tetramin-Gülle als Nahrungsquelle zur Verfügung, damit sich die Larven nach Belieben ernähren können. Geben Sie die Futtergülle in diskreten Tröpfchen hinzu, so dass den Larven immer ausreichend Futter zur Verfügung steht und das Wasser nicht trüb erscheint. Die Larven werden mit jedem Stadium größer und verpuppen sich schließlich in den Larvenschalen.
2. Sobald die Puppen zu schlüpfen beginnen, ~5-6 Tage nach dem Schlüpfen, trennen Sie sie nach Geschlecht, um sicherzustellen, dass die erwachsenen Tiere Jungfrauen sind, sobald sie schlüpfen (für die nachfolgende Paarung), wie unten beschrieben.
   1. Um die Puppen nach Geschlecht zu sortieren, beginnen Sie damit, die Puppen mit 3-ml-Plastikpipetten in kleine Plastikbecher mit sauberem Leitungswasser zu pflücken. Männliche Puppen sind tendenziell kleiner und neigen dazu, im Vergleich zu Hündinnen zuerst zu schlüpfen. Sortieren Sie zuerst die Puppen nach Größe und bestätigen Sie dann dieses erste Screening nach Morphologie.
   2. Schieben Sie die Puppe auf einen Objektträger aus Glas und entfernen Sie überschüssiges Wasser mit einem Taschentuch. Dadurch wird die Puppe bewegungsunfähig. Positionieren Sie die Puppe unter einem Stereoskop mit 2-4-facher Vergrößerung mit einem feinen Pinsel mit der Bauchseite nach oben.
   3. Analysieren Sie den Schwanz visuell auf Unterschiede in der Form des Genitallappens (am Ende der Puppenabdominalsegmente hinter den Paddeln; Abbildung 2). Weibchen haben spitze Flossen, die über die Genitallappen hinausragen und grob an eine Krone oder Vampirzähne erinnern, während männliche Genitallappen abgerundet sind und diese spitzen Strukturen nicht aufweisen. Siehe Carvalho et al.²⁴ für zusätzliche Zahlen.
3. Legen Sie männliche und weibliche Puppen in separate Wasserbecher und legen Sie sie in die richtige Eindämmung, z. B. 1,9-Liter-Kartons (1/2 Gallone oder 64 oz) mit 0,2 m x 0,2 m (8 Zoll x 8 Zoll) weißem Organdy-Stoff, die jeweils ~150 Puppen enthalten.
4. Stellen Sie eine Zucker- und Wasserquelle auf den Käfigen bereit (z. B. Rosinen und einen mit Wasser gefüllten Becher, der mit Gaze bedeckt und mit zwei Gummibändern gesichert ist). Schneiden Sie ein stiftgroßes Loch in die Kartons und decken Sie es mit einem Gummistopfen ab, damit zusätzliche Puppen in die Käfige gegeben werden können, wenn sie herauskommen.
5. 3-5 Tage nach dem Schlüpfen des adulten Tieres betäuben Sie die Mücken, indem Sie die Kartons für ~2-5 Minuten bei 4 °C stellen. Obwohl sie immer noch zucken können, sind die Mücken ausreichend betäubt, sobald der Großteil auf den Boden des Kartons fällt. Legen Sie die Mücken für ~30 min-1 h auf eine Petrischale aus Glas auf Eis.
   HINWEIS: Wenn Sie die Mücken zu lange bei 4 °C stehen lassen, kann dies ihre Gesundheit erheblich beeinträchtigen, obwohl wir keine Auswirkungen festgestellt haben, wenn sie bis zu 1 h auf Eis gelassen werden.
6. Kreuzen Sie WT oder transgene GD1 oder GD2⁹ (CRISPR/Cas-9-basierter) Männchen en masse mit jungfräulichen WT (Kontroll) Weibchen, indem Sie anästhesierte Mücken im Verhältnis von fünf WT oder transgenen Männchen zu einem WT-Weibchen in Mückenkartons geben, die jeweils ~150 Mücken enthalten. Achten Sie darauf, die Käfige nach männlichem Typ zu beschriften.
   HINWEIS: Dieses Kreuzungsschema dient dazu, die Eignung für GD1- oder GD2 9-Hemizygoten (d. h. Mücken, die eine Kopie des Transgens beherbergen) zu bestimmen. Um die Eignung für homozygote transgene Linien zu bestimmen, kann das Kreuzungsschema so angepasst werden, dass transgene Männchen und Weibchen sich im Vergleich zu Kreuzungen aus WT-Männchen und -Weibchen paaren dürfen.
7. Nach 2-3 Tagen füttern Sie die Weibchen nach den üblichen Aufzuchtpraktiken²⁵ mit Blut, indem Sie eine Blutquelle auf dem Käfig bereitstellen. Entfernen Sie die Zuckerquelle 24 h vor der Blutfütterung und die Wasserquelle ~2-3 h vor der Blutfütterung, um die Fütterungseffizienz zu erhöhen.
8. Nach der Blutfütterung betäuben Sie die Mücken, indem Sie sie wie in Schritt 1.5 bei 4 °C platzieren.
9. Sortieren Sie die mit Blut gefütterten (vollständig geschwollenen) Weibchen von den nicht gefütterten Weibchen, indem Sie ihren Bauch visuell auf Schwellungen untersuchen. Entsorgen Sie die nicht gefütterten, teilweise gefütterten und männlichen Tiere.
10. Setze die vollgestopften Weibchen zurück in ihre jeweiligen Käfige und stelle eine Zucker- und Wasserquelle auf den Käfigen bereit.
11. Nach 2-3 Tagen legen Sie einzelne Weibchen in konische 50-ml-Röhrchen, die mit Filterpapier ausgekleidet sind, das mit Bleistift vorbeschriftet wurde (Abbildung 3). Decken Sie die konischen Rohre mit einem Netz ab und verschließen Sie sie mit zwei Gummibändern.
12. Sobald die Weibchen wach sind, füllen Sie alle Röhrchen mit ~5 mL Leitungswasser. Lege ein kleines Stück Rosinen oder in Zucker getränkten Wattebausch auf jede konische Röhre. Lassen Sie die Weibchen 1-2 Tage im Insektarium und lassen Sie sie eiablegen.
13. Nach 1-2 Tagen entleeren Sie jeden konischen Schlauch und betäuben Sie die Mücken, indem Sie sie auf 4 °C setzen. Für eine schnelle Verarbeitung verwenden Sie die Spitze einer 3-ml-Kunststoffpipette, die gegen das Netz gedrückt wird, um das Wasser aus jedem konischen Röhrchen abzulassen. Drehen Sie die Röhren auf den Kopf und legen Sie sie zum Abtropfen auf ein Papiertuch. Legen Sie die konischen 50-ml-Röhrchen in einen Röhrchenhalter und stellen Sie das Gestell auf 4 °C.
14. Sammeln Sie das Eierpapier und zählen Sie die Anzahl der Eier auf jedem Papier. Zählen Sie die Weibchen, die keine Eier legen, mit 0 und beziehen Sie sie in die Analyse mit ein. Berechnen Sie die durchschnittliche Fruchtbarkeit als die Gesamtzahl der auf jedem Papier gezählten Eier geteilt durch die Gesamtzahl der gescreenten Weibchen.
    HINWEIS: Digitale Bilder der einzelnen Eierpapiere können als visuelle Aufzeichnung für die Zählbestätigung dienen (Abbildung 4).
15. Trocknen Sie die Eipapiere und legen Sie sie zurück in das Insektarium. Es wird empfohlen, dass die Eierpapiere für ein optimales Schlüpfen mindestens 3-5 Tage trocknen²⁵.

2. Messen von Flügellänge, Fläche und Schwerpunktgröße

1. Frieren Sie mindestens 25 WT oder transgene altersgleiche blutgefütterte Weibchen aus der abgeschlossenen Fruchtbarkeitsstudie ein, indem Sie die Mückenkäfige für ca. 15 Minuten bei -20 °C platzieren.
   HINWEIS: Frieren Sie den Behälter nicht über einen längeren Zeitraum ein und schütteln oder lassen Sie ihn nicht fallen, da dies dazu führen kann, dass die Flügel von den Mücken abfallen.
2. Präparieren Sie den linken Flügel jeder Mücke, schneiden Sie das Gelenk des Flügels und des Brustkorbs heraus und entfernen Sie den gesamten Flügel, gemäß dem untenstehenden Protokoll.
   1. Halten Sie die Mücke mit einer Hand mit einer Pinzette fest und fassen Sie die Brustregion unter den Flügeln.
   2. Mit einer anderen Pinzette in der anderen Hand präparieren Sie den linken Flügel jeder Mücke, indem Sie das Gelenk des Flügels und den Brustkorb mit leichtem Druck herausschneiden, um den Flügel abzuziehen, wobei der gesamte Flügel entfernt wird, ohne die Flügelvenen zu zerreißen.
3. Legen Sie den Flügel mit einer Pinzette flach liegend auf einen Glasschieber. Geben Sie mit einer Transferpipette einen Tropfen einer 15-ml-Stammlösung, die aus 70 % Ethanol besteht, und einen Tropfen Spülmittel auf den Flügel auf dem Objektträger.
4. Geben Sie einen Tropfen 80%iges Glycerin auf das Deckglas und geben Sie es auf den Flügel in die Ethanol-Seifenlösung.
5. Fotografieren Sie die auf den Dias montierten Flügel mit einer Kamera mit einem 65-mm-Objektiv (7D-65 mm-1x; Zoom = 1, 200, 6,3, ISO = 100). Notieren Sie sich den Pixel-/mm-Maßstab und stellen Sie sicher, dass dieser für alle Bilder gleich bleibt. Wenn mehrere Flügel zusammen abgebildet werden, schneiden Sie die Fotos auf einzelne Flügel zu und fügen Sie jedem Foto Maßstabsleisten hinzu. Speichern Sie die Bilder im TIFF-Format mit LZW-Komprimierung, wobei jedes Bild eindeutig mit allen Informationen für den einzelnen Flügel beschriftet ist.
   HINWEIS: Die Flügel können mit einer anderen Kamera und Vergrößerung oder mit einer an ein Mikroskop angeschlossenen Kamera für andere Studien fotografiert werden, wenn die Einstellungen gleich bleiben und der Pixel-/mm-Maßstab für jeden fotografierten Flügel in der Studie gleich bleibt. Das Pixel/mm-Verhältnis wird bei der Bestimmung der Messungen berücksichtigt.
6. Laden Sie tpsUtil und tpsDig herunter, kostenlose morphometrische Bildverarbeitungssoftware. Siehe Rohlf ^26,27 für weitere Informationen über die Software.
7. Digitalisieren Sie die Flügel mit tpsUtil, um eine TPS-Datei der Flügelfotos für den nächsten Schritt der Digitalisierung zu erstellen.
   1. Öffnen Sie dazu tpsUtil, und wählen Sie unter Operation die Option TPS-Datei aus Bildern erstellen aus. Klicken Sie auf Eingabe, wählen Sie die Datei aus, die die einzelnen Flügelbilder enthält, und wählen Sie dann ein beliebiges Bild aus, um diesen Ordner auszuwählen. Klicken Sie auf Ausgabe und benennen Sie die Datei, die erstellt werden soll, im .tps-Format. Klicken Sie auf Speichern.
   2. Klicken Sie dann unter Aktionen auf Setup. Wählen Sie Alle einschließen, klicken Sie auf Erstellen und schließen Sie das Popup-Fenster. Unter Operation wählen Sie nun Proben zufällig bestellen. Klicken Sie auf Eingabe und wählen Sie die .tps-Datei aus, die gerade erstellt wurde. Klicken Sie auf Ausgabe, benennen Sie die TPS-Datei um, um anzugeben, dass es sich um die Dateiversion mit den zufällig sortierten Stichproben handelt, und klicken Sie auf Speichern. Klicken Sie dann auf Erstellen. Schließen Sie das Programm tpsUtil.
      HINWEIS: Um Messfehler zu reduzieren, können die Flügelfotos dupliziert und zweimal für eine technische Replizierung verwendet werden.
8. Verwenden Sie die tpsDig-Software, um zweidimensionale kartesische Koordinaten für die Landmarken zu identifizieren. Wählen Sie unter Eingabe die .tps-Datei aus, die in Schritt 2.7 erstellt wurde. Stellen Sie die Skala auf die in Schritt 2.5 festgelegte Skala ein. Wählen Sie unter Optionen die Option Bildtools aus, und klicken Sie dann auf Messen.
9. Fügen Sie dem Bild Orientierungspunkte hinzu, indem Sie auf das blaue Fadenkreuzsymbol klicken, das Orientierungspunkte digitalisieren darstellt, und klicken Sie dann auf die in Abbildung 5 gezeigten Flügelgelenke in der Reihenfolge von Orientierungspunkt 1 bis Orientierungspunkt 14.
   HINWEIS: Diese Orientierungspunkte wurden ausgewählt, weil sie bereits bei der Digitalisierung und Analyse von Flügelmarkern¹⁹ verwendet wurden, an den Gelenken der Flügeladern in vielen Proben leicht zu lokalisieren sind und genügend Flügelorientierungspunkte bieten, um die Größe und Form des Flügels zu erfassen.
10. Wenn Sie Orientierungspunkte markieren, markieren Sie fehlende oder verdeckte Orientierungspunkte (aufgrund von Flügelfaltung oder -beschädigung) in tpsDig als fehlend, indem Sie auf das M-Symbol klicken, um sie von der Analyse auszuschließen und die korrekte Reihenfolge der Orientierungspunkte beizubehalten. Klicken Sie auf den roten, nach rechts zeigenden Pfeil, um die Digitalisierung des Orientierungspunkts für die nächsten Bilder zu wiederholen, bis alle Bilder in der Datei fertiggestellt sind. Speichern und schließen Sie die Datei.
    HINWEIS: Die Orientierungspunkte müssen dem Flügelbild in der richtigen Reihenfolge für jedes Bild hinzugefügt werden, damit die Berechnungen von Flügellänge, -fläche und -größe korrekt sind.
11. Berechnen Sie die Flügellänge und -fläche mit dem R-Skript, das in der Zusatzdatei 1 bereitgestellt wird, und ändern Sie sie für den Speicherort der .tps-Datei und den Bildmaßstab gemäß dem Experiment.
12. Berechnen Sie die Flügelschwerpunktgröße, ein statistisch von der Form unabhängiges Größenmaß, definiert als die Quadratwurzel der Summe der quadrierten Abstände jedes der Landmarken vom Mittelpunkt des Flügels^28,29.
13. Verwenden Sie eine generalisierte Prokrustes-Ausrichtung, um Nicht-Formvariationen zu entfernen, und plotten Sie mittlere Landmark-Koordinaten mit Flügeln, bei denen alle Landmarken intakt sind. Verwenden Sie sowohl für die Bestimmung der Flügelschwerpunktgröße als auch für die Bestimmung des mittleren Orientierungspunkts das R-Skript in der Zusatzdatei 2, und ändern Sie den Speicherort der .tps-Datei und den Bildmaßstab gemäß dem Experiment.

3. Beurteilung der Fruchtbarkeit von Eizellen

1. Schlüpfen Sie einzelne F_1-Eier aus den Papieren, die von einzelnen Weibchen (in Schritt 1 gesammelt) gesammelt wurden, in durchsichtige Feinkostbehälter aus Polypropylen mit ~100 ml frisch sterilisiertem deionisiertem Wasser. Fügen Sie zwei oder drei Tropfen gemahlene Fischfutteraufschlämmung für die Ad-libitum-Fütterung hinzu. Legen Sie die Oberseiten der Behälter mit Netz oder Organdy aus und befestigen Sie sie mit einem Gummiband.
2. Entfernen Sie 2-3 Tage nach dem Schlüpfen die Eipapiere aus dem Wasser und lassen Sie sie über Nacht trocknen, indem Sie sie in einen neuen Behälter legen, der mit einem Deckel oder Netz abgedeckt ist, und sie im Insektarium lassen.
3. Schlüpfen Sie das Eierpapier in denselben Behältern wieder, in denen es ursprünglich geschlüpft ist, indem Sie es wieder in den Wasserbehälter legen.
   HINWEIS: Das Trocknen und erneute Schlüpfen des Eierpapiers verbessert die Effizienz des Schlupfes erheblich. Bei anderen Mückenarten ist dies möglicherweise nicht erforderlich.
4. 3-5 Tage nach dem ersten Schlüpfen sind die Larven (2^{. bis 4. Stadium)} visuell auf einen transgenen Marker zu untersuchen (falls zutreffend; Abbildung 6). Untersuchen Sie mehrere Larven gleichzeitig unter einem Fluoreszenzmikroskop, indem Sie sie auf ein Stück Filterpapier legen, das auf ein mit Papiertüchern ausgelegtes Organdy oder Netz gelegt wird. Die Papiertücher nehmen überschüssiges Wasser auf, so dass das Filterpapier zur Sichtung und Manipulation der immobilisierten Larven verwendet werden kann.
5. Notieren Sie die Anzahl der positiven oder negativen transgenen Larven. Entsorgen Sie die negativen Larven.
6. Reinigen Sie das Larvenwasser, um optimale Entwicklungszeiten zu gewährleisten. Pipettieren Sie dazu die Larven in einen kleinen Becher, entsorgen Sie das schmutzige Wasser und ersetzen Sie es durch frisches Leitungswasser. Fügen Sie die positiven Larven hinzu und stellen Sie sicher, dass genügend gemahlene Fischfutterauflage zur Verfügung steht.
7. Berechnen Sie die Fertilität als Anzahl der transgenen Larven oder Kontrolllarven dividiert durch die Gesamtzahl der Eier.

4. Bestimmung des Geschlechterverhältnisses bei den Puppen

1. Bis zu 14 Tage nach dem Schlüpfen ist die Anzahl der männlichen und weiblichen Puppen weiter zu sammeln und aufzuzeichnen (wie in Schritt 1.2.3 beschrieben). Weibchen oder Männchen können nach Geschlecht in kleinen Bechern zusammengefasst werden, die in 1,9-Liter-Behältern untergebracht sind.
2. Um das Geschlechterverhältnis zu bestimmen, addieren Sie die Anzahl der F 1-Weibchen oder die Anzahl der F_1-Männchen, die über den Studienzeitraum pro einzelner erwachsener weiblicher Mücke gesammelt wurden. Teilen Sie diese Zahl durch die Gesamtzahl der Puppen, die für dieselbe Mückenlinie gesammelt wurden, die von einem einzigen Weibchen erzeugt wurde.

5. Bestimmung der Lebensfähigkeit der Larven

1. Um die Lebensfähigkeit der Larven zu bestimmen, addieren Sie die Gesamtzahl der über den Studienzeitraum gesammelten Puppen pro einzelner erwachsener weiblicher Mücke.
2. Teilen Sie diese Zahl durch die Gesamtzahl der Larven, die pro einzelner erwachsener weiblicher Mücke für dieselbe Linie gezählt wurden, die in Schritt 3 gezählt wurde.

6. Bestimmung der Entwicklungszeit von der Larve bis zur Puppe

1. Um die Entwicklung von Larve zu Puppe zu bestimmen, verfolgen Sie die Anzahl der Larven und die Anzahl der Puppen pro Linie täglich.
2. Berechnen Sie die Entwicklung von Larven zu Puppen als die durchschnittliche Zeit bis zur Puppenentwicklung nach dem Schlüpfen.

7. Bestimmung des männlichen Beitrags

1. Betäuben Sie mit altersgleichen Männchen adulte jungfräuliche männliche Mücken auf Eis sowie adulte jungfräuliche männliche und weibliche Kontrollmücken.
2. Kreuzen Sie entweder die transgenen oder kontrollierenden männlichen Erwachsenen mit den weiblichen Kontrollerwachsenen, indem Sie 50 transgene oder 50 Kontrollmännchen (altersangepasst) mit 100 Kontrollweibchen in 64-Unzen-Kartons geben, so dass es insgesamt 50 Männchen mit 100 Weibchen (zwei Kontrollweibchen: ein Kontroll- oder transgenes Männchen) gibt. Achten Sie darauf, zu beschriften, welcher Karton transgene Männchen und welcher Karton Kontrollmännchen enthält.
3. Lassen Sie die Paarung 2-3 Tage lang stattfinden. Bieten Sie den Mücken nach dieser Zeit eine Blutmahlzeit an, die den üblichen Aufzuchtpraktiken entspricht.
4. Drei Tage nach der Blutfütterung trennen Sie einzelne vollständig geschwollene Weibchen in konische 50-ml-Röhrchen, die mit vormarkiertem weißem Filterpapier ausgekleidet sind, wie in Schritt 1 (Fruchtfruchtbarkeitstest) beschrieben. Entsorgen Sie die nicht gefütterten Weibchen oder bieten Sie ihnen am nächsten Tag eine weitere Blutmahlzeit an. Füllen Sie alle Röhrchen mit ~5 mL Leitungswasser. Lege ein kleines Stück Rosine auf das Netz, das auf jeder konischen Röhre platziert ist.
5. Lassen Sie die Weibchen 1-2 Tage im Insektarium und lassen Sie sie eiablegen. Überprüfen Sie das Eierpapier 4-5 Tage nach der Blutmahlzeit visuell auf Eier. Geben Sie den Weibchen einen zusätzlichen Tag Zeit zur Eiablage, um die Eiablageraten zu erhöhen.
6. Um das Eipapier zu sammeln, lassen Sie das Wasser ab und betäuben Sie die Weibchen, indem Sie konische Röhren bei 4 °C platzieren, wie zuvor beschrieben. Entsorgen Sie weibliche Mücken, indem Sie 70%iges Ethanol beimischen.
7. Lassen Sie die Blättchen in Tuben im Insektarium mindestens 5 Tage trocknen. Entfernen Sie die Papiere mit einer Pinzette und legen Sie sie zum Schlüpfen in durchsichtige Feinkostbehälter aus Polypropylen mit ~100 ml frisch sterilisiertem deionisiertem Wasser. Fügen Sie 2-3 Tropfen gemahlene Fischfutteraufschlämmung für die Ad-libitum-Fütterung hinzu. Die Oberseiten der Behälter mit Netz oder Organdy auslegen und mit einem Gummiband sichern.
8. Entfernen Sie 2-3 Tage nach dem Schlüpfen die Eierpapiere aus dem Wasser und lassen Sie sie über Nacht trocknen, indem Sie sie in einen neuen Behälter legen, der mit einem Deckel oder Netz abgedeckt ist, und sie wieder in das Insektarium legen.
9. Schlüpfen Sie die Eierpapiere in denselben Behältern wieder aus, indem Sie sie wieder in den Wasserbehälter legen.
10. 3-5 Tage nach dem ersten Schlüpfen sind die Larven (2^{. bis 4. Stadium)} visuell auf einen transgenen Marker zu untersuchen (falls zutreffend). Berechnen Sie den männlichen Beitrag als Anzahl der transgenen Larven F₂ dividiert durch die Anzahl der Larven insgesamt pro Mückenlinie.

8. Bestimmung der Langlebigkeit von Mücken

1. Bringen Sie 50 männliche und 50 weibliche WT oder transgene altersgleiche, nicht mit Blut gefütterte Mücken in ein geeignetes Gehege. Verwenden Sie 64-Unzen-Kartons, wobei die obere Öffnung mit Strumpfhosen ausgekleidet, gedreht und verknotet ist, um den Mücken im Verlauf des Experiments einen einfachen Zugang und eine einfache Handhabung zu ermöglichen (Abbildung 7).
   HINWEIS: Es wird empfohlen, dies zu statistischen Zwecken in dreifacher Ausfertigung zu tun.
2. Stellen Sie eine Zucker- und Wasserquelle bereit. Hier wurden Rosinen und ein mit Wasser gefüllter, mit Gaze ausgekleideter Becher verwendet, der mit zwei Gummibändern gesichert war.
3. Verfolgen Sie die Anzahl der toten männlichen und weiblichen Mücken pro Tag. Berechnen Sie die Langlebigkeit als die durchschnittliche Anzahl der Tage, die vergehen, bevor Mücken in den Käfigen sterben, wobei Mücken, die an nicht informativen Ursachen sterben (Ursachen, die nicht auf die Lebensdauer der Mücken zurückzuführen sind, wie z. B. Zerquetscht oder in Zucker ertrinken) und Mücken, die am Ende der Studie noch am Leben sind, weggelassen werden.
   HINWEIS: Das Überleben ist definiert als die Wahrscheinlichkeit, bis zum Zeitpunkt t am Leben zu sein, oder die Funktion S(t) = Pr(T>t). Das mediane Überleben ist der Zeitpunkt, zu dem die Überlebenswahrscheinlichkeit 0,5 oder T_0,5 = ^S-1 x 0,5 beträgt.

Ergebnisse

In Anlehnung an das obige Protokoll wurde die Fitness von zwei Mückenlinien untersucht: (1) CRISPR/Cas9-vermittelter Knock-out des Ae. aegypti D7L1 (AAEL006424) Speichelproteins und (2) Ae. aegypti-Linien , die autonome CRISPR/Cas9-vermittelte Gene Drives^{exprimieren 9}. Im ersteren Fall wurde eine homozygote D7L1-Knock-out-Linie etabliert, indem der nicht-homologe Endverbindungsweg (NHEJ) ausgenutzt wurde, um die Störung nach der Mikroinjektion von Embryonen mit sgRNAs, die für...

Diskussion

Ae. aegypti-Fitnessstudien werden häufig im Labor durchgeführt, um die Fitnesskosten im Zusammenhang mit transgener Fracht (z. B. Gene-Drive-Elemente) oder Gen-Knock-outs zu bewerten, wie in diesem Manuskript diskutiert; Diese Studien können jedoch für eine Vielzahl von Zwecken durchgeführt werden, die darauf abzielen, die Gesundheit einer Ae. aegypti-Gruppe zu bewerten, wie z. B. Wolbachia-Infizierte ^30,31, Insektizidresi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 oz. translucent plastic souffle cups	WebstaurantStore	301100PC
2 oz. translucent polystyrene souffle cups	WebstaurantStore	760P200N
3 mL plastic pipettors	Cornin	357524
50 mL conical tubes	Any brand
64 oz. white double poly-coated paper food cup	WebstaurantStore	999SOUP64WB	for mosquito enclosement
65 mm lens	Canon	MP-E 65mm f/2.8 1-5x Macro Photo	Canon Macro Photo MP-E 65mm, 7D-65mm-1X; zoom=1, 200, 6.3, ISO=100; for photographing wings or egg papers, although other cameras are likely sufficient
Aedes aegypti mosquitoes	BEI	multiple strains as eggs are available
Artifical membrane feeders	https://lillieglassblowers.com/	Meduim membrane feeder, Custom made, 33mm	Chemglass also offers, but sizes are wrong for us. Ours are about 3 cm?
ATP	MP Biomedical	ICN15026605	Any good quality ATP, 10mM filter sterile aliquots at -20
Autoclave			for sterilizing water for hatching
Canon EOS 7D camera	Canon	3814B004	for photographing wings or egg papers, although other cameras are likely sufficient
defibrinated sheep blood	Colorado Serum Co.	60 ml, every 2 weeks	https://colorado-serum-com.3dcartstores.com/sheep-defibrinated
Dual Gooseneck Microscope Illuminator	Dolan Jenner Fiber-Lite 180	181-1 System
Ethanol
Forceps	Dumont	5SF
Gauze		omnisorb ii	4" non-woven sponges
glass microscope slide	Fisher Scientific	12-544-2
Glass Petri dishes, 100 × 15 mm	VWR	75845-546	for anesthesizing/manipulating mosquitoes on ice
Hogs' gut	Any Deli		we buy in bulk, split, wash and store in small aliquots of ~4X12" at -20 in 50 ml conical
Ice
Ice bucket
Kimwipe	Fisher Scientific	06-666A
Leica GZ4 StereoZoom microscope			for screening transgenic mosquitoes (if applicable)
Paintbrush	AIT synthetic brush	size 10-0	for manipulating larvae/pupae (Amazon)
Panty hose	Walmart	L'eggs Everyday	Women's Nylon Plus Knee Highs Sheer Toe, 16 pairs (plus fits the carton)
Pencils	Any brand
Plastic containers for 2° storage of cartons	Walmart		Sterilite 58 Qt Storage Box Clear Base White Lid Set of 8
Plastic containers for growing larvae	Walmart		Sterilite 28 Qt. Storage Box Plastic, White, Set of 10
Plastic containers for hatching larvae	Walmart		Sterilite 6 Qt. Storage Box Plastic, White
polypropylene clear deli containers	WebstaurantStore	127DM12BULK	12 oz, or 16 oz if needed for bigger (127RD16BULK)
Rubber bands	Office Max	#100736/#909606 /#3777415	12", #64 and #10
Rubber stopper	VWR	217-0515	for mosquito enclosement
Sugar source, such as sugar cubes or raisins
Tetramin flake food	Tetramin	16106
tpsDig	Stony Brook Morphometrics		A free morphometric image-processing software distributed online available at https://www.sbmorphometrics.org/
tpsUtil	Stony Brook Morphometrics		A free morphometric image-processing software distributed online available at https://www.sbmorphometrics.org/
White organza fabric 8” × 8”	FabricWholesale.com	4491676	Joann Casa Collection Organza Fabric by Casa Collection
Whitman Grade 1 Qualitative Filter paper	Whitman	1001-824	for egg papers. The white color makes it easier to see the black eggs.